提高缺氧耐受力功能評價(jià)方法(征求意見稿)及修訂說明

1、附件5：提高缺氧耐受力功能評價(jià)方法（征求意見稿）保健食品評價(jià)試驗(yàn)項(xiàng)目、試驗(yàn)原則及結(jié)果判定Items, Principles and Result Assessment1 試驗(yàn)項(xiàng)目1.1 體重1.2 常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)：存活時(shí)間1.3常壓缺氧模型實(shí)驗(yàn)：紅細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白，丙二醛（MDA），總抗氧化能力（T-AOC）1.4 亞硝酸鈉中毒缺氧實(shí)驗(yàn)：1.4.1 缺氧損傷實(shí)驗(yàn): 高鐵血紅蛋白含量（MetHb）1.4.2 缺氧存活實(shí)驗(yàn): 存活時(shí)間2 試驗(yàn)原則所列指標(biāo)均為必做項(xiàng)目3 結(jié)果判定3.1常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)、亞硝酸鈉中毒缺氧實(shí)驗(yàn)、常壓缺氧模型實(shí)驗(yàn)三項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中任兩項(xiàng)結(jié)果陽性可判定受試樣品具有提高缺氧耐受力功能。

2、3.2其中缺氧存活實(shí)驗(yàn)、缺氧損傷實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均為陽性可判定亞硝酸鈉中毒缺氧實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。提高缺氧耐受力功能檢驗(yàn)方法Method for the Assessment of Enhancing Anoxia Endurance Function1.常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)1.1 原理缺氧對機(jī)體是一種緊張性刺激，影響機(jī)體各種代謝，特別是影響機(jī)體的氧化供能，最終會導(dǎo)致機(jī)體的心、腦等主要器官缺氧供能不足而死亡。1.2 材料250mL磨口瓶、秒表、凡士林、鈉石灰（或等量氫氧化鈉和碳酸鈣）。1.3 實(shí)驗(yàn)動物推薦用近交系成年小鼠，單一性別，小鼠體重1822克，每組10-15只。1.4 實(shí)驗(yàn)方法1.4.1 劑量和分組至少

3、設(shè)三個(gè)劑量組，同時(shí)設(shè)對照組。以人體推薦量的10倍為其中的一個(gè)劑量組，另設(shè)兩個(gè)劑量組，最高劑量不得超過人體推薦量的30倍。1.4.2受試樣品的給予經(jīng)口灌胃給予受試樣品，無法灌胃時(shí)將受試樣品摻入飼料，并記錄每只動物的飼料攝入量。受試樣品給予時(shí)間30天，必要時(shí)可以延長至45天。1.4.3 實(shí)驗(yàn)步驟每日經(jīng)口灌胃給予受試樣品，對照組給予純凈水。將動物每周稱重兩次，按體重調(diào)整給予受試樣品的量。各組于末次灌胃后1小時(shí)，將各組小鼠分別放入盛有5g鈉石灰的250mL磨口瓶內(nèi)（每瓶1只），用凡士林封瓶口，蓋嚴(yán)，使之不漏氣，立即計(jì)時(shí)，以呼吸停止為指標(biāo)，記錄小鼠死亡的時(shí)間。1.4.4 檢測指標(biāo)小鼠因缺氧而死亡的時(shí)間。

4、1.5 數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算F值，F(xiàn)值< F0.05，結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值>F0.05，用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。1.6 結(jié)果判定受試樣品組與對照組比較，存活時(shí)間延長，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則判定該實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。1.7 注意事項(xiàng)：1.7.1每個(gè)磨口瓶內(nèi)只放1只小鼠。1.7.2磨口瓶一定要密閉封嚴(yán)，以防漏氣，否則會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。1.7.

