第九章基因診斷[1]

1、第九章 基因診斷基因診斷是通過檢測基因的存在狀態(tài)或缺陷對疾病作出診斷的方法?；蛟\斷的主要技術(shù)：1、核酸分子雜交2、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）3、基因芯片技術(shù)第一節(jié) 核酸分子雜交技術(shù)核酸雜交（Nucleic acid hybridization）是指具有一定同源性的兩條單鏈核酸在一定條件下，按堿基互補的原則重新配對形成雙鏈的過程。 一、核酸雜交的基本原理DNA的變性和復(fù)性：在一定的條件（如適當?shù)臏囟取⒂袡C溶劑存在等）下，DNA的雙鏈可解開成為單鏈，這一過程稱為DNA的變性（Denaturatioin）。高溫、低鹽和有機溶劑促進DNA變性。Tm值是反映DNA的熱穩(wěn)定性的一個參數(shù)，稱為DNA的熔化溫度

2、，系指一半的雙鏈DNA解離成為單鏈時的溫度。DNA的熱穩(wěn)定性或Tm值直接與其堿基組成特別是GC堿基對含量有關(guān)，GC堿基對含量越高，Tm值也越高。DNA的雜交即復(fù)性（Renaturation）是變性的單鏈DNA在一定的條件下（低于Tm的溫度下）與其互補序列退火形成雙鏈的過程，因此雜交與Tm值相關(guān)。影響雜交的主要因素：溫度：一般在低于Tm約15至度的溫度下雜交速率最快。鹽濃度：鈉離子增加雜交分子的穩(wěn)定性，降低鈉離子濃度強烈地影響Tm值和復(fù)性速率。但當鈉離子濃度超過0.4M時，對復(fù)性速度和Tm值影響不大。甲酰胺：有機溶劑如甲酰胺能減少雙鏈核酸的穩(wěn)定性。每增加1%的甲酰胺，DNA/DNA或DNA/RN

3、A雙鏈的Tm值減少0.72。常用50%甲酰胺硫酸葡聚糖：使雜交速率增加，但有時可能增加雜交本底。二、 核酸探針的選擇和標記核酸探針是指能與待檢測的靶核酸序列互補雜交的某種已知核酸片段，它必須具有高度的特異性，并且?guī)в心撤N適當?shù)臉擞浺员惚粰z測。（一）核酸探針的類型1、克隆的DNA片段，常用cDNA探針。2、RNA探針（Riboprobe）RNA探針的優(yōu)點是特異性高；雜交效率(靈敏度)更高。適合于Northen雜交、原位雜交等。主要缺點是不穩(wěn)定，易被降解，另外其制備較困難。3、寡核苷酸探針 可用化學(xué)方法人工合成，制備較方便，但靈敏度稍差。4、聚合酶鏈反應(yīng)擴增產(chǎn)物 是很好的探針來源，其優(yōu)點是制備和標

4、記相對容易。（二）核酸標記的類型放射性同位素 目前應(yīng)用最廣，優(yōu)點是靈敏度高，特別適用于單拷貝基因或低豐度mRNA檢測，缺點是易造成放射性污染以及半衰期短，使用不便。核酸探針標記常用的同位素有以下幾種：、 P：其放射性強，自顯影時間短，靈敏度較高，缺點是半衰期短（14.3天），放射線散射較嚴重，因此對分辯率有影響。、 35S：放射性較低，半衰期長（87.1天），靈敏度較高；低散射，因此在用光片自顯影時分辯率高，特別適用于核酸序列分析和原位雜交等實驗。、 33P：是一種較理想的同位素，它的放射性較低，靈敏度高，分辯率好，半衰期也較長(25.4天)，適用范圍較廣。但價格偏高。非同位素標記：常用地高辛

5、或生物素系統(tǒng)。優(yōu)點：無放射性污染，較穩(wěn)定；缺點：靈敏度、特異性稍差。（三） 核酸探針的標記1、隨機引物法（Random priming）隨機引物是人工合成的含有各種可能的排列順序的六核苷酸片段的混合物，因此可以與任何核酸片段雜交，并作為聚合酶反應(yīng)的引物。標記酶：大腸桿菌DNA聚合酶的大片段klenow片段。特點：所得探針的放射性比活較高，適用于大多數(shù)雜交。2、缺刻平移法(Nick translation0標記酶：大腸桿菌DNase（極微量）和DNA聚合酶。用缺刻平移法制備的探針較短，較適合于原位雜交。3、RNA探針的制備和標記RNA探針可用RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄法制備。該方法的合成效率高，所得產(chǎn)

