四節(jié)基因工程ppt課件

1、 第四節(jié)第四節(jié) 基因工程基因工程 Gene Engineering 基因工程定義基因工程定義 基因工程：指經(jīng)過人工方法將目的基因與載體DNA分子銜接起來(lái)，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞，從而使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀的一種嶄新的育種措施.第一節(jié)第一節(jié) 基因工程概述基因工程概述一、基因工程的開展歷史一、基因工程的開展歷史一實(shí)際上的三大發(fā)現(xiàn)：一實(shí)際上的三大發(fā)現(xiàn)：二技術(shù)上的三大發(fā)明：二技術(shù)上的三大發(fā)明：三基因工程的誕生三基因工程的誕生四基因工程的幾個(gè)方面四基因工程的幾個(gè)方面 3、60年代，年代，Nirenbery等科學(xué)家確定了遺等科學(xué)家確定了遺傳信息的傳送方式：傳信息的傳送方式：DNARNA蛋白蛋白質(zhì)的中心法那么

2、。質(zhì)的中心法那么。一實(shí)際上的三大發(fā)現(xiàn)一實(shí)際上的三大發(fā)現(xiàn)1、1944年年Avery的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 證明了核酸是遺傳的物質(zhì)根底證明了核酸是遺傳的物質(zhì)根底2、1953年年Watson和和Crick弄清了生物遺弄清了生物遺傳物質(zhì)的分子機(jī)制：傳物質(zhì)的分子機(jī)制： 闡明了闡明了DNA的的雙螺旋構(gòu)造和半保管復(fù)制機(jī)理。雙螺旋構(gòu)造和半保管復(fù)制機(jī)理。3、基因工程的載體質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)：、基因工程的載體質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)：從從1946年起，年起，LEDERBERG開場(chǎng)研討細(xì)菌的性開場(chǎng)研討細(xì)菌的性因子因子-F因子，經(jīng)過因子，經(jīng)過50年代和年代和60年代，相繼年代，相繼發(fā)現(xiàn)其它質(zhì)粒，如抗藥因子發(fā)現(xiàn)其它質(zhì)粒，如抗藥因子R因子，到因

3、子，到1973年年COHEN將質(zhì)粒作為基因工程的載體將質(zhì)粒作為基因工程的載體運(yùn)用運(yùn)用二技術(shù)上的三大發(fā)明二技術(shù)上的三大發(fā)明1、DNA的特異切割的特異切割 1970年年Smith和和Wilcox等人從流感嗜血桿菌中分別出特異切等人從流感嗜血桿菌中分別出特異切割割DNA的限制酶。從而為人們隨意切割的限制酶。從而為人們隨意切割DNA提供了一把利剪。提供了一把利剪。2、DNA銜接酶的發(fā)現(xiàn)銜接酶的發(fā)現(xiàn) 1967年，世界上有五個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)年，世界上有五個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)了了DNA銜接酶，這種酶可以參與銜接酶，這種酶可以參與DNA裂口的修裂口的修復(fù)。復(fù)。三基因工程的誕生三基因工程的誕生 1973年，

4、年，Cohen等實(shí)現(xiàn)了等實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌間性狀的轉(zhuǎn)移。細(xì)菌間性狀的轉(zhuǎn)移。 這是基因工程開展史上第這是基因工程開展史上第一次實(shí)現(xiàn)重組體轉(zhuǎn)化勝一次實(shí)現(xiàn)重組體轉(zhuǎn)化勝利的例子?；蚬こ虖睦睦??；蚬こ虖拇苏Q生，這一年被定為此誕生，這一年被定為基因工程誕生的元年?；蚬こ陶Q生的元年。四基因工程的幾個(gè)方面四基因工程的幾個(gè)方面1、基因工程技術(shù)的、基因工程技術(shù)的“神奇所在神奇所在2、“多利的克隆多利的克隆3、基因工程技術(shù)與我們、基因工程技術(shù)與我們 1、基因工程技術(shù)的神奇所在？、基因工程技術(shù)的神奇所在？而經(jīng)過基因工程技術(shù)如今只需用而經(jīng)過基因工程技術(shù)如今只需用10L發(fā)酵液就可獲得同樣的產(chǎn)量。發(fā)酵液就可獲得同樣的產(chǎn)量

