植物低溫脅迫響應(yīng)的生化與分子生物學機制研究進展郭子武百度

1、植物低溫脅迫響應(yīng)的生化與分子生物學機制研究進展3郭子武李憲利33高東升段成國(山東農(nóng)業(yè)大學園藝學院泰安271018摘要綜述了植物對低溫脅迫響應(yīng)的生化與分子生物學機制,即低溫信號激活某些抗凍基因的表達,產(chǎn)生特異蛋白和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),使植物抗氧化脅迫能力和滲透調(diào)節(jié)能力提高,保護了植物細胞。而植物抗寒性的提高決定于抗凍基因的表達,如何通過分子生物學手段提高植物抗凍基因表達的效應(yīng)是培育植物抗寒品系的關(guān)鍵。并展望了該領(lǐng)域今后研究的方向。關(guān)鍵詞低溫脅迫植物抗寒性抗凍基因Advance in the mech anism of biochemistry and molecular biology in res

2、ponse to cold stress of plant.G UO Z i 2Wu ,LI X ian 2Li ,G AO D ong 2Sheng ,DUAN Cheng 2G uo (C ollege of H orticulture ,Shandong Agricultural University ,T ai an 271018,C J E A ,2004,12(2:5457Abstract The signs of low tem perature activate the expression of s ome freezing tolerant genes of plant a

3、nd the contents of specific proteins and osm otic adjustment substances are raised ,all of which elevate the antioxidant capacity and the osm otic adjustment ca 2pacity and protect the plant cells ,thus the expression of s ome freezing tolerant genes is the determinant of the antifreeze capacity ,s

4、o it is critical for breeding antifreeze traits that enhances the level of the expression of freezing tolerant genes.Finally ,the view of this domain in future is presented.K ey w ords C old stress ,Antifreeze capacity of plant ,Freezing tolerant gene低溫是典型的環(huán)境脅迫因素之一,對植物生長發(fā)育有重要的影響1,一般認為低溫脅迫使植物光合作用降低,呼

5、吸作用增強,能量產(chǎn)生和物質(zhì)合成受阻,消耗增強,植物處于饑餓狀態(tài),嚴重影響了植物正常生長發(fā)育甚至導(dǎo)致死亡。但植物對低溫脅迫的響應(yīng)并非是完全被動的反應(yīng),而是一種積極主動的應(yīng)激過程。低溫誘導(dǎo)了相關(guān)基因的表達,通過積累小分子抗性物質(zhì)及抗氧化系統(tǒng)的活化等,緩解了低溫脅迫造成的機械傷害和生理傷害,提高了植物的抗性。1抗氧化系統(tǒng)對低溫脅迫的生化響應(yīng)低溫下由于植物對O 2的利用能力降低,多余的O 2能在代謝過程中被轉(zhuǎn)化成對植物有毒害作用的活性氧(AOS ,在代謝旺盛部位(如呼吸鏈和光合電子傳遞鏈活性氧生成量更高。故過剩的O 2對需O 2生物有潛在毒性,必須通過植物抗氧化系統(tǒng)及時清除。植物抗氧化系統(tǒng)由許多酶和一

6、些小分子組成2,低溫脅迫下這些酶和小分子物質(zhì)含量和活性均發(fā)生變化。對玉米研究表明低溫脅迫下玉米超氧化物歧化酶(S OD 、過氧化氫酶(C AT 等活性改變;糖、抗壞血酸、谷胱甘肽含量也發(fā)生變化3。轉(zhuǎn)MnS OD 基因玉米中因?qū)肓薓nS OD 基因,使超氧化物歧化酶含量和活性均增強,因而抗寒力明顯增強4。經(jīng)低溫脅迫適應(yīng)的玉米其抗氧化系統(tǒng)活力增強,耐低溫脅迫的能力明顯提高,說明低溫對這些酶有一定誘導(dǎo)作用,而低溫誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶一定程度緩解了植物氧化性傷害;但隨氧化程度的加重,植物細胞受到傷害加重甚至死亡,酶合成的量降低以及不斷氧化,使酶含量和活性降低并最終失活5。對甘藍研究發(fā)現(xiàn)1種約10kD 的冷凝