5、3磨口瓶必須等容量(誤差±1ml)，實(shí)驗(yàn)前先用水加以校正。1.7.4每批實(shí)驗(yàn)動物的體重應(yīng)盡量保持一致。2 常壓缺氧損傷模型實(shí)驗(yàn)2.1 原理在總大氣壓保持不變的情況下，降低空氣中氧的百分含量，機(jī)體吸入氧量降低，導(dǎo)致血液中氧含量降低，組織細(xì)胞不能從血液中獲得充足的氧而使能量代謝障礙，導(dǎo)致重要臟器組織細(xì)胞的損傷。2.2 儀器低氧分壓呼吸效應(yīng)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)、血細(xì)胞分析儀、可見光分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀、微量加樣器、恒溫水浴鍋、普通離心機(jī)、混旋器、具塞離心管、組織勻漿器。2.3 實(shí)驗(yàn)動物推薦用近交系成年小鼠，單一性別，體重1822g，每組10-15只。2.4 實(shí)驗(yàn)方法2.4.1 劑量和分組至少設(shè)三個(gè)劑量組

6、，同時(shí)設(shè)陰性對照組和模型對照組二個(gè)對照組。以人體推薦量的10倍為其中的一個(gè)劑量組，另設(shè)二個(gè)劑量組，最高劑量不得超過人體推薦量的30倍。2.4.2受試樣品的給予經(jīng)口灌胃給予受試樣品，受試樣品給予時(shí)間30天，必要時(shí)可以延長至45天。2.4.3 實(shí)驗(yàn)步驟2.4.3.1造模方法每日經(jīng)口灌胃給予受試樣品，陰性對照組和模型對照組給予同等容量溶劑。將動物每周稱重兩次，以調(diào)整受試樣品劑量。每次給予樣品后，將模型對照組與各劑量組的實(shí)驗(yàn)動物依次放入常壓缺氧裝置中，通過充入氮?dú)夥椒ò蜒b置內(nèi)的氧含量從21%大氣氧含量調(diào)整下降至10.0±0.5 % 氧含量，維持此低氧含量處理樣品組和模型對照組動物68 h/天

7、，每周56次，連續(xù)23周。末次缺氧處理后，采血并取腦進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測。2.4.4指標(biāo)檢測 體重、血紅蛋白含量（Hb）、腦勻漿丙二醛（MDA）、總抗氧化能力（T-AOC）。2.4.4.1血紅蛋白含量測定方法EDTA·K2能與血液中的鈣離子結(jié)合成為螯合物，從而阻止血液凝固，全血抗凝后用一般血常規(guī)檢驗(yàn)的血細(xì)胞分析儀檢測(儀器法)。2.4.4.1.1試劑配制乙二胺四乙酸二鉀（EDTA·K2·2H2O，MW404.47）,稱量8mg EDTA·K2加純凈水至100ml制成抗凝劑，50l抗凝劑可抗凝1ml小鼠全血。1.52.2mg的EDTA·K2可阻止1

8、ml血液凝固。2.4.4.1.2 采血 以摘除小鼠眼球的方法采集全血，采用干凈無菌的眼科鑷子摘取小鼠一側(cè)或雙側(cè)眼球，讓血液自由滴入裝有抗凝劑的1.5ml離心管（或商品化的抗凝管）中，采血過程中不斷混勻血液與抗凝劑防止血液凝固，每只動物采集抗凝全血約1ml。2.4.4.1.3 檢測分析 上機(jī)前血液顛倒混勻，注意檢查是否存在凝塊。在24h內(nèi)以全血細(xì)胞分析儀檢測血液紅Hb。上機(jī)操作參照儀器說明書。2.4.4.2組織中過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量測定2.4.4.2.1 原理MDA（malondiadehycle）是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一，測其含量可間接估計(jì)脂質(zhì)過氧化的程度。1個(gè)丙二醛（

9、MDA）分子與2個(gè)硫代巴比妥酸（TBA）分子在酸性條件下共熱，形成粉紅色復(fù)合物。該物質(zhì)在波長532nm有極大吸收峰。可用分光光法進(jìn)行測定。2.4.4.2.2試劑0.2M乙酸鹽緩沖液 pH3.50.2M乙酸溶液 185mL0.2M乙酸鈉溶液 15mL1mmol/L四乙氧基丙烷（貯備液，4保存3個(gè)月），臨用前用水稀釋成40nmol/mL8.1%十二烷基硫酸鈉SDS0.8%硫代巴比妥酸TBA0.2M磷酸鹽緩沖液 pH7.40.2M磷酸氫二鈉 1920mL0.2M 磷酸二氫鉀 480mL2.4.4.2.3 實(shí)驗(yàn)步驟2.4.4.2.3.1 樣品制備組織勻漿樣品：取一定量的大腦組織，生理鹽水沖洗、拭干、稱

