人源漢坦病毒疫苗候選株的分離鑒定及其某些特性研究

1、    人源漢坦病毒疫苗候選株的分離鑒定及其某些特性研究        【摘要】目的對人源漢坦病毒疫苗候選株作分離鑒定及特性的研究。方法用Vero細胞分離病毒，用免疫熒光法作病毒效價測定。用RT-PCR及部分核苷酸序列分析等檢定。結(jié)果用Vero細胞從安徽省鳳臺縣腎綜合征出血熱病人血清中分離一株漢坦病毒(HV)，其抗原特性及PCR分型結(jié)果證明為漢灘病毒(型病毒)；其免疫血清對來源于不同地區(qū)的HV均有中和活性。M片段部分序列分析結(jié)果表明，該毒株與76-118等毒株核苷酸序列有較大

2、差異，但氨基酸序列同源性甚高。病毒株對Vero細胞敏感，繁殖高峰一般在9天以后，可多次收獲病毒。結(jié)論上述特性表明，分離病毒株適合用作研制滅活疫苗后備株。【主題詞】出血熱，病毒性； 漢坦病毒； 序列分析，DNA； Vero細胞 Isolation,identification and certain characteristics of a Hantaan virus proposed as candidate virus for killed vaccineXIE Yanxiang, HANG Changshou, WANG Hua, et al.（Institute of Virology,

3、 Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052, China）【Abstract】ObjectiveIsolation and identification of a Hantaan virus from HFRS patient's serum for killed vaccine development.MethodsThis virus temporally called FT14 detected by IFAT, RT-PCR. Partial sequence of M segment was determin

4、ed by Sanger's dideoxy chain termination method.ResultsThe antigenicity and PCR amplification of the newly isolated virus FT14 proved that it belongs to virus of HTN type. Antiserum to the virus can neutralized many strains of Hantaan virus from different areas. The partial sequence of M segment

5、 of FT14, as compared with other HTN strains, showed great differences among nucleotied sequences, while the deduced amino acid sequence is comparatively conservative. The titer of the virus reached its peak at 9 days post inoculation in vitro, then the peak titer could last for a long time. Conclus

6、ionThis virus strain FT14 would be a good candidate virus for killed vaccine development.【Key words】Hemorrhagic fever,viral; Hantaan virus; DNA sequencing; Vero cells腎綜合征出血熱(HFRS)是我國重點防治的急性傳染病。安徽省是我國HFRS的老疫區(qū)和重疫區(qū)。因此，對流行于該地區(qū)的漢坦病毒(HV)進行分離和系統(tǒng)的鑒定，能為HFRS的防治提供科學依據(jù)。特別是流行株的血清型和基因型的確定，是選擇使用疫苗的型別和確定防治重點及對策的前提，

7、也為研究我國漢坦病毒的遺傳性及進化提供一定的依據(jù)。同時，對毒株的免疫原性、抗原性及其在Vero細胞中增殖特性進行研究，為傳代細胞疫苗候選株的選擇提供基礎材料。1材料和方法1.1標本來源1994年11月30日安徽省鳳臺縣人民醫(yī)院臨床急性期病人姬××血清。1.2細胞及傳代方法Vero細胞來源于ATCC，其131代由中國藥品生物制品檢定所提供。實驗時用含10%小牛滅活血清的MEM培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，使用代數(shù)在138146代之間。1.3病毒分離參照文獻1。1.4病毒株及免疫血清所用型毒株為76-118，H5，C4，84FLi,A9,Chen,LuYao,LuXu；型毒株為UR，R22，

8、L99。病毒感染細胞后710d收獲，上清凍存作為毒種，并供中和試驗(PRNT)用。細胞凍化后經(jīng)超聲波處理，徹底破碎后補1 ml PBS，離心取上清作為ELISA抗原。上述毒株免疫家兔制備兔抗HV免疫血清。型呼腸孤病毒免疫血清為本室保存。1.5病毒株鑒定1.5.1間接免疫熒光法(IFA)參照文獻2。采自安徽省鳳臺縣的急性期病人血清熒光效價為4080；恢復期血清效價>640。HV單克隆抗體(McAbs)分別由本所陳伯權(quán)、梁米芳、馬章亮等研制，部分從日本及美國引進?？固堑鞍讍慰褂校篖V28B，LV48C，LV48A，3 G1，8 G2，8 G3，16 D2，3 D5，8 B6，16 F7；抗核