6、物大小均一，有較高的比活，特異適合于Northern雜交和原位雜交。4、聚合酶鏈反應(yīng)標記DNA探針利用Taq DNA聚合酶和標記的dNTP,sk 以少量的起始模板合成高比活的c雙鏈或單鏈DNA探針。5、寡核苷酸探針的標記5-端標記：T4多核苷酸激酶標記法，一般用于制備DNA序列分析時用的5-標記的寡苷酸引物。3-端標記：末端轉(zhuǎn)移酶法，32P-dNTP或ddNTP。6、非同位素核酸探針標記：地高辛或生物素標記的核酸探針的制備方法和同位素探針相似。但是不能用多核苷酸激酶標記法直接對5-端進行非同位素標記。三、常用核酸雜交技術(shù)濾膜雜交固相雜交 核酸雜交 原位雜交液相雜交濾膜雜交是指先將待檢測的核酸序

7、列結(jié)合到適當?shù)墓滔嘀С治锶缒猃埬ど?，然后與存在于溶液中的已標記探針進行雜交的過程。濾膜雜交的基本過程為：1、核酸探針的制備和標記；2、核酸片段的凝膠電泳分離；3、將凝膠中的核酸片段通過印跡（blot）轉(zhuǎn)移到某種固相支持物上；4、用標記的探針與被固定的靶核酸序列雜交（通過還包括預(yù)雜交）；5、洗膜（除去未雜交的游離探針等）；6、檢測帶標記的雜交分子（放射自顯影或酶聯(lián)反應(yīng)）。（一） 斑點狹縫印跡（Dot/slot blot）雜交：DNA或RNA樣品經(jīng)變性后直接點樣于尼龍膜上，然后進行雜交和檢測。其優(yōu)點是簡單、迅速，可同時做多個樣品；缺點是特異性不好，有一定比例的假陽性，此外，靶核酸的分子大小難于判斷

8、。（二） Southern印跡：指將經(jīng)過電泳分離的DNA片斷轉(zhuǎn)移到一定的固相支持物的過程。Southern印跡雜交的步驟如下：1、用限制性內(nèi)切酶消化大分子DNA;2、用瓊脂糖凝膠電泳對DNAa片段按分子量大小分離；3、將DNA片段在瓊脂糖凝膠電泳中變性成單鏈后，再轉(zhuǎn)移到適當?shù)墓滔嘀С治锷喜⑴c之結(jié)合；、 探針與膜上的DNA雜交；、 檢測。Southern印跡雜交主要用于基因組結(jié)構(gòu)分析、基因組DNA的定性和定量分析以及利用限制性片段長度多態(tài)性進行基因突變分析等。（三） Northern印跡：是指RNA經(jīng)變性凝膠電泳后，將其轉(zhuǎn)移到固相支持物上，以便用雜交反應(yīng)檢測特定的mRNA分子的含量與大小。是基因

9、表達研究分析的標準方法。Nothern印跡的基本過程包括：1、RNA的提?。?、RNA變性電泳；3、RNA轉(zhuǎn)移和固定；4、雜交；5、檢測。除RNA的提取和變性膠電泳與DNA不同外，其余基本與Southern印跡相同，關(guān)鍵是減少實驗中的RNA酶污染。（四） 核酸雜交在基因診斷中的應(yīng)用通過核酸雜交技術(shù)，可以利用帶有某種標記的已知核酸片段作為探針，去檢測未知核酸序列。因此，核酸雜交可用于基因鑒定和基因突變分析等領(lǐng)域。1、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析 多態(tài)性（polymorphism）指基因組中特定基因座位（DNA序列）存在兩種或兩種以上狀態(tài)（等位基因），并且其中任何一個等位基因在人群中的頻率

10、不低于1%。限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）是由于DNA變異（產(chǎn)生新的酶切位點或消除原有的酶切位點）導(dǎo)致在限制性核酸內(nèi)切酶酶切時產(chǎn)生不同長度的片段?？山柚鷖outhern blotting或PCR 的方法進行檢測RFLP分析與遺傳病基因診斷。人類染色體VNTR序列的RFLP分析圖譜：DNA fingerprinting。2、等位基因特異性寡核苷酸（ASO）探針雜交寡核苷酸中的堿基錯配會大大影響雜交分子的穩(wěn)定性，因此可用人工合成的針對正常和突變等位基因的特異性寡核苷酸探針進行雜交，檢測點突變。3、基因表達分析 常用Northern blotting或原位雜交分析。第二節(jié) 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技