7、蛋白,該冷凝蛋白是1種非特異依賴于Ca 2+和Mn 2+脂類轉(zhuǎn)移蛋白,可在凍2融過程中保護類囊體活性,該蛋白與Ca 2+和Mn 2+的螯合能力同植物抗冷能力密切相關(guān)6。小分子游離蛋白的氧化對植物有保護作用,使植物避免因低溫下光合作用能力降低,合成碳水化合物減少而饑餓致死。脯氨酸是1種親水氨基酸,也是1種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),能緩解因低溫脫水造成的滲透脅迫。分子伴侶也能提高植物抗寒能力,研究發(fā)現(xiàn)番茄和菠菜在低溫下產(chǎn)3國家高新技術(shù)發(fā)展(863計劃項目(2001AA247041資助33通訊作者收稿日期:2003203206改回日期:2003204212第12卷第2期2004年4月中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學報Chines

8、e Journal of Eco 2Agriculture V ol.12N o.2April ,2004生1種70族的分子伴侶,這些分子伴侶能緩解低溫對植物的傷害,提高其組織抗性7。故抗氧化系統(tǒng)可清除低溫脅迫產(chǎn)生的活性氧,調(diào)節(jié)細胞滲透勢,維持細胞膨壓,避免細胞脅迫致死。2相關(guān)基因?qū)Φ蜏孛{迫的響應(yīng)低溫下植物的生理生化變化是植物低溫應(yīng)激反應(yīng)結(jié)果。近年來多種植物中均發(fā)現(xiàn)與脅迫有關(guān)的基因以及這些基因表達產(chǎn)物812,而對模式植物擬南芥811和低溫敏感植物12的研究多見報道。利用擬南芥突變體研究植物基因?qū)Φ蜏氐捻憫?yīng)。擬南芥的基因組較小,利用擬南芥及其各種突變體研究其對低溫脅迫的不同響應(yīng)和低溫下相關(guān)基因表

9、達及其與抗冷能力的關(guān)系具有一定可行性810。擬南芥的hos2基因有hos221、hos222和hos2233種突變體8,由于hos2基因位點的突變提高了低溫脅迫下RD29A 和其他一些基因的表達,而響應(yīng)滲透調(diào)節(jié)和ABA 的基因則不受影響,遺傳分析表明hos2是1個核內(nèi)隱性基因。與野生擬南芥相比,突變體hos221在零上低溫的抗冷能力低于野生型,但其不會減弱對春化作用的響應(yīng)。擬南芥中hos1突變產(chǎn)生了突變體hos121,從而導(dǎo)致抗冷基因RD29A 、C OR47、C OR15A 、KI NI 和ADH 的表達,這些基因雖在高鹽、脫落酸(ABA 、聚乙二醇的誘導(dǎo)下也能表達,但hos121的這些基因

10、表達僅受低溫誘導(dǎo),遺傳分析表明hos1是1個核內(nèi)單隱性基因。筆者低溫脅迫下用RD29A 啟動子控制的熒光素酶報告基因研究hos121突變體結(jié)果表明,hos121的響應(yīng)低溫基因可在19高溫下被誘導(dǎo)并表達;相反野生擬南芥響應(yīng)低溫的基因在10乃至更低溫度下不能表達。與野生擬南芥相比,突變體hos121不抗嚴寒,經(jīng)2d 低溫適應(yīng)后hos121獲得與野生擬南芥相同耐冷性且開花更早,表現(xiàn)出固有的春化特性。故hos1和hos2基因?qū)χ参锏蜏匦盘栟D(zhuǎn)導(dǎo)具有負調(diào)節(jié)作用,在緩解低溫脅迫、耐冷性和開花過程的基因表達中起關(guān)鍵作用8。研究表明擬南芥中ABI3基因的異常表達可提高植物抗冷能力和低溫適應(yīng)性,其在異常表達的擬南