9、蛋白單抗有：LV13F3，C1223，L133，A5，A19，C321，C1242，LV37，LV1A。1.5.2ELISA法參照文獻3。檢測抗原用雙抗體夾心法，檢測血清抗體用阻斷法。1.5.3空斑試驗及空斑減少中和實驗參照文獻4。微量細胞病變中和試驗(MCPENT)參照文獻4，5。1.5.4病毒RNA提取方法病毒總RNA的提取使用Trizol試劑盒。步驟如下：將病毒接種于大方瓶內(nèi)新長成單層Vero細胞。7 d后棄盡培養(yǎng)上清。用PBS沖洗細胞單層，棄盡PBS。然后加入1 ml裂解液覆蓋細胞單層，吹下細胞后，將裂解液轉(zhuǎn)移到1.5 ml的塑料離心管中，室溫放置5 min。加入200 l氯仿，充分混

10、勻后室溫放置3 min。4，15 000 r/min離心15 min。取水相加等量異丙醇沉淀10 min。離心后沉淀用80%乙醇洗滌。然后于室溫下干燥沉淀。最后加入50 l DEPC處理的去離子水，溶解所提取的RNA。1.5.5逆轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)及PCR片段回收方法逆轉(zhuǎn)錄及PCR上游引物序列為HTV-MFO：AAAAGTAGGTGITAYATCYTIACAATG TGG(位置：19101939)；PCR下游引物序列為HTVMRO：GTACAICCTGTRCC IACCCC(位置23732354)。Taq酶為PERKIN ELMER公司的Ampli Taq GoldTM Taq酶。逆

11、轉(zhuǎn)錄酶為GibcoBRL公司的Super ScriptTM 逆轉(zhuǎn)錄酶。PCR片段回收使用Promega公司的Wizard?R PCR Preps DNA Purification System。1.5.6核苷酸序列的測定及分析方法使用ABI 373 DNA序列自動測序儀進行序列測定。測序試劑盒為PERKIN ELMER公司的ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit with Ampli Taq DNA Polymerase,測序引物為：HFMGAATCCATACTGTGGGCTG CAAGTGC(位置1958198

12、4)。本研究所用引物位置均是對應于76118株M片段而言。1.6病毒繁殖動態(tài)取長成單層的大方瓶Vero細胞，以10-2接種病毒后，每天收獲1瓶，刮取細胞作熒光檢查；上清凍存檢測病毒滴度；細胞凍化后檢測ELISA抗原滴度。1.7實驗動物購自中國預防醫(yī)學科學院流行病學微生物學研究所。2結(jié)果2.1毒株的免疫熒光檢測2.1.1分離過程中的IFA檢測29份病人血清分別接種Vero細胞，23 d后檢測，結(jié)果為25份陰性，4株可疑。二次傳代后20 d，其中之一達到+；再傳時達到+。暫命名為FT14(鳳臺14)，凍存作原始毒種。2.1.2HFRS病人雙份血清的IFA檢測用3例來自于鳳臺人民醫(yī)院的HFRS病人雙

13、份血清同時檢測FT14，結(jié)果見表1。3例病人恢復期血清抗體水平均有4倍以上增高，并且與HV76-118株及84 FLi株對照檢查的結(jié)果相似。該毒株與呼腸孤病毒免疫血清無任何反應。表1FT14抗原檢測HFRS病人雙份血清結(jié)果Tab.1Reactivity of FT14 with paired sera from HFRS patients血清號Serum No.發(fā)病后天數(shù)Days post onsetof the diseaseIFA抗體滴度*IFA(Antibody titer)*FT1476-11884 FLi1A*3408040C*191 2801 2806402A4808040C201

14、 2801 2801 2803A3404040C186401 280640     *A：急性期(Acute phase)?*C：恢復期(Convalescent phase)?*以血清稀釋度的倒數(shù)表示(Reversion of the serum dilution titer) 2.1.3FT14毒株對McAbs的IFA反應取第4代毒株感染Vero細胞，7 d后制備細胞抗原片，與HV McAbs做免疫熒光反應。FT14對10個抗糖蛋白單抗中7個組特異性和亞組特異性單抗以及型抗核蛋白單抗全部為陽性反應；對型抗核蛋白單抗全為陰性反應。此結(jié)果與用于對照的9株

