HITS-CLIP步驟

1、第一天：1 細(xì)胞培養(yǎng)在100或150mm的平板上，用PBS漂洗，然后place in Stratalinker with the cover off。以400mJ/cm2照射一次和additional 200 mJ/cm2 in Stratalinker。2 收集細(xì)胞懸液，4下2500rpm離心細(xì)胞團(tuán)5min，3(3x dry volume)倍細(xì)胞沉淀體積的PBS重懸細(xì)胞團(tuán)，每個(gè)eppie加入1ml的細(xì)胞懸液，在4下快速離心，去上清，然后保存在-80備用（每管大約200µl細(xì)胞）。備注：1×HBSS：50ml 10×Hanks平衡鹽溶液，Ca-Mg-free(Gi

2、bco, #14186-012)5ml 1M HEPES, pH7.3445ml ddH2O第二天：II免疫沉淀a 溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配） 1×PXL （wash buffer） 1× PBS（組織培養(yǎng)等級(jí)tissue culture grade；不含Mg2+，Ca2+） 0.1% SDS 0.5% 脫氧膽酸鹽 0.5% NP-405×PXL （高鹽wash buffer） 5× PBS（組織培養(yǎng)等級(jí)；不含Mg2+，Ca2+） 0.1% SDS 0.5% 脫氧膽酸鹽 0.5% NP-40 1×PNK緩沖液50 mM Tris-Cl pH 7.410

3、mM MgCl20.5% NP-401X PNK+EGTA Buffer50 mM Tris-Cl pH 7.420 mM EGTA0.5% NP-40b Bead的制備：每一Eppie的交聯(lián)裂解液使用400 µl的蛋白A免疫磁珠(Dynal, 100.02)用pH 8.0的0.1 M的磷酸鈉溶液洗小珠三次。（這里使用高pH是因?yàn)槟茉黾拥鞍譇對(duì)抗體的結(jié)合。然而這需要所有免疫沉淀的緩沖液應(yīng)該適用于你所用的抗體。例如，我們發(fā)現(xiàn)有些抗體在緩沖液中不與脫氧膽酸鹽作用。）用350µl的pH 8.0的0.1 M磷酸鈉重懸小珠，加入50 µl橋聯(lián)Ab（2.4mg/ml；兔抗鼠I

4、gG）。在室溫旋轉(zhuǎn)試管45min；用pH 8.0的0.1 M磷酸鈉洗三次。在400 µl pH 8.1的0.1 M磷酸鈉溶液中重懸小珠，加入3 µl的2A8或12 µl的7G1-1*ascite液體（5mg/ml）。4°C下旋轉(zhuǎn)試管4小時(shí)，1×PXL洗三次；如果你不準(zhǔn)備加入交聯(lián)裂解液，在最后一步移去小珠leave beads in last wash step。c RL3 (-P)接頭（不含P磷）對(duì)5末端的標(biāo)記。（在做IP之前或過程中制備5末端標(biāo)記的接頭。用預(yù)標(biāo)記的3接頭做AGO HITS-CLIP，發(fā)現(xiàn)在放射自顯影圖中比免疫沉淀后PNK反應(yīng)標(biāo)

5、記分離得到的RNA有更多特異性信號(hào)。）2.4 µl RL3(-P)接頭(50pmol/µl；5端不含磷酸) 5 µl 10×PNK Buffer(NEB)25 µl 32P-ATP8 µl T4 PNK enzyme (NEB, M0201L)3 µl RNA酶 (Promega)6.6 µl water 50 µl total37°C時(shí)用Thermomixer R (Eppendorf)孵育30min。加入0.2µl的10mM的ATP，繼續(xù)反應(yīng)5min。旋轉(zhuǎn)使樹脂重懸在G-25柱子中

6、。事先以735g離心柱子1min，使樣品混入樹脂，735g旋轉(zhuǎn)柱子2min。如果不打算立即使用，可以置于-20°C保存。d RNA的部分消化以及超速離心用700 µl 1×PXL（含蛋白酶抑制劑；總體積為1ml）重懸每管的交聯(lián)裂解液；加入15µl的RNA酶(Promega)，置于冰上10min。每管加入30µl的RQ1 DNA酶，37°C孵育5min 1000rpm。在1×PXL中以1:100稀釋RNA酶（高濃度RNA酶）在1×PXL中以1:1000稀釋RNA酶（低濃度RNA酶）往兩只試管中分別加入兩種濃度的RNA