10、重，置勻漿器中，加入0.2M磷酸鹽緩沖液，以20000r/min勻漿10s，間歇30s，反復(fù)進(jìn)行3次，制成10組織勻漿（W/V），3000r/min離心510min，取上清液待測。2.4.4.2.3.2樣品測定試劑空白管樣品管標(biāo)準(zhǔn)管10腦組織勻漿0.2mL40nmol/mL四乙氧基丙烷0.2mL8.1%SDS0.2mL0.2mL0.2mL0.2M乙酸鹽緩沖液 1.5mL1.5mL1.5mL0.8%TBA1.5mL1.5mL1.5mLH2O0.8mL0.7mL0.7mL混勻，避光沸水浴60min，流水冷卻，于532nm比色注：如用試劑盒，可按試劑盒的操作要求進(jìn)行2.4.4.2.3.3計(jì)算 B -

11、 A B- A 1過氧化脂質(zhì)含量 ×C×K = ×40× （nmol/mg組織） F - A F - A 0.2×10%×1000A: 空白管吸光度B：樣品管吸光度F：四乙氧基丙烷吸光度C：四乙氧基丙烷濃度（40nmol/mL）K：稀釋倍數(shù)2.4.4.3 組織中總抗氧化能力（T-AOC）測定方法2.4.4.3.1 原理機(jī)體中有許多抗氧化物質(zhì)，能使Fe2+還原成Fe3+，后者可與菲啉類物質(zhì)形成穩(wěn)定的橙黃色絡(luò)合物，通過在520nm比色可測出其抗氧化能力的高低。2.4.4.3.2 試劑采用商品試劑盒：抗氧化能力（T-AOC）測定試劑盒。2.

12、4.4.3.3 樣品制備準(zhǔn)確稱取腦組織重量，按重量體積比加9倍生理鹽水，以20000r/min勻漿10s，間歇30s，反復(fù)進(jìn)行3次，制成10組織勻漿（W/V），20002500r/min離心10min，取上清液待測。同時(shí)用雙縮脲試劑測定10%腦組織勻漿蛋白。2.4.4.3.4 樣品測定：按試劑盒的操作要求進(jìn)行。如：試劑對照管（mL）樣品管（mL）10腦組織勻漿*試劑一1.01.0試劑二2.0mL2.0mL試劑三應(yīng)用液 0.5mL0.5mL漩渦混勻器充分混勻，37水浴30分鐘試劑四0.2mL0.2mL待測樣本*試劑五0.2 mL0.2 mL混勻，放置10分鐘，蒸餾水調(diào)零1cm光徑，520nm測各

13、管吸光度。* 參考取樣量：10%組織勻漿參考取樣量：0.10.2ml2.4.4.3.5計(jì)算 ODU-ODC 總抗氧化能力 ÷30×N÷Cprot （單位/mg蛋白） 0.01 ODU: 測定管吸光度ODC：對照管吸光度N：反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)（反應(yīng)液總體積/取樣量）Cprot：稀釋倍數(shù)待測樣本蛋白濃度（mg/ml）2.5 數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。方差齊，計(jì)算F值，F(xiàn)值< F0.05，各組均數(shù)間差異無顯著性；F值>F0.05，用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞?/p>

14、轉(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。2.6 結(jié)果判定模型對照組與陰性對照組比較， Hb、MDA升高、T-AOC含量降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義（P<0.05），表示模型成立。在模型成立的前提下，受試樣品組MDA含量降低或T-AOC含量升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且Hb210g/L，判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。注: 紅細(xì)胞增多癥評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參考值Hb210g/L。3 亞硝酸鈉中毒缺氧實(shí)驗(yàn) 3.1 原理亞硝酸鈉使二價(jià)鐵血紅蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)槿齼r(jià)鐵血紅蛋白，生成高鐵血紅蛋白（MetHb），破壞血紅蛋白攜氧能力，造成組織細(xì)胞缺