11、芥中可提高低溫和干旱脅迫基因?qū)γ撀渌岬拿舾行?即使在短時間使用少量的脫落酸,脅迫基因的表達也能明顯提高,同時ABI3基因的異常表達還提高低溫誘導(dǎo)的耐低溫脅迫能力。與野生擬南芥相比,轉(zhuǎn)ABI3植物適應(yīng)低溫更快,明顯提高耐極限低溫的能力,故轉(zhuǎn)ABI3植物只需較低水平的脫落酸即可激活耐低溫脅迫基因的表達并保持較高的抗低溫脅迫能力9。C BF 基因為低溫誘導(dǎo)后迅速表達的基因,其編碼的轉(zhuǎn)錄激活子控制著包括C 2repeat/脫水響應(yīng)元件DNA 調(diào)節(jié)因子啟動子基因的表達。轉(zhuǎn)C BF 擬南芥中C BF1和C BF3的表達可誘導(dǎo)低溫調(diào)節(jié)的靶基因(C OR 表達,提高未經(jīng)低溫適應(yīng)的植物耐低溫脅迫能力。擬南芥C

12、BF3基因的過度表達提高了耐低溫脅迫能力,且導(dǎo)致許多與低溫脅迫有關(guān)的生理生化變化,如脯氨酸和可溶性糖(蔗糖、棉籽糖、葡萄糖和果糖等含量提高,而P5CS 轉(zhuǎn)錄體水平的提高則表明脯氨酸水平的提高,至少為部分因脯氨酸合成的關(guān)鍵酶2二氫吡咯252羧酸酯合酶基因的表達,故C BF3整體激活了低溫適應(yīng)的響應(yīng)信號多種組分10。擬南芥中s fr6基因突變后導(dǎo)致其冷敏性,說明s fr 基因是低溫抗性的必須基因,經(jīng)檢測純化s fr2s fr7突變體低溫誘導(dǎo)后基因的表達發(fā)現(xiàn),s fr6突變體可被低溫誘導(dǎo)的基因中缺少KI N1、C OR15a 和LTI78基因,這些基因均包括啟動子區(qū)的C 2re 2peat/脫水響應(yīng)

13、元件,而s fr6突變體中不能缺失KI N1,導(dǎo)致其能對滲透脅迫和ABA 產(chǎn)生響應(yīng)。相反低溫誘導(dǎo)基因C BF1、C BF2、C BF3和ATP5CS1的表達,因他們都缺失CRT/DRE 基序,故不受低溫誘導(dǎo)。低溫敏感品種s fr6突變體基因的表達具有很強連鎖性,有研究認為低溫誘導(dǎo)的s fr6突變體中包含CRT/DRE 基因,低溫誘導(dǎo)失敗是因低溫使其Ca 信號發(fā)生變化,但對低溫誘導(dǎo)的細胞色素結(jié)合態(tài)鈣變化的研究發(fā)現(xiàn),s fr6突變體中Ca 的變化與野生品種差異不顯著。故CRT/DRE 結(jié)合蛋白可能是其激活后才能在轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮作用,而SFR6蛋白是激活的關(guān)鍵因素。擬南芥C BF 族基因的C BF2

14、和C BF3與C BF1有高度相似性,其中1個基因編碼了包含AP2結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄激活子基因,該激活子基因與低溫響應(yīng)元件CCG AC 連接,誘導(dǎo)了某些低溫調(diào)節(jié)基因的表達,提高了植物抗冷性,該基因還編碼了AP2DNA 結(jié)合基序蛋白,該蛋白與C BF1、C BF2和C BF3蛋白相似,且包括1種核內(nèi)定位信號和酸性激活區(qū)域。C BF2和C BF3基因與C BF1相連接,在I V 染色體底臂構(gòu)成1簇,這些基因(C BF 基因高度相似并前后順序連接,具有相同轉(zhuǎn)錄位點的事實表明它們是同源的。同時C BF1、C BF2和C BF3基因表達模式也具一致性,可被低溫處理迅速誘導(dǎo),并對脫落酸和水分脅迫無響應(yīng),這與多數(shù)