7、酶10µl；37°C孵育5min。30K for 20min at 4°C超速微量離心(polycarbonate tubes in TLA 120.2 rotor)裂解液。小心去上清，留下10µl做immunoblot實(shí)驗(yàn)。e 免疫沉淀把剩余的上清加入另一只新的含有bead的試管中。4°C旋轉(zhuǎn)beads/裂解液混合物2-4小時(shí)。去上清，留下10µl做immunoblot實(shí)驗(yàn)（以確定抗原被除盡）。用冰的緩沖液洗beads：2x 1X PXL (Wash Buffer)2x 5X PXL (High-salt Wash Buffer )

8、2x 1X PNK Buffer【首次做CLIP實(shí)驗(yàn)對(duì)象應(yīng)該是特殊的蛋白，可以跳過III-IV步,直接進(jìn)行第V步。繼續(xù)實(shí)驗(yàn)直到膜暴露在X-射線膠片上，檢查以下問題是否存在：1. 在高RNA酶的實(shí)驗(yàn)中，蛋白的MW上是否有7kDa的放射性條帶？2. 對(duì)照實(shí)驗(yàn)的條帶是否不存在？對(duì)照組沒有UV交聯(lián)，含不相關(guān)的抗體，組織敲除，RNAi，或者沒有轉(zhuǎn)染標(biāo)記的結(jié)構(gòu)。3. 在低RNA酶實(shí)驗(yàn)中，這條帶是否向上移動(dòng)并且更加擴(kuò)散？如果是，對(duì)RNA結(jié)合蛋白進(jìn)行處理，可以在接下來的實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)步驟III?！俊緦?duì)含有低RNA酶（1:300,000）的樣品繼續(xù)步驟III。過渡消化的樣品需要跳過III-IV步,保存在4°

9、;C直到步驟V?！縄IICIP處理（on-bead）8 µl 10×去磷酸化脫磷酸緩沖液 (Roche, 712023) 3 µl 堿性磷酸酶 (Roche, 712023) 2 µl RNA酶 (Promega) 67 µl 水80 µl 總體積 37°C 在Thermomixer R (Eppendorf)中孵育20min（每?jī)煞昼?000rpm離心15s）。1X PNK Buffer 洗一次1X PNK+EGTA Buffer 洗一次1X PNK Buffer洗兩次IVRNA 3接頭的連接（on-bead）8 

10、1;l 10X T4 RNA ligase buffer (Fermentas) 8 µl BSA (0.2 µg/µl) 8 µl ATP (10 mM) 2 µl T4 RNA ligase (Fermentas) 2 µl RNA酶(Promega) 5 µl Labeled hot RL3 (12pmol, Prepared in IIc) 47 µl water 80 µl total把80 µl連接酶混合液加入含beads試管中。16°C 在Thermomixer R(Ep

11、pendorf)中孵育1小時(shí)（每?jī)煞昼?000rpm離心15s）加入4µl的RL3（20pmol/µl；5末端有磷酸鹽），反應(yīng)過夜。第三天 1X PXL buffer 洗一次5X PXL buffer 洗一次1X PNK buffer 洗三次V. PNK 處理(On-Bead)8 µl 10X PNK Buffer (NEB) 1 µl cold ATP (10mM)4µl T4 PNK enzyme (NEB, M0201L) 2 µl RNA酶 (Promega) 65 µl water 80 µl total

12、每份樣品加入80µl的PNK混合液，37°C 在Thermomixer R(Eppendorf)中孵育20min （每4分鐘1000rpm離心15s）1X PXL buffer 洗一次5X PXL buffer 洗一次1X PNK buffer 洗三次VI. SDS-PAGE以及硝酸纖維素轉(zhuǎn)膜【western blot for input and post-IP；load equal volumes.】30 µl 1X PNK+和30 µl Novex 加樣緩沖液（loading buffer）（不含還原劑）重懸beads。在10孔的Novex NuPA