15、氧，隨著亞硝酸鈉劑量的增加，MetHb含量增加，導(dǎo)致組織缺氧直至死亡。3.2 實(shí)驗(yàn)動物推薦使用近交系成年雄性小鼠，體重1822g，每組1015只。3.3 材料 亞硝酸鈉, 20l毛細(xì)管, 1ml注射器 ，秒表。3.4 劑量分組實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)劑量組和一個(gè)陰性對照組，以人體推薦量的10倍為其中的一個(gè)劑量組，另設(shè)兩個(gè)劑量組。受試樣品給予時(shí)間30天。3.5缺氧損傷實(shí)驗(yàn)3.5.1 實(shí)驗(yàn)步驟各劑量組經(jīng)口給予不同濃度受試樣品，陰性對照組按等同容量灌胃給予溶劑，連續(xù)30天,于末次給樣后1小時(shí)，各組按80100mg/kg BW劑量腹腔注射亞硝酸鈉（注射量為0.1ml/10g BW），1h、2h各采血一次，測全血高鐵

16、血紅蛋白(MetHb)含量。3.5.2全血高鐵血紅蛋白(MetHb)含量測定方法(參照GB 87881988高鐵血紅蛋白定量測定法)3.5.2.1原理 高鐵血紅蛋白在波長630nm處有一特有的吸收光帶，當(dāng)加入氰化物后，高鐵血紅蛋白即轉(zhuǎn)化為氰化血紅蛋白，此吸收光帶亦隨即消失。因此加入氰化物前后用分光光度計(jì)（或光電比色計(jì)）測定其吸光度之差，按標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算高鐵血紅蛋白的含量。3.5.2.2試劑1/15M磷酸氫二鈉溶液：準(zhǔn)確稱取Na2HPO4·12H2O 23.87g，用蒸餾水溶解稀釋至1L。1/15M磷酸二氫鉀溶液：準(zhǔn)確稱取KH2PO4 9.07g，用蒸餾水溶解稀釋至1L。1/60MpH6.6

17、磷酸鹽緩沖液：量取1/15M磷酸氫二鈉溶液3.75ml，1/15M磷酸二氫鉀溶液6.25ml，蒸餾水30m1，混合后即可使用（此液用時(shí)配制）。5（W/V）氰化鉀（鈉）溶液。5（W/V）高鐵氰化鉀溶液。1triton X100（辛烷基酚聚氧乙烯醚）溶液。3.5.2.3 操作步驟取2支小試管，以 “A” 、“B” 編號，各加1/60M pH6.6磷酸鹽緩沖液4.5ml，被檢查末梢血40l，0.5ml 1triton X100?！癆” 管于630nm波長，以磷酸鹽緩沖液或蒸餾水調(diào)零測得吸光度為D1后，加入5氰化鉀（鈉）溶液50l，混勻，放置2min，以同樣波長測得吸光度為D2。 “B” 管加入5高鐵

18、氰化鉀溶液50l，在25min后，在630nm波長處測得吸光度為D3，然后加入5氰化鉀（鈉）液50l，混勻，放置2min，以同樣波長測得吸光度為D4。3.5.2.4 計(jì)算方法 D1D2高鐵血紅蛋白/總血紅蛋白(%) - × 100 D3D43.5.2.5 方法說明高鐵血紅蛋白形成后，由于紅細(xì)胞中還原酶的存在，可使高鐵血紅蛋白逐漸還原消退，因此必須立即采樣，若現(xiàn)場不能分析，可將抗凝血直接采于緩沖液內(nèi)，貯存在24冰壺內(nèi)（保存期不超過10h），帶回實(shí)驗(yàn)室測定?？鼓齽┮愿嗡貫榧?，禁用草酸鹽，因其會導(dǎo)致高鐵血紅蛋白生成。本法必須使用分辨能力強(qiáng)的分光光度計(jì)，而且在使用前必須校驗(yàn)分光器的波長是否準(zhǔn)

