實驗二 動物基因組DNA的提取

1、實驗二實驗二 動物動物基因組基因組DNADNA的的提取提取一、實驗目的一、實驗目的1.說出提取真核生物基因組DNA的原理和步驟、現(xiàn)象2.熟練地進行真核生物基因組DNA的提取操作二、實驗原理二、實驗原理蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質(zhì)，將DNA從細胞中析出并與蛋白質(zhì)、脂類和糖類等分離，再用飽和氯化鈉溶液代替有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)，獲得DNA三、儀器三、儀器、材料及、材料及試劑試劑1 1. .儀器儀器主要設備：主要設備：電熱恒溫干燥箱（烘箱）、低溫離心機、移液器（2,10,20,30,200,1000l）、槍頭、1ml離心管（滅菌）、塑料離心管架、吸頭（滅菌）、高壓滅菌鍋、冰箱其它用品：其它用品：一次性

2、塑料手套、無粉橡膠手套、小型剪刀、小型鑷子2.2.材料、試劑材料、試劑材料：鯉材料：鯉尾鰭尾鰭組織組織試劑：瓊脂糖（檢測用）、蛋白酶K、溴化乙錠（EB） （檢測用） 、Na2EDTA2H2O、Tris base堿(MW 121.1)、十二烷基硫酸鈉（SDS）、NaOH、氯化鈉、無水乙醇、Tris-HCl 、乙二胺四乙酸（EDTA）。DNA提取所需的試劑配制HOM BufferHOM Buffer：稱取29.8g Na2EDTA2H2O 溶于700mL雙蒸水中，加入12.1g Tris base堿和5g SDS，NaOH調(diào)至pH=8.0，定容至1000mL。蛋白酶蛋白酶K K：15mg蛋白酶K溶

3、于1mL雙蒸水，-20冷凍保存。4.5 4.5 M M氯化鈉氯化鈉：稱取263.25g氯化鈉溶于700mL雙蒸水中，定容至1000mL。7575乙醇乙醇：750mL的無水乙醇溶于200mL的雙蒸水，定容至1000mL。 4預冷。TE TE 緩沖液緩沖液：1M Tris-HCl (pH=8.0 ) 2mL，0.5M EDTA (pH=8.0 ) 0.2mL與97.8mL雙蒸水混勻。四、實驗四、實驗步驟步驟（一）動物（一）動物組織材料的采集、保存組織材料的采集、保存( (以魚類分子材料的采集為例以魚類分子材料的采集為例) )鰭條鰭條通常采集各鰭條，因為尾鰭采集方便，量較大。1）剪取鰭條（注意鰭條量

4、不要太多，過多脫水不完全，容易造成材料損壞。通常為離心管的一半就可以了）；剪取鰭條前洗凈手、剪刀，不要粘附有上一尾魚的材料，包括鮮血。2）將鰭條放入10mL離心管中 ；3）加入95-100%的酒精（加滿）；4）依次在20min、1h、2h、5h、12h后更換酒精（后2次可依具體情況更換）。5）用中性筆寫上標簽，編號為“地點編號年月日001”起，如020120728001，其中0（地點編號）2012（年）07（月）08（日）001（當天編號）。將標簽放入離心管中。肌肉肌肉1）洗凈手、剪刀，不要粘附有上一尾魚的材料，包括鮮血。2）用剪刀去除魚類皮膚3）剪取長條形肌肉（不要太厚，可以適當長一些，薄一

5、些，便于脫水、固定DNA）4）將肌肉放入10mL離心管中5）加入95-100%的酒精（加滿）；6）依次在20min、1h、2h、5h、12h后更換酒精（后2次可依具體情況更換）。7）用中性筆寫上標簽，編號為“地點編號年月日001”起，如020120728001，其中0（地點編號）2012（年）07（月）08（日）001（當天編號）。將標簽放入離心管中。魚類分子樣品的保存每個地方，不同魚類材料放到不同封口袋中保存，注意防止酒精揮發(fā)。溫度最好保持在4 以下。（二）DNA提取(高鹽法) 取0.05-0.1g 左右的尾鰭組織，充分剪碎，放入1.5mL離心管中； 向離心管中加入1015L的蛋白酶K 、5