13、GE 10% Bis-Tris 凝膠中每管液體加入到兩個(gè)孔洞內(nèi)，在冷室內(nèi)，175V跑膠。跑膠完成后，使用Novex wet transfer apparatus將其轉(zhuǎn)移至S&S BA-85硝酸纖維素膜上。在30V，用添加了10%的甲醇的NuPAGE Transfer Buffer轉(zhuǎn)移1個(gè)小時(shí)。轉(zhuǎn)膜完成后，用1X PBS沖洗硝酸纖維素膜，然后輕輕的印在Kimwipes上；用塑料膜包裹膜，暴露，放射自顯影。第四天【因?yàn)锳go的存在，如果來自p13腦組織一半的neocortex作為起始原材料，我們能在暴露兩個(gè)小時(shí)后的放射自顯影圖觀察到一個(gè)信號(hào)。如果僅僅用到很少的材料，看到一個(gè)較弱的信號(hào)有時(shí)需

14、要過夜暴露?！坎灰獜倪^度消化的樣品中克隆RNA，但是可以用它確定接下來的步驟中的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體的特異性：1 觀察過渡消化的樣品，在可能出現(xiàn)的蛋白（100kDa）的MW的上部是否存在7kDa的條帶。2 計(jì)算最近的污染條帶的距離，以此確定相關(guān)的信號(hào)強(qiáng)度所對(duì)應(yīng)的蛋白條帶。3 如果你的蛋白條帶相比其他的蛋白條帶移動(dòng)的距離超過10kDa，你應(yīng)該確定純化的RNA相對(duì)你的蛋白的特異性。被低濃度RNA酶消化的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體會(huì)表現(xiàn)出擴(kuò)散的放射現(xiàn)象，跑膠時(shí)會(huì)出現(xiàn)在你的蛋白的MW的上部15-20kDa處?！疽?yàn)锳go的存在，我們會(huì)觀察到兩種不同的模式。一種是Ago-miRNA復(fù)合體的110kDa，另一種

15、是Ago-mRNA復(fù)合體的130kDa?！? 長(zhǎng)度為50個(gè)核苷酸的RNA的平均MW為16kDa。標(biāo)簽含有20個(gè)核苷酸的街頭（L3），能夠產(chǎn)生長(zhǎng)于50個(gè)核苷酸的CLIP標(biāo)簽的蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合體的位置在蛋白的MW的上部20kDa處。5 因?yàn)镽NA的消化是隨機(jī)的，標(biāo)簽的大小為50-150個(gè)核苷酸不等，復(fù)合體的移動(dòng)要比低濃度的RNA酶復(fù)合體更加分散（標(biāo)簽大小為20-60個(gè)核苷酸不等）。6 為了分離到不同蛋白特異的CLIP標(biāo)簽，需要把條帶切得越細(xì)越好（3kDa寬的條帶），大約在你的蛋白的MW的上部20kDa處。7 另外，切出兩條在此條帶上部和下部的條帶，相距15kDa。下部的條帶不含有你的蛋白特異的長(zhǎng)

16、于15個(gè)核苷酸的任意RNA（但是要表明RNA能夠結(jié)合任何小分子蛋白）。用干凈的手術(shù)刀片切除細(xì)的條帶（4-8kDa），把硝酸纖維素膜切片分別裝入微試管中。切片越小越好。用閃爍記數(shù)器計(jì)算放射性。VIIRNA的分離和純化1X PK Buffer: 100 mM Tris-Cl pH 7.5 50 mM NaCl 10 mM EDTA 1X PK Buffer/7M 尿素 (需要新鮮的): 100 mM Tris-Cl pH 7.5 50mM NaCl 10 mM EDTA 7 M 尿素用1X PK Buffer配制4mg/ml的蛋白酶K溶液；37°C預(yù)孵育20min以除去所有可能存在的RN

17、A酶。往每管分離的硝酸纖維素膜中加入200 µl蛋白酶K溶液；37°C預(yù)孵育20min at 1000rpm。加入200 µl 1x PK/7M尿素溶液；37°C繼續(xù)孵育20min at 1000rpm。加入400 µl RNA phenol和130µl CHCl3到溶液中；37°C孵育20min at 1000rpm?！究梢杂?.15 M NaOAc pH 5.2平衡純凈的苯酚來配制RNA苯酚；氯仿：異戊醇=49:1配制CHCl3】微量離心機(jī)最大速度離心試管；取水相，加入50 µl 3M NaOAc pH 5.2