19、確。全血在加入試劑后，血細(xì)胞破壞。由于少量碎片的存在，使溶液發(fā)生混濁，影響吸光度（尤其是正常人會出現(xiàn)負(fù)值），使用非離子表面活性劑triton X100稀釋液，或經(jīng)過離心步驟可克服血紅蛋白的混濁。3.6 缺氧存活實(shí)驗(yàn)3.6.1 實(shí)驗(yàn)步驟各劑量組經(jīng)口給予不同濃度受試樣品，陰性對照組按等同容量灌胃給予溶劑，連續(xù)30天,于末次給樣后1小時(shí)，各組按200240mg/kg BW劑量腹腔注射亞硝酸鈉（注射量為0.1ml/10g），立即計(jì)時(shí)，記錄動物存活時(shí)間。3.7 統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。方差齊，計(jì)算F值，F(xiàn)值< F0.05，各組均數(shù)間差異無顯著性；F值>

20、;F0.05，用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。3.8結(jié)果判定亞硝酸鈉中毒缺氧實(shí)驗(yàn)：缺氧損傷實(shí)驗(yàn)、缺氧存活實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽性可判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。其中受試樣品組MetHb含量在1h和2h任一時(shí)點(diǎn)的降低與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，判定缺氧損傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。受試樣品組與對照組比較，存活時(shí)間延長，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則判定缺氧存活實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。4 提高缺氧耐受力結(jié)果斷定:常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)、常壓缺氧模型實(shí)驗(yàn)和亞硝酸鈉缺氧實(shí)驗(yàn)中的

21、任二項(xiàng)陽性，可判定受試樣品具有提高缺氧耐受力功能作用。- 15 -提高缺氧耐受力功能評價(jià)方法修訂說明一、承擔(dān)單位廣東省疾病預(yù)防控制中心為主要承擔(dān)單位。任務(wù)來源于國家食品藥品監(jiān)督管理局保健食品化妝品監(jiān)管司的委托，對保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范（2003年版）中“提高缺氧耐受力功能評價(jià)程序和檢驗(yàn)方法”進(jìn)行修訂。二、主要工作過程國家食品藥品監(jiān)督管理局保健食品化妝品監(jiān)管司于2009年4月召開了“保健食品功能評方法及有關(guān)程序修訂”課題協(xié)作組工作會議，參會的有中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與食品安全所、廣東省疾病預(yù)防控制中心、上海市疾病預(yù)防與控制中心、北京市疾病預(yù)防控制中心、四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院、中國中醫(yī)研究

22、院東直門醫(yī)院和國家食品藥品監(jiān)督管理局保健食品審評中心的專家近15人，會上對“保健食品功能評價(jià)方法及有關(guān)程序修訂”修訂的原則和框架作了充分的討論，又分別征求了相關(guān)專家對修訂內(nèi)容的意見。為了做好本次檢驗(yàn)方法的修訂工作，廣東省疾病預(yù)防控制中心成立了“提高缺氧耐受力功能評價(jià)和檢驗(yàn)方法”修訂的起草工作小組，經(jīng)查閱國內(nèi)外相關(guān)資料，參考國家食品藥品監(jiān)督管理局保健食品化妝品監(jiān)管司召開的工作會議的精神，咨詢有關(guān)專家和實(shí)驗(yàn)室同行的意見和建議，形成了本次任務(wù)的工作方案，總體上要提高檢驗(yàn)方法的科學(xué)性、準(zhǔn)確性和客觀性，提高保健食品功能的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)；修訂的方法要與當(dāng)前國內(nèi)外研究的理論基礎(chǔ)相一致。本次修訂在去除“急性腦缺血性