5、。 實(shí)例實(shí)例1 胰島素的提?。阂葝u素的提?。?00000胰臟只能提取胰臟只能提取34克，克，而用而用“工程菌進(jìn)展發(fā)酵消費(fèi)，那么只需幾升發(fā)酵工程菌進(jìn)展發(fā)酵消費(fèi)，那么只需幾升發(fā)酵液就可獲得同樣數(shù)量的產(chǎn)品。液就可獲得同樣數(shù)量的產(chǎn)品。實(shí)例實(shí)例2 生長(zhǎng)激素釋放因子一種十四肽，能抑制其他激素的生長(zhǎng)激素釋放因子一種十四肽，能抑制其他激素的釋放和治療糖尿病：它原來(lái)要從羊的腦下垂體中提取，釋放和治療糖尿?。核瓉?lái)要從羊的腦下垂體中提取，宰宰50萬(wàn)頭羊也只能提取萬(wàn)頭羊也只能提取5毫克的產(chǎn)品，毫克的產(chǎn)品，1962約翰約翰格登宣布他用一個(gè)成年細(xì)胞克隆出一只蝌蚪格登宣布他用一個(gè)成年細(xì)胞克隆出一只蝌蚪 1984斯蒂恩斯蒂

6、恩威拉德森用胚胎細(xì)胞克隆出一只羊威拉德森用胚胎細(xì)胞克隆出一只羊 1996用成年哺乳動(dòng)物細(xì)胞克隆出的個(gè)體克隆羊用成年哺乳動(dòng)物細(xì)胞克隆出的個(gè)體克隆羊Dolly出世出世2000美國(guó)科學(xué)家用無(wú)性繁衍技術(shù)勝利地克隆出一只猴子美國(guó)科學(xué)家用無(wú)性繁衍技術(shù)勝利地克隆出一只猴子2001年美、意科學(xué)家聯(lián)手展開克隆人的任務(wù)年美、意科學(xué)家聯(lián)手展開克隆人的任務(wù) 1996-2000歐美日俄中國(guó)等多國(guó)科學(xué)家勝利克隆多種動(dòng)物歐美日俄中國(guó)等多國(guó)科學(xué)家勝利克隆多種動(dòng)物上世紀(jì)上世紀(jì)50年代科學(xué)家勝利無(wú)性繁育出非洲爪蟾年代科學(xué)家勝利無(wú)性繁育出非洲爪蟾2、“多利的克隆多利的克隆體細(xì)胞克隆技術(shù)體細(xì)胞克隆技術(shù)DollyDolly誕生記誕生記

7、取出一個(gè)取出一個(gè)體細(xì)胞體細(xì)胞消費(fèi)小羊消費(fèi)小羊胚胎體外培育胚胎體外培育植入母羊植入母羊 第三只第三只細(xì)胞核細(xì)胞核置換置換取出一個(gè)取出一個(gè)卵細(xì)胞卵細(xì)胞從克隆過程看從克隆過程看 多利多利 克隆羊“多利沒有父親，但卻有著三個(gè)母親 三個(gè)母親中，后兩個(gè)只是方式上的母親 “多利實(shí)踐上是第一個(gè)母親的百分之百的“復(fù)制品 “多利的這一發(fā)生過程就叫無(wú)性繁衍 體細(xì)胞克隆勝利率低體細(xì)胞克隆勝利率低 將將434434個(gè)體細(xì)胞的核移植至個(gè)體細(xì)胞的核移植至434434個(gè)去核卵中，產(chǎn)生的交融細(xì)個(gè)去核卵中，產(chǎn)生的交融細(xì)胞為胞為277277個(gè)，勝利率為個(gè)，勝利率為63.863.8 將將277277個(gè)移植卵移到輸卵管勝利者個(gè)移植卵移