11、術(shù)一、PCR的基本原理（一）PCR的基本過程PCR是一種體外擴增特異DNA片段的技術(shù)。它包括下列三個基本步驟：1、變性（Denaturation）：待擴增的DNA模板加熱變性成單鏈；2、退火（Annealing）：降低溫度，使單鏈靶序列與寡核苷酸引物退火；3、延伸（Extension）：在適當條件下，利用DNA聚合酶使引物延伸，產(chǎn)生新的雙鏈。上述變性、退火、延伸步驟的重復(fù)循環(huán)，導(dǎo)致特異的靶序列的指數(shù)擴增。PCR產(chǎn)物是介于引物的5端之間的雙鏈DNA片段。（二）PCR體系中的主要成份1、Taq DNA 聚合酶 是一種耐熱的DNA聚合酶，具有5-3DNA聚合酶活性，一般有5-3外切酶活性，有或無3-

12、5外切酶活性（校對活性），無校對活性的酶在PCR中錯摻率較高。PCR中Taq 酶的用量一般為0.5-2.5U，過多易造成非特異性擴增，過少可能靈敏度不夠。2、寡核苷酸引物 是決定PCR擴增特異性的關(guān)鍵。設(shè)計PCR引物時的幾條原則： 引物長度一般15-30 堿基，過短則特異性低； 避免內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)； G/C和A/T堿基均勻分布，G/C含量在45%-55% 之間； 兩個引物（特別是3端）間不能發(fā)生互補，以免形成引物引物二聚體； 引物的3-端堿基一般應(yīng)與模板嚴格配對，并且3端為G、C或T時引發(fā)效率較高； 引物的5-端可添加與模板無關(guān)的序列（如限制性內(nèi)切酶的識別位點、ATG起始密碼子或啟動子序列等）P

13、CR中所用引物濃度一般在0.1-0.5uM太高的引物濃度易造成非特異性擴增，太低會降低合成效率。3、MgCl2 Mg2+濃度除影響Taq酶活性外，還影響雙鏈DNA的Tm值，因而影響PCR的特異性和擴增效率。PCR中的最適MgCl2濃度一般為1.5-2.5mM(注意游離Mg2+濃度還與能結(jié)合Mg2+的化合物如dNTP、EDTA 等的濃度有關(guān)。4、脫氧核苷三磷酸（dNTP）一般采用均衡的dNTP濃度，4 種dNTP各為 200umol/L,dNTP可減少游離Mg2+，因此影響聚合酶活性和引物退火。5、模板 單、雙鏈DNA，以及RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA。PCR樣品可以是粗制品，但不應(yīng)含有核酸酶和

14、蛋白酶及其它干擾Taq酶活性的抑制劑 。引物/模板的比率影響PCR的特異性。(三)PCR循環(huán)參數(shù)1、預(yù)變性（Initial denaturation） 模板DNA完全變性對PCR能否成功至關(guān)重要，一般95加熱3-5分鐘。2、引物退火（Primer annealing） 退火溫度一般需要憑實驗（經(jīng)驗）決定。 退火溫度對PCR的特異性有較大影響。3、引物延伸 引物延伸一般在72進行（Taq酶最適溫度）。 延伸時間隨擴增片段長短而定。4、循環(huán)中的變性步驟 循環(huán)中一般95，30秒足以使各種靶DNA序列完全變性： 變性時間過長損害酶活性，過短靶序列變性不徹底，易造成擴增失敗。5、循環(huán)數(shù) 大多數(shù)PCR含2

15、5-35循環(huán)，過多易產(chǎn)生非特異擴增。6、最后延伸 在最后一個循環(huán)后，反應(yīng)在72維持5-15分鐘使引物延伸完全，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。（四）PCR中的污染和假陽性 PCR中污染主要來自 1、樣品間交叉污染； 2、先前PCR產(chǎn)物遺留（carry-over）二、幾種常用特殊PCR技術(shù)（一）逆轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse transcriptionPCR,RT-PCR） RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后可作為PCR的模板.逆轉(zhuǎn)錄PCR（RTPCR）常用于基因表達研究（定量PCR）和逆病毒檢測 設(shè)計RTPCR引物時，應(yīng)使引物分別位于不同的外顯子中，以便區(qū)別cDNA和gDNA擴增產(chǎn)物。（二）多重PCR（Multiple