15、植物低溫誘導(dǎo)的基因特征相反,故基因C BF2和C BF3可行使轉(zhuǎn)錄激活子基因的功能,控制低溫基因表達水平并通過不依賴于脫落酸的途徑提高植物抗寒能力10,11。有研究表明低溫調(diào)節(jié)的C BF 基因族編碼的AP2轉(zhuǎn)錄激活子基因是低溫誘導(dǎo)基因C OR (cold 2regulated 表達的早期階段,而控制低溫基因表達的DNA 調(diào)節(jié)元件為CRT (C 2repeat /DRE ,C BF 基因族的C BF1與該元件緊密結(jié)合,其在轉(zhuǎn)基因植物的過度表達激活了低溫誘導(dǎo)基因C OR 的表達,提高植物的抗冷性。研究表明C BF1與C BF2和C BF3同屬一小蛋白家族,其基因在55第2期郭子武等:植物低溫脅迫響

16、應(yīng)的生化與分子生物學機制研究進展65中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學報第12卷染色體I V的72.8cm處同向重復(fù),該基因3種C BF轉(zhuǎn)錄水平在低溫下15min后明顯提高,約2h即可積累C OR基因轉(zhuǎn)錄體,同時C BF轉(zhuǎn)錄體也得以積累。C BF的啟動子區(qū)域不包含CRT/DRE序列和CCG AC,且C BF1的過度表達對C BF3轉(zhuǎn)錄體水平無影響,這表明C BF族基因為非自主調(diào)節(jié),在C BF基因誘導(dǎo)初級階段含有CRT/DRE基序的C OR基因誘導(dǎo)需要低溫刺激作為信號。脯氨酸對緩解低溫脅迫傷害有重要作用,而脯氨酸的產(chǎn)生受基因調(diào)節(jié),有研究表明擬南芥中Eskim ol位點突變會導(dǎo)致脯氨酸積累,緩解了植物低溫傷害,但它卻

17、不能有規(guī)律地增強幾種低溫調(diào)節(jié)基因包括抗冷基因的表達。RNA凝膠分析表明esk1突變體中脯氨酸積累受到基因包括脯氨酸合成和降解基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)。擬南芥蛋白類似激酶接受器基因(rpk1是1個含有1952bp的開放解讀框架,其編碼了1個540個氨基酸殘基的多肽,該多肽(RPK1具有激酶接受器的4個互不相同區(qū)域,即氨基酸末段信號序列區(qū),5個富含亮氨酸的胞外重復(fù)序列;膜形成區(qū);細胞質(zhì)蛋白激酶區(qū),該區(qū)包括蛋白激酶所有保守的11個亞區(qū)。rpk1基因在花、莖、葉片和根部均有表達,研究表明用脫落酸處理1h后即可誘導(dǎo)其表達,該基因通常被多種環(huán)境脅迫因子快速誘導(dǎo),如脫水、高鹽和低溫等,這表明它對脅迫的反應(yīng)有普遍性

18、。而aba21、abi121、abi221、abi321突變體中脫水誘導(dǎo)該基因的表達,但未造成傷害,這表明脫水誘導(dǎo)的rpk1基因為脫落酸依賴型11。低溫敏感植物基因?qū)Φ蜏氐捻憫?yīng)。對低溫敏感植物易受到低溫傷害,低溫敏感植物的低溫適應(yīng)特性和低溫下基因表達特性的研究已多見報道11,12。對大麥研究發(fā)現(xiàn)3種在頂端組織中表達的低溫誘導(dǎo)基因,分別為blt101、blt4.9和blt14,且已分離出這3種基因的表達產(chǎn)物mRNAs,1個控制基因和1個延長因子lalpha,這3種基因的表達特點為blt101和blt4.9僅在低溫處理大麥中表達,且blt101在低溫處理大麥多種組織中均可表達,尤在頂端組織導(dǎo)管區(qū)表

19、達最強烈,經(jīng)驗證blt4.9是該低溫誘導(dǎo)基因的啟動子,而blt14在處理和對照中均有表達,且僅在頂端組織皮層內(nèi)層表達。盡管膜內(nèi)控制基因表達強烈,由于編碼非特異性膜脂轉(zhuǎn)運蛋白基因blt4.9的表達受葉表皮和老化的頂端組織表皮限制,故任何1種低溫誘導(dǎo)基因均未表達。不同組織低溫誘導(dǎo)基因表達產(chǎn)物的分子特征雖完全不同,但這些表達產(chǎn)物與頂端組織導(dǎo)管區(qū)傷害和植物的成活密切相關(guān),因此該區(qū)blt101和blt14強烈表達表明其對頂端組織耐低溫能力有直接影響12。blt4.9為低溫基因的啟動子區(qū)域,該小區(qū)域(1938bp包含的序列基序中含有響應(yīng)低溫、脫落酸和其他環(huán)境因子序列。基因缺失分析表明42bp序列最接近但并