8、到輸卵管勝利者247247個(gè)個(gè), ,勝利率為勝利率為89.289.2 在輸卵管可以發(fā)育到胚胎階段者在輸卵管可以發(fā)育到胚胎階段者2929個(gè)，勝利率為個(gè)，勝利率為11117 7 將將2929個(gè)胚胎移植至個(gè)胚胎移植至1313只代理母羊子宮中獲得勝利者為只代理母羊子宮中獲得勝利者為1 1個(gè)個(gè), ,妊娠率妊娠率7.77.7 總的勝利率為總的勝利率為1：434,即用即用434個(gè)含體細(xì)胞核的卵移植入個(gè)含體細(xì)胞核的卵移植入去核卵內(nèi)去核卵內(nèi),經(jīng)過種種階段經(jīng)過種種階段,最后只產(chǎn)生出一只克隆羊。最后只產(chǎn)生出一只克隆羊。 在一定條件下，曾經(jīng)分化過程的體細(xì)胞依然在一定條件下，曾經(jīng)分化過程的體細(xì)胞依然是具有全能性的是具有

9、全能性的結(jié)論結(jié)論制止制止“克隆人被各國(guó)立法并已成結(jié)合國(guó)公約克隆人被各國(guó)立法并已成結(jié)合國(guó)公約“克隆克隆 羊與羊與 “克隆人之間在技術(shù)上不存在不克隆人之間在技術(shù)上不存在不可跨越的妨礙可跨越的妨礙3、基因工程技術(shù)與我們、基因工程技術(shù)與我們 第二節(jié)第二節(jié) 基因工程原理基因工程原理一、基因工程工具酶一、基因工程工具酶二、核酸的提取操作和檢測(cè)技術(shù)二、核酸的提取操作和檢測(cè)技術(shù)三、基因工程操作步驟三、基因工程操作步驟 2、命名和分類 命名是根據(jù)分別出此酶的微生物學(xué)名而定的。即取微生物屬名的第一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母組成三個(gè)斜體字母加以表示。 如：EcoRI中的E表示大腸桿菌屬名第一個(gè)字母，co表示種名頭兩個(gè)

10、字母，R表示株名，I表示該菌中第一個(gè)被分別出的酶。1、定義：是指能識(shí)別雙鏈DNA分子的特定序列，并在識(shí)別位點(diǎn)或其附近切割DNA的一類內(nèi)切酶。3、限制性內(nèi)切酶的根本特性1構(gòu)成粘性末端構(gòu)成粘性末端cohesive end / sticky end)2構(gòu)成平末端構(gòu)成平末端(blunt end)常用限制酶的種類及切割方式DNA限制酶分析限制酶分析銜接酶銜接酶T4 DNA Ligase 1967修補(bǔ)工具酶修補(bǔ)工具酶DNA聚合酶聚合酶I 大片斷大片斷 Klenow 1971末端加工酶末端加工酶S1核酸酶核酸酶 ， 堿性磷酸單脂酶堿性磷酸單脂酶末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶人工加人工加polyA 或或polyT 尾尾

11、反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶二、核酸的提取操作和檢測(cè)技術(shù)二、核酸的提取操作和檢測(cè)技術(shù)1、質(zhì)粒、質(zhì)粒DNA的提取的提取2、電泳和、電泳和DNA紫外檢測(cè)紫外檢測(cè) M 1 2 3Kb. 23.19.46.54.3 2.32.0 圖6 質(zhì)粒酶切及去磷 M Hindmarkers 1 pUC18 2,3 pUC18酶切二、基因工程的根本操作步驟二、基因工程的根本操作步驟 1、目的基因的獲得 2、 載體的選擇 3、目的基因與載體DNA的體外重組 4、重組載體引入受體細(xì)胞 5、表達(dá)挑選基因工程的操作步驟表示圖基因工程的操作步驟表示圖1、目的基因的獲得、目的基因的獲得 1 從適當(dāng)?shù)墓w細(xì)胞的從適當(dāng)?shù)墓w細(xì)胞的DNA中分別

12、。中分別。 2 經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄酶的作用由經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄酶的作用由mRNA合成合成cDNA。 3 由化學(xué)方法合成特定功能的基因。由化學(xué)方法合成特定功能的基因。 M 1 2 3 Kb. 23.1 9.46.5 4.3 2.32.0 圖3 不同酶切時(shí)間電泳圖 M Hindmarkers 1 酶切10分鐘 2 酶切20分鐘 3 酶切5分鐘 回收回收2-7Kb DNA 2、載體的選擇、載體的選擇 I 1是一個(gè)有自我復(fù)制才干的復(fù)制子是一個(gè)有自我復(fù)制才干的復(fù)制子replicon) 2) 能在受體細(xì)胞內(nèi)大量增殖，即有較高的復(fù)制率。能在受體細(xì)胞內(nèi)大量增殖，即有較高的復(fù)制率。 3 載體上最好只需一個(gè)限制性內(nèi)切核酸酶的切口