15、HV型病毒株反應結(jié)果相同，而與4株型毒株的抗原性存在很大的差異。2.2用ELISA法比較FT14與各毒株之間的抗原關(guān)系FT14與型毒株的抗體反應滴度(1320)及FT14免疫血清與型病毒株反應的抗體滴度(1640)都明顯高于與型病毒株或抗體反應的滴度。2.3交叉中和實驗用FT14抗原及其免疫血清與其他毒株的免疫血清及抗原進行固定病毒稀釋血清的交叉中和實驗，結(jié)果見表2。由表2可見，MCPENT法在Vero細胞上的效價與PRNT法測出的結(jié)果相近。FT14株病毒對型HV的血清效價比對型HV高4倍以上，提示FT14為型病毒。表2FT14抗原及其免疫血清與其他毒株交叉中和試驗Tab.2Cross pla

16、que-reduction neutralization test between FT14 and other virus strains病毒株Strain免疫血清中和滴度PRNT titers of immune sera微量細胞病變中和試驗MCPENTL99R22Chen76-118FT14FT14C41010160160160160Chen201032032032032084 FLi1010160320320320FT142010160160640320H52010160160160160H3201016016016016076-1182010160640320320A94020808

17、08080L993208020202040R2216016010101020     2.4病毒傳代，增殖動態(tài)及生長曲線2.4.1傳代情況(FT14早代)見表3。表3FT14在Vero細胞中的傳代情況Tab.3Passages of FT14 on Vero cells傳代Passage感染后天數(shù)Days postinfection抗原檢測Detection of antigenIFAELISAPFU/ml123±ND220+115×10237+1645×10547+11286×10557+12565×1

18、06     2.4.2FT14病毒株第五代增殖動態(tài)及繁殖曲線FT14感染Vero細胞后，3 d可查到抗原，9 d后達到高峰，持續(xù)24 d無下降趨勢(見表4，1)。 表4FT14在Vero細胞上的增殖動態(tài)Tab.4The multiplication of FT14 on Vero cells感染后天數(shù)Days postinfection抗原檢測Detection of antigenIFAELISAPFU/ml3±ND2×1006+1325×1059+11286×10612+12567×10615+&g

19、t;12566×10618+>12567×10621+>12561×10724+>12561×107     1FT14在Vero細胞上的繁殖曲線Fig.1Growth curve of virus FT14 on Vero cells2.5RT-PCR對FT14擴增及鑒定用型引物從29份病人血清中擴增出陽性帶8份，其中包括分離出FT14毒株的血清。29份病人血清與型引物均不反應。2.6FT14部分M片段核酸序列測定測得了對應于M基因組片段2 0032 302位的300堿基對的核苷酸序列(見2)，

20、并就核苷酸序列及推導的氨基酸序列與一些已知序列進行了比較(見表5)，結(jié)果FT14與HTN型病毒株核苷酸序列的同源性為81.0%82.3%；推導的氨基酸序列同源性為96%。     2FT14病毒M片段部分核苷酸序列Fig.2Partial nucleotide sequence of M segment of FT14 virus表5FT14M片段部分核苷酸序列及推導的氨基酸序列與已知病毒相應片段序列的同源性(%)Tab.5Comparison of partial nucleotide and amino-acid sequences of M seg

21、ment among FT14 and other known virusesFT1476-118ChenR22FT1482.381.069.076-11896.086.770.0Chen96.097.068.7R2276.879.878.8     注：空白對角線上為核苷酸序列，下為氨基酸序列Note:The upper part of diagonal represents nucleotide sequence, the lower part the amino acid sequence 3討論用Vero細胞作為疫苗生長的基質(zhì)，是當前HFRS疫苗發(fā)展的方向6。我國以Vero細胞為基質(zhì)的HFRS疫苗尚處于實驗室開發(fā)階段，迫切需要在Vero細胞上繁殖力高的適應病毒株。FT14因其用Vero細胞分離、適應性好、滴度高而具備上述條件。和鼠源病毒株相比，盡管核苷酸序列有較大差異，但氨基酸序列差別不大，這表明了在HV進化過程中其結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸序列保持相對穩(wěn)定的特點，也決定了FT14具有相對穩(wěn)定的抗原性。而且其來源及傳代歷史清楚，有可能適合作為Vero傳代細胞型疫苗候選株。