20、未包含在C AA T和T A T A框內(nèi),而在莖外植體短暫基因表達系統(tǒng)中能提高低溫對報告基因的響應(yīng)。利用核蛋白電泳分析(E MS A進一步研究低溫處理和對照blt4.9的啟動子區(qū)域和利用合成低聚核苷酸鑒定六聚核苷酸研究結(jié)果表明,CCG AA在42bp低溫響應(yīng)啟動子區(qū)域內(nèi)可作為遷移率低的結(jié)合蛋白復(fù)合體結(jié)合位點,這種復(fù)合體在低溫處理和對照植物核內(nèi)提取物中均存在,是惟一一種含有該區(qū)域的蛋白復(fù)合體,低溫響應(yīng)42bp啟動子區(qū)域內(nèi)CCG AAA基序的突變減少了對低溫響應(yīng)的基本水平。上游作用元件和CCG AAA是其他植物中低溫響應(yīng)元件,本研究中CCG AAA不與核蛋白結(jié)合。六聚核苷酸和CCG AAA存在于從

21、第一個A TG開始的-195bp處,包含在大麥低溫響應(yīng)基因blt4.9中。小麥中分離的基因tacr7不能被脫落酸和其他脅迫誘導(dǎo)如鹽、脫水及高溫脅迫,而僅能被低溫誘導(dǎo),是一種低溫特異(LT S基因,與大麥基因pH VCR8(基因文庫編碼為L28091同源,編碼高度疏水蛋白T ACR7具有單一跨膜區(qū)域且富含亮氨酸(19%,是文獻中惟一描述過的低溫調(diào)節(jié)蛋白。tacr7基因轉(zhuǎn)錄分析表明,小麥由對照(25轉(zhuǎn)入低溫(2時其幼苗頂端組織和愈傷組織培養(yǎng)中tacr7的轉(zhuǎn)錄體(630nt大量積累,利用pT ACR7作探針的N orthern雜交,經(jīng)鹽、水分脅迫和高溫脅迫處理其幼苗與愈傷組織培養(yǎng)中未探測到tacr7

22、初級轉(zhuǎn)錄體。2低溫時tacr7初級轉(zhuǎn)錄體在抗低溫脅迫小麥品種HRWW(FR;S Dmut16029頂端組織中積累量遠高于溫敏品種HRWW(FS;S Dmut16169頂端組織,差異顯著并達極值(為30%3%10,12。小麥研究中還發(fā)現(xiàn)受光誘導(dǎo)的低溫響應(yīng)基因wcr12含有1個525bp的開放解讀框架,其編碼了1個174個氨基酸的多肽; wcr12編碼的蛋白WCR12和早期光誘導(dǎo)蛋白E LIPs具有很高的序列同源性,被認為是光脅迫誘導(dǎo)核內(nèi)基因編碼的葉綠體蛋白。在高光子流密度下8低溫時可誘導(dǎo)產(chǎn)生wcr12轉(zhuǎn)錄體,是其他植物E LIPs基因表達的典型模式。4低溫乃至低光照下與對照相比(20溫度,中光強

23、wcr12轉(zhuǎn)錄體水平提高了20倍。黑暗條件下4低溫可使wcr12轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(mPNAs積累,并使其積累水平達到20高光強下水平,這表明低溫下光照對wcr12轉(zhuǎn)錄體的積累并非是必須的。S outhern雜交表明,wcr12基因或相關(guān)同源基因定位于小麥染色體V上11。低溫下常發(fā)生蛋白的解聚,使蛋白質(zhì)變性失活,對小麥研究發(fā)現(xiàn)一種抗解聚因子ADF是由T aADF基因編碼的,抗解聚因子ADF是1種隱蔽的高能肌動蛋白,具有阻止核苷交換以及被誘導(dǎo)的肌動蛋白解聚作用,離體磷酸化研究表明T aADF是小麥52kD激酶的底物。低溫適應(yīng)時期該激酶活性受低溫的調(diào)節(jié)。W estern雜交表明T aADF僅在G ramin