13、，載體上最好只需一個(gè)限制性內(nèi)切核酸酶的切口，使目的基因能固定地整合到載體使目的基因能固定地整合到載體DNA的一定位置上。的一定位置上。 4 載體上必需有一種選擇遺傳標(biāo)志，以便及時(shí)將載體上必需有一種選擇遺傳標(biāo)志，以便及時(shí)將“工程菌選擇出來(lái)。工程菌選擇出來(lái)。載體的種類：載體的種類：1 1、質(zhì)粒載體、質(zhì)粒載體2 2、入噬菌體載體、入噬菌體載體3 3、柯斯質(zhì)粒載體、柯斯質(zhì)粒載體4 4、M13M13噬菌體載體噬菌體載體5 5、真核細(xì)胞的克隆載體：、真核細(xì)胞的克隆載體：酶母質(zhì)粒載體、病毒載酶母質(zhì)粒載體、病毒載體體6 6、人工染色體、人工染色體3、目的基因與載體、目的基因與載體DNA的體外的體外重組重組 限

14、制性內(nèi)切酶的處置和人為在DNA的3末端加上polyA或polyT，兩個(gè)DNA產(chǎn)生互補(bǔ)粘性末端，“退火處置，雙鏈重新構(gòu)成，在外界銜接酶的作用下構(gòu)成一個(gè)完全有復(fù)制才干的環(huán)狀重組載體。4、重組載體引入受體細(xì)胞、重組載體引入受體細(xì)胞 重組載體引入受體細(xì)胞，使基因擴(kuò)增和表達(dá)出供體基因所提供的部分遺傳性狀。5、表達(dá)挑選、表達(dá)挑選1、抗生素平板法、抗生素平板法2、插入失活法、插入失活法3、插入表達(dá)法、插入表達(dá)法4、B-半乳糖苷酶顯色反響法半乳糖苷酶顯色反響法1、抗生素平板法、抗生素平板法2、插入失活法、插入失活法 無(wú)乳糖存在時(shí)無(wú)乳糖存在時(shí)3、插入表達(dá)法、插入表達(dá)法4、B-半乳糖苷酶顯色反響法半乳糖苷酶顯色反

15、響法培育基中含培育基中含X-gal 和和IPTGX-gal: 5-溴溴-4-氯氯-3-吲吲哚哚B-D-半乳糖苷半乳糖苷IPTG：異丙醇：異丙醇B-D-硫硫代半乳糖苷代半乳糖苷B-半乳糖苷酶可以半乳糖苷酶可以把培育基中無(wú)色的把培育基中無(wú)色的X-gal分解成半乳糖分解成半乳糖和呈藍(lán)色的和呈藍(lán)色的5-溴溴-4-氯氯-靛藍(lán)，使菌落成靛藍(lán)，使菌落成藍(lán)色藍(lán)色二、基因工程的運(yùn)用二、基因工程的運(yùn)用一、基因工程藥物一、基因工程藥物 ：胰島素：胰島素二、轉(zhuǎn)基因植物：轉(zhuǎn)基因棉花二、轉(zhuǎn)基因植物：轉(zhuǎn)基因棉花三、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物：轉(zhuǎn)基因豬、魚等三、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物：轉(zhuǎn)基因豬、魚等四、基因治療：向靶細(xì)胞中引入具有正常四、基因治療：向靶細(xì)胞中引入具有正常功能的基因。功能的基因。 基因治療基因治療例如在例如在1971年，有人對(duì)人類半乳糖血癥遺傳病患年，有人對(duì)人類半乳糖血癥遺傳病患者的成纖維細(xì)胞進(jìn)展過離體培育，然后將者的成纖維細(xì)胞進(jìn)展過離體培育，然后將E.coli的的DNA作為供體基因，并經(jīng)過病毒作載體進(jìn)展作為供體基因，并經(jīng)過病毒作載體進(jìn)展轉(zhuǎn)移，結(jié)果使這一細(xì)胞的遺傳病得到了轉(zhuǎn)移，結(jié)果使這一細(xì)胞的遺傳病