非編碼RNA對結(jié)腸癌細胞重離子輻射敏感性的調(diào)節(jié)作用

1、非編碼RNA對結(jié)腸癌細胞重離子輻射敏感性的調(diào)節(jié)作用放療是利用放射線治療腫瘤的一種局部腫瘤治療方法 , 目前, 大約有 50%-70% 的腫瘤患者在治療過程中需要用到放療。放療作為腫瘤的三大治療手段 ( 手術, 放療, 化療)之一,因其適用范圍廣 ,治療過程相對簡便 , 療效確切 , 方法可靠 , 毒副 作用相對較小 ,既可單獨應用 ,也可以與手術、化療聯(lián)合應用。因此, 放療在腫瘤治療中的作用和地位日益突出。結(jié)直腸癌是世界范圍內(nèi)最 常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一 ,其惡性程度高 , 預后差。放療作為結(jié)直腸癌臨床治療的重要手段 , 在控制腫瘤生長 , 減小腫瘤體積等 方面具有明顯的優(yōu)勢。與常規(guī)光子放療射線

2、相比 , 高 LET(Linear Eenergy Transfer) 的重離子射線具有其獨特的布拉格峰型 (Bragg Peak) 劑量分布 , 即在 物質(zhì)中的劑量損失集中于射程末端 , 這種物理學特性使重離子射線在腫瘤放療應 用中具有明顯的優(yōu)勢 , 可有效地將高能量重離子射線集中到腫瘤靶區(qū) , 不但能提 高腫瘤治療效果 , 并能減少放射線對正常組織的傷害。然而,影響放療療效的因素很多 ,除了放射線品質(zhì) (放射源)外, 還取決于腫瘤 細胞的放射敏感性 , 一些腫瘤細胞固有或獲得性的輻射抗性大大降低了放射線對 其的殺傷作用 ,從而限制了放療的應用。 因此,通過研究腫瘤細胞對輻射的應答機 制及輻

3、射抗性產(chǎn)生的分子機制對于提高放療的局部控制率和生存率 ; 降低正常組 織毒副作用以及增加新的放療適應癥都具有重要的意義。非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA能夠多層次,多途徑的調(diào)節(jié)基因表達,從 而廣泛參與了包括細胞增殖 , 分化, 凋亡 , 自噬等細胞生命過程的調(diào)節(jié)。輻射能夠 引起細胞內(nèi)很多ncRNAS的表達變化,進而通過ncRNAs調(diào)節(jié)網(wǎng)絡廣泛參與細胞對 輻射的應答反應。文獻報道證實,ncRNAs在調(diào)節(jié)腫瘤細胞對電離輻射的反應中發(fā)揮了重要的 調(diào)節(jié)作用。然而其確切的分子機制仍有待研究。在本研究中,我們使用microRNA(miRNA芯片研究了重離子射線(碳離子)對 人結(jié)腸癌細

4、胞系HCT116細胞miRNAs表達譜的影響,結(jié)果表明，1Gy和2Gy的重離 子照射HCT116細胞后,分別有22個和19個miRNAs的表達發(fā)生了變化。其中, 重離子輻照后 ,miR-6778-5p 的表達量明顯下調(diào)。我們通過real-time PCF在三株不同的結(jié)腸癌細胞系中(HCT116,HT29,SW620)對這一結(jié)果進行了驗證。細胞克隆形成實驗 ,Cell Counting Kit-8(CCK-8) 細胞 活性檢測以及 EdU(5-ethynyl-2 '-deoxyuridine,5- 乙炔基-2 '脫氧尿嘧啶核苷 ) 染色等實驗結(jié)果表明 ,miR-6778-5p 能

5、夠促進結(jié)腸癌細胞的增殖。生物信息學和雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測結(jié)果顯示 ,miR-6778-5p 能夠靶 向調(diào)節(jié)YWHAE(14-3-3e的表達?；蚣患治?Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)結(jié)果提示，丫W(wǎng)HA表達陽性與p53信號通路子集的基因特征相關。我們又利用cBioPortal數(shù)據(jù)庫分析在結(jié)腸癌臨床樣本中，丫W(wǎng)HA與p53基因 的表達相關性,數(shù)據(jù)顯示,在mRNAK平，丫W(wǎng)HA與p53的表達呈正相關。通過免疫 印記雜交分析了重離子照射后 p53凋亡相關信號通路的變化，也進一步確認 YWHA能夠通過p53介導的凋亡相關信號通路參與結(jié)腸癌細胞增殖調(diào)節(jié)。此外

6、, 為了探究引起 miR-6778-5p 下調(diào)的可能的分子機制 , 我們通過 CircNet 數(shù)據(jù)庫預測了可能與 miR-6778-5p 具有相互作用的 circRNAs,real-time PCR 檢 測circRNAs的表達變化，我們發(fā)現(xiàn)在重離子照射后，circRNA CBL.11在結(jié)腸癌細 胞中上調(diào)。AGO免疫沉淀和生物素標記的 RNA pull down實驗證實了 circRNACBL.11與miR-6778-5p的相互結(jié)合作用,表明circRNA CBL.11能夠通過 ceRNA(compet ing en doge nous RNAs,內(nèi)源競爭 RNA 機希 9, “吸附” miR-6778-5p并抑制其活性，從而降低了 miR-6778-5p對YWHA的抑制作用，進而上調(diào)YWHAE 的表達 , 抑制結(jié)腸癌細胞的增殖。CCK-8細胞活性分析,EdU染色等功能性實驗結(jié)果也證實了上述假設。綜上所 述, 我們的研究結(jié)果表明 , 重離子