23、缺氧模型”的基礎(chǔ)上，新增“常壓缺氧”模型，并改良“亞硝酸鈉中毒存活模型”，以反映保健食品對缺氧耐受力功能的輔助保護(hù)作用。經(jīng)過起草工作小組開展的大量條件探索和實(shí)驗(yàn)方法研究，對各種實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了比較和取舍，形成了修訂初稿后，起草工作小組召開了多次專家研討會，征求專家意見，對初稿進(jìn)行了反復(fù)修改，形成征求意見稿。方法驗(yàn)證工作由廣東省疾病預(yù)防控制中心、湖南省疾病預(yù)防控制中心、湖北省疾病預(yù)防控制中心、福建省疾病預(yù)防控制中心分別進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。在此基礎(chǔ)上，征集、整理和歸納了相關(guān)意見。國家食品藥品監(jiān)督管理局保健食品化妝品監(jiān)管司于2010年8月再次召開了“保健食品功能評價(jià)方法及有關(guān)程序修訂”課題協(xié)作組工作會議，參

24、會的有中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與食品安全所、廣東省疾病預(yù)防控制中心、上海市疾病預(yù)防與控制中心、北京市疾病預(yù)防控制中心、四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院、中國中醫(yī)研究院西苑醫(yī)院的專家近10人，會上針對驗(yàn)證過程中存在的技術(shù)問題及可操作性作了充分討論并提出修改意見，起草工作小組根據(jù)會議精神對修訂方案做了進(jìn)一步完善，綜合了方法驗(yàn)證單位的意見后形成了征求意見稿。2011年7月22日國家食品藥品監(jiān)督管理局保健食品化妝品監(jiān)管司在北京宣武門商務(wù)酒店召開了“保健食品功能評價(jià)方法及有關(guān)程序修訂”定稿專家研討會，參會的有中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與食品安全所、北京大學(xué)、廣東省疾病預(yù)防控制中心、北京市疾病預(yù)防控制中心、上海市疾

25、病預(yù)防控制中心、中國中藥研究院、中國中醫(yī)研究院西苑醫(yī)院、北京醫(yī)院、國家食品藥品監(jiān)督管理局保健食品審評中心的專家14人，會上對修訂后的“提高缺氧耐受力功能評價(jià)和檢驗(yàn)方法”的科學(xué)性、客觀性和可操作性給予肯定，并提出修改意見，對征求意見稿做了進(jìn)一步完善。三、編制原則1、總原則，提高保健食品“提高缺氧耐受力功能檢驗(yàn)方法”的科學(xué)性、準(zhǔn)確性和規(guī)范性，適應(yīng)當(dāng)前法規(guī)對加強(qiáng)保健食品監(jiān)管的要求。2、要符合當(dāng)前缺氧損傷的基礎(chǔ)理論，既考慮原規(guī)范合理的方法，又要提高保健食品功能檢驗(yàn)的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，選擇保留、改良或新增加的指標(biāo)要在國內(nèi)外已經(jīng)廣泛應(yīng)用并得到普遍的認(rèn)可，可以反映保健食品的對缺氧損傷的輔助保護(hù)作用。3、在撰寫過程中

26、，注意科學(xué)性、合理性、和適用性。四、確定相關(guān)技術(shù)內(nèi)容及新舊方法的對比編號原方法現(xiàn)方法修訂理由序號內(nèi)容序號內(nèi)容12亞硝酸鈉中毒存活實(shí)驗(yàn)常壓缺氧模型實(shí)驗(yàn)增加常壓缺氧模型22.1原理在總大氣壓不變的情況下，降低空氣中氧的百分含量，組織細(xì)胞不能從血液中獲得充足的氧而進(jìn)行正常的氧化代謝，影響動物的各項(xiàng)生理功能。常壓缺氧模型的機(jī)理32.2材料2.2.1常壓缺氧儀、血球計(jì)數(shù)儀、酶標(biāo)儀42.3實(shí)驗(yàn)動物2.2.2增加“建議使用雄性”雄性實(shí)驗(yàn)動物對缺氧更敏感些52.4劑量分組2.2.3實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)劑量組、一個(gè)模型對照組和一個(gè)溶劑對照組，以人體推薦量的10倍為其中的一個(gè)劑量組，另設(shè)兩個(gè)劑量組，受試樣品給予時(shí)間為30天。62.5實(shí)驗(yàn)步