24、eae品種中積累,且耐低溫小麥品種的積累水平高于不耐低溫小麥品種,這種積累受定位于染色體5A位點的基因編碼因子調(diào)節(jié),該位點通常與植物耐低溫能力有關(guān)。對低溫適應(yīng)過程中ADF 活性與植物耐低溫能力的關(guān)系研究表明,低溫下可能需要細胞骨架的再建,再建后新模式可能對提高植物耐低溫能力起到關(guān)鍵作用12。對菠菜研究發(fā)現(xiàn)低溫適應(yīng)基因cap160編碼1種與低溫適應(yīng)密切相關(guān)的酸性蛋白C AP160蛋白,該蛋白有780個氨基酸殘基,與擬南芥脅迫調(diào)節(jié)蛋白rd29A 和rd29B 有嚴格的同源關(guān)系。菠菜與擬南芥基因結(jié)構(gòu)不具相似性,這表明該低溫脅迫基因的分類不具高度保守性。cap160和cap85(另1種菠菜低溫脅迫蛋白

25、在農(nóng)桿菌35s 啟動子區(qū)域控制下轉(zhuǎn)入煙草,轉(zhuǎn)基因煙草細胞半致死溫度與野生煙草無差異,但脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草電解質(zhì)外滲水平低于野生煙草,這表明低溫對它的傷害較小。2種異源低溫脅迫蛋白的表達對低溫脅迫無明顯影響,這與低溫脅迫是一種數(shù)量形狀的本質(zhì)一致8。對玉米研究表明,低溫誘導(dǎo)了玉米胚芽中編碼2種脯氨酸富集蛋白基因H yRP (雜種脯氨酸富集蛋白和HRG P (羥脯氨酸富集糖蛋白的表達,編碼H yPRP 基因表達受脫落酸和低溫的調(diào)節(jié),是依賴于脫落酸的基因;而與之相反特效低溫處理對編碼HRG P 基因有正向影響,研究表明這2種蛋白均明顯提高玉米抗寒能力。3小結(jié)與討論低溫脅迫下基因表達的改變可誘導(dǎo)合成許多新

26、的蛋白質(zhì),如多種酶改變植物代謝途徑,使植物進入抗寒鍛煉;部分膜蛋白有穩(wěn)定膜的作用;某些糖蛋白主要存在于液胞和細胞間隙阻止冰凍作用,使細胞液在低溫下處于過冷狀態(tài),從而保護細胞膜的穩(wěn)定性,提高滲透調(diào)節(jié)能力,降低低溫脅迫對細胞的傷害。而抗寒能力由植物基因決定,已分離鑒定出許多與低溫脅迫有關(guān)的基因及其產(chǎn)物,但其具體功能尚需進一步研究。低溫脅迫下植物的響應(yīng)是多基因表達產(chǎn)生的響應(yīng)綜合,但并非是簡單累加,研究低溫響應(yīng)相關(guān)基因間以及它們表達的關(guān)系,使這些基因的表達效應(yīng)達到最高,提高植物耐寒能力,延長植物耐受低溫的時間,從根本上提高植物抗寒性?？傻蜏卣T導(dǎo)的基因很多且大多已被克隆和鑒定,應(yīng)用分子生物學手段,植物低溫脅迫的響應(yīng)生化和分子生物學機制正被逐步闡明,但仍有許多問題亟待研究,如低溫信號是如何被感知?低溫脅迫下抗寒基因的表達依賴于多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié),這些轉(zhuǎn)錄因子作用方式的確定將有助于低溫脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的闡明。如何更有效培育高品質(zhì)抗寒植物品系?1個轉(zhuǎn)錄因子往往調(diào)控幾個功能基因的表達,故植物抗寒育種中與逐個改良和導(dǎo)入功能基因獲得抗寒性的傳統(tǒng)方法相比,從改良或增強1個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控能力