16、PCR） 在同一PCR反應(yīng)體系中用多對引物（覆蓋不同長度的靶序列）同時擴增。 例如用多重PCR進行DNA缺失篩選(三) 套式PCR（nested PCR） 用第一次PCR擴增區(qū)域內(nèi)部的第二對（套式）引物對第一次PCR產(chǎn)物再次擴增,可以增加特異性和靈敏度。(四)非對稱PCR（asymmetric PCR） 在PCR反應(yīng)體系中，限制引物之一的濃度（50100:1）進行擴增，可得到單鏈PCR產(chǎn)物,可用于制備單鏈測序模板或單鏈DNA雜交探針。 三、PCR與突變檢測 通過PCR擴增片段的多態(tài)性分析有助于檢測各種突變。 PCR擴增產(chǎn)物的多態(tài)性可分為三種類型： 1、限制性片段長度多態(tài)性（Restrictio

17、n fragment length polymorphism-RFLP）; 2、序列多態(tài)性(Sequence polymorphism); 3、長度多態(tài)性(Length polymorphism) （一）PCR-RFLP分析 設(shè)計適當?shù)臄U增引物，使擴增片段包括某一或數(shù)個多態(tài)性的限制性內(nèi)切酶識別序列，在PCR擴增后用該限制酶切割PCR產(chǎn)物，根據(jù)電泳后酶切片段長度變化，即可作出診斷，該方法主要用于檢測各種已知突變。 （二）PCR結(jié)合ASO探針雜交分析 ASO（Allele specific oligonucleotide）探針：等位基因特異性寡核苷酸探針，指針對各種正常和突變靶序列設(shè)計的特異性寡核

18、苷酸探針。 1、PCR產(chǎn)物變性后斑點印跡至膜上，用一系列AS0探針雜交，嚴格控制雜交和洗膜條件、確保正常ASO探針只與正常靶序列條交，而突變ASO只與含相應(yīng)突變堿基的靶序列雜交。 2、另一種方法是將ASO探針固定在膜上，然后與生物素標記的PCR產(chǎn)物雜交-反向斑點雜交（reverse dotblot），這樣一次雜交可完成多個探針檢測。上述方法適用于基因組中某些固定位點上的已知序列差異的檢測，如癌細胞中的ras突變，HLA typing等。（三）等位基因特異性擴增（A11eles specific amplification，ASA）-又稱擴增阻礙突變系統(tǒng)(Amplification refrac

19、tory mutation system，ARMS)利用PCR引物的3端末位堿基必須與其模板DNA互補才能有效擴增的原理，設(shè)計等位基因特異性 PCR擴增引物，在嚴格的條件下，只有在引物3堿基與模板配對時才能出現(xiàn)PCR擴增帶，從而檢測出突變，該法省去了探針雜交操作。（四）PCR-SSCP分析單鏈DNA在中性條件下，由于堿基配對等分子內(nèi)相互作用而具有復(fù)雜的折疊構(gòu)象，在聚丙烯酰胺凝膠電泳中，其遷移率除與長度有關(guān)外，還與其構(gòu)象有關(guān)。DNA的突變造成DNA片段中堿基序列不同，變性為單鏈后在中性聚丙烯酰胺凝膠中的構(gòu)象不同單鏈構(gòu)象多態(tài)性（Single strand conformation polymorp

20、hism，SSCP），利用遷移率的差別可使各種序列不同的單鏈得以分離。PCR一SSCP的步驟：PCR擴增產(chǎn)物熱變性成單鏈非變性PAGE顯示（放射自顯影或銀染等）PCRSSCP是檢測點突變的簡便靈敏方法，已用于多種遺傳病、腫瘤中原癌基因和抑癌基因的突變分析，對200bp片段其靈敏度較好，靶序列增長時其靈敏度下降（一般175-345nt）。（五）擴增片段長度多態(tài)性（Amp-FLP）VNTR、STR等重復(fù)序列，因重復(fù)單位數(shù)目的不同而呈現(xiàn)高度多態(tài)。因此利用重復(fù)序列兩側(cè)的特異性引物進行PCR擴增，所得擴增片段具有高度多態(tài)性，這些不同長度的等位片段可用PAGE分離。（六）PCR直接測序DNA序列分析是檢測

21、基因突變最直接最可信的方法，它不僅可確定突變的部位，還可確定突變的性質(zhì)。PCR直接測序是指對PCR產(chǎn)物直接進行序列分析，而不是先將DNA待測片段克隆于測序載體上，這可大大的簡化操作步驟。PCR產(chǎn)物測序常采用循環(huán)測序法（cycle sequencing）：在PCR反應(yīng)體系中同時將ddNTP加入，并利用同位素或熒光素標記的引物引導(dǎo)擴增，使模板的擴增與測序同時進行。應(yīng)用PCR測序有以下優(yōu)點：模板需要量??；方法簡便，易自動化；測序效率高。四、PCR在基因診斷中的應(yīng)用（一）遺傳病的基因診斷目前已有近百種遺傳病可用PCR技術(shù)進行診斷和產(chǎn)前診斷。用PCR對遺傳病進行診斷的前提是對致病基因的結(jié)構(gòu)必須部分或全部