18、，0.75 µl的糖原和1ml EtOH：異丙醇=1:1。沉淀在-20°C過夜。第五天 IX RNA 5 接頭的連接微量離心機(jī)最大速度離心RNA 10min。觀察是否得到少量（decent）沉淀。沖洗并干燥沉淀。用閃爍記數(shù)器計(jì)算RNA。用5.9 µl H2O重懸。RNA ligation: 1 µl 10X T4 RNA ligase buffer (Fermentas) 1 µl BSA (0.2 µg/µl) 1 µl ATP (10 mM) 0.1 µl T4 RNA ligase (3U, Fer

19、mentas) 1 µl RL5 or RL5D RNA linker 20 pmol/µl 4.1 µl加入5.9 µl用H2O重懸的RNA。10 µl total16°C孵育1-5小時(shí)或過夜。往反應(yīng)體系中加入：79 µl H2O11 µl 10X DNA酶 I Buffer5 µl RNA酶5 µl RQ1 DNA酶37°C孵育20min。加入300 µl H2O300 µl “RNA苯酚”100 µl CHCl3離心，取水相。加入：50 µ

20、l 3M NaOAc pH 5.2 0.5µl 糖原 (Ambion, 9510) 1 ml乙醇:異丙醇=1:1 使其產(chǎn)生沉淀。沉淀置于-20°C過夜或1小時(shí)第六天XRT-PCR離心RNA。沖洗并干燥沉淀。如果得到少量（decent）的沉淀，用閃爍記數(shù)器計(jì)算RNA。8 µl H2O重懸沉淀。RT反應(yīng)體系：混合8 µl的連接RNA和2 µl的DP3（5 pmol/µl，終濃度為1 pmol/µl）以及3 µl 3 mM dNTPs。65°C加熱5min，冷卻并快速離心。加入：1 µl 0.1 M

21、DTT 4 µl 5X SuperScript RT Buffer 1µl RNA酶 1 µl SuperScript III (Invitrogen, 18080-044) 20 µl total50°C孵育45min，55°C 15min，90°C 5min，4°C保存。PCR反應(yīng)：27 µl Accuprime Pfx Supermix (Invitrogen, 12344-040) 0.75 µl DP5 引物, 20 pmol/µl 0.75 µl DP3 引物,

22、20 pmol/µl 2 µl RT reaction 30.5 µl total設(shè)置：95°C 2min，25-35個(gè)循環(huán)（取決于剛開始RNA的量）：95°C 20s/58°C 30s/68°C 20s ，68°C5min。【每管兩份。一份實(shí)驗(yàn)用，一份備用?！康谄咛?配10%的聚丙烯酰胺凝膠。我們使用Owl垂直電泳（P9DS-2）。每次配20ml：8.4 g尿素 (Fisher, U15-3) 5 ml 40% 19:1 Acrylamide:Bis-acrylamide (Fisher) 4 ml 5x TBE

23、 water to 20 ml total立即加入：200 µl 10% APS 和7.5 µl TEMED。我們使用2x 加樣緩沖液（loading buffer）配制聚丙烯酰胺凝膠：95% 甲酰胺，去離子的 (Sigma F-9037)5% 100mM EDTA, pH 8溴酚藍(lán)+二甲苯藍(lán)(Sigma B-3269)開始PCR反應(yīng)；使用小分子markers（我們用3 µl 的Amplisize Molecular Ruler，Biorad不能加熱），把凝膠浸入用TBE稀釋10，000倍的SYBR Gold中10min使DNA顯影。Cut out 80-100n

24、t的DNA，用QIAquick Gel Extraction Kit抽提DNA（按照"user-developed"手冊(cè)從聚丙烯酰胺凝膠中抽提DNA）。XIRe-PCR with Solexa Fusion PrimersPCR反應(yīng)27 µl Accuprime Pfx Supermix (Invitrogen, 12344-040) 0.5 µl DSFP5 primer, 20 pmol/µl 0.5 µl DSFP3 primer, 20 pmol/µl 3µl RT reaction 31 µl total設(shè)置：95°C 2min，6-14個(gè)循環(huán)：95°C 20s / 58°C 30s / 68°C 40s68°C 5min2%的瓊脂糖(瓊脂糖凝膠或MetaPhor) / EB gel所有的PCR產(chǎn)物跑膠；小分子marker（5 µl Amplisize Molecular Ruler）。UV box觀察DNA。Cut out DNA150-170nt，參照手冊(cè)從瓊脂糖凝膠中用QIAquick Gel Extraction Kit抽提DNA。XIIQuantitation of DNA用Quant-it D