6、00L的HOM buffer，在55消化至少2-3h，每隔0.5-1h搖動一次； 加500L氯化鈉（4.5M），300L氯仿，混5-20min，期間劇烈搖動。13000r/min下離心10min； 轉(zhuǎn)移上清液到新管（大概850L左右），加595L無水異丙醇（0.7volume）,混20min， 13000r/min下離心10min，倒掉上清； 加500L 75乙醇，置5min，13000r/min下離心20min，倒掉上清液； 將試管倒立于吸水紙上，室溫下自然干燥； 加50100L的滅菌雙蒸水或TE溶解，-20(4)保存。注意事項 （1）材料應適量，過多會影響裂解，導致DNA量少，純度低； （

7、2）離心分離兩相時，應保證一定的轉(zhuǎn)速和時間； （3）沉淀后應用75的乙醇洗滌，以除去鹽離子等； （4）室溫干燥DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）； （5）若長期儲存建議使用TE緩沖液溶解（pH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解，TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase）。五、實驗安排五、實驗安排本實驗一天內(nèi)可做完。第一次，約2.5h，取樣與酶解。酶解完成后，以班級為單位放入1.5mL離心管盒。第二次，約4h，DNA提取。六、實驗報告/作業(yè)總報告：鯉總報告：鯉DNADNA的提取，檢測和？基因的擴增的提取，檢測和？基因的擴增 1 1）蛋白酶）蛋白酶K K、7575乙醇的作用是

8、什么？其使用量如何乙醇的作用是什么？其使用量如何掌握？掌握？ 2 2）你的組織材料消化后消化液的顏色、透明度如何？）你的組織材料消化后消化液的顏色、透明度如何？是否有未消化材料？未消化材料可能是什么？是否有未消化材料？未消化材料可能是什么？ 3 3）在試驗的各步驟你看到什么現(xiàn)象？）在試驗的各步驟你看到什么現(xiàn)象？ 4 4）敘述高鹽法提取動物基因組）敘述高鹽法提取動物基因組DNADNA的的步驟步驟。5 5）生物科學專業(yè)作業(yè)：）生物科學專業(yè)作業(yè)：DNADNA的粗提取與鑒定的粗提取與鑒定實驗是人教版全日制普通實驗是人教版全日制普通高級中學高級中學生物生物必修二中要求學生掌握并完成的一個重要實驗必修二中

9、要求學生掌握并完成的一個重要實驗。（1 1）請）請你查閱資料，編制該實驗的方案，說明每一步驟的實驗目的（可你查閱資料，編制該實驗的方案，說明每一步驟的實驗目的（可以申請自行到實驗室進行具體實驗）以申請自行到實驗室進行具體實驗）。（2 2）為什么）為什么是粗提（粗在什么地方）？并對該實驗進一步進行改進以獲是粗提（粗在什么地方）？并對該實驗進一步進行改進以獲得純度較高的得純度較高的DNADNA。（3 3）現(xiàn)在）現(xiàn)在如果要進一步地拓展中學生的能力，需要在植物如果要進一步地拓展中學生的能力，需要在植物 提取提取DNADNA，請，請設計一個中學能夠開展的生植物設計一個中學能夠開展的生植物DNADNA提取實驗。提取實驗。6 6）生物技術及應用專業(yè)作業(yè)：在制藥企業(yè)中，往往需鑒定）生物技術及應用專業(yè)作業(yè)：在制藥企業(yè)中，往往需鑒定中藥材的來源和純度。鑒定過程中需要進行中藥材的來源和純度。鑒定過程中需要進行DNADNA提取。請?zhí)崛?。請查閱資料，設計一個在