22、清楚。.如利用PCR-RFLP或Amp-FLP對遺傳病家系進行連鎖分析，進而作出基因診斷。（二）傳染病診斷PCR已應(yīng)用于多種病原體的特異性檢測和鑒定1、病毒：如HBV，HCV，HIV，HPV等。2、致病菌：如淋球菌、結(jié)核桿菌、軍團菌、幽門螺桿菌、肺炎支原體等；（三）腫瘤基因診斷1、原癌基因和抑癌基因突變，如ras,p53；癌基因擴增和表達分析。2、利用微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，直接診斷腫瘤，如膀胱癌等；3、分析白血病（如CML）中異常染色體易位，檢測微小殘留病變（Minimal residual disease，MDR）4、腫瘤多藥耐藥性（multi-drug resistance,MDR）檢測5、端粒

23、酶活性檢測第三節(jié) 基因芯片技術(shù)基因芯片（Gene chip/DNA chip）又稱為DNA微矩陣（DNA Microarray），是包被在固相載體上的高密度DNA的微陣列。一、基因芯片的類型：1、 寡核苷酸芯片：采用固相原位合成技術(shù)制備的，或用傳統(tǒng)方法合成后再固定于芯片上的寡核苷酸探針陣列（Genechip, Affymatrix,Inc）。2、 DNA微矩陣（DNA Microarray）：將DNA探針通過自動化點樣技術(shù)固定于特定的固相支持物如玻璃表面，然后再與靶序列雜交。二、基因芯片技術(shù)的原理DNA芯片技術(shù)是將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段有規(guī)律地排列固定于支持物（如膜、硅片或玻璃片）上

24、，然后通過類似核酸雜交的的方法與待測的標記樣品按堿基配對原則進行雜交，再通過檢測系統(tǒng)對其進行掃描，并用相應(yīng)軟件對信號進行比較和檢測，得到所需的生物信息。其特點是可進行基因的高通量、大規(guī)模、平行化、集約化的信息處理和功能研究。用DNA微矩陣進行基因表達分析的步驟1、分離（待比較的）不同組織或細胞的mRNA,逆轉(zhuǎn)錄法制備帶不同熒光標記的cDNA探針；2、混合探針，并與microarray雜交，洗滌除去未結(jié)合探針。3、 用特有波長的激光掃描芯片，并用共聚焦顯微鏡檢測各探針的熒光，各element的相對熒光強度反映特異mRNA的相對豐度。三、基因芯片技術(shù)的應(yīng)用1、 疾病診斷（遺傳病、腫瘤和病原體診斷）

25、2、 新藥篩選和毒理學(xué)研究3、 突變/多態(tài)性檢測單核苷酸的多態(tài)性( single nucleotide polymorphism, SNP)。4、 基因表達分析5、 發(fā)現(xiàn)新基因四、表達譜基因芯片的特點及其應(yīng)用利用基因芯片可進行高通量基因表達平行分析，是基因功能研究的重要手段。對來源于不同個體（正常人與患者）、不同組織、不同細胞周期、不同發(fā)育和分化階段、不同病變、不同刺激（包括不同誘導(dǎo)、不同治療階段）下的細胞內(nèi)的mRNA或逆轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的cDNA與表達譜基因芯片進行雜交，可以對這些基因表達的個體特異性、組織特異性、發(fā)育階段特異性、分化階段特異性、病變特異性、刺激特異性進行綜合的分析和判斷，迅速將某

26、個或幾個基因與疾病聯(lián)系起來，極大地加快這些基因功能的確立，同時進一步研究基因與基因間相互作用的關(guān)系。采用表達譜基因芯片研究基因表達與傳統(tǒng)的Northern Blot相比有許多重要的優(yōu)點：1、檢測系統(tǒng)的微型化，對樣品等需要量非常小 2、同時研究上萬個基因的表達變化，研究效率明顯提高 3、能更多地揭示基因之間表達變化的相互關(guān)系，從而研究基因與基因之間內(nèi)在的作用關(guān)系 4、檢測基因表達變化的靈敏度高，可檢測豐度相差幾個數(shù)量級的表達情況 5、節(jié)約費用和時間 Further Readings1. Ekins R. and Chu F.W. Microarrays: their origins and applications. Trends in Biotechnolology, 1999, 17