western blot 指南

1、 近紅外雙色激光成像系統(tǒng)Western Blot Protocol(中文版基因有限公司 2007年 1月目 錄 . 需要的試劑 . - 1 - . Western檢測(cè)方法 . - 2 - . 雙色檢測(cè)指南 . - 4 - . 膜的 Stripping . - 4 - . Western檢測(cè)優(yōu)化 . - 5 - . 常用提示 . - 6 - . 考馬斯亮藍(lán)染色蛋白凝膠檢測(cè) . - 6 - . 常見(jiàn)問(wèn)題 . - 7 - . 需要的試劑zNC (硝酸纖維素膜或 PVDF 膜zOdyssey 封阻液(Li-COR, Cat.#927-40000z一抗z近紅外染料標(biāo)記的二抗(Li-COR *zTween

2、 ®-20zPBS 洗脫液z雙蒸水z潤(rùn)濕 PVDF 膜的甲醇zSDS (如果需要的話z其他的封阻液(如果需要的話* IRDyeTM 800CW染料標(biāo)記的二抗也可以從 Rockland 采購(gòu), Alexa Fluor® 680染料標(biāo)記的二抗也可以從 Invitrogen 采購(gòu)。Odyssey 系統(tǒng)上適用的熒光染料: 有關(guān)適用染料的最新信息請(qǐng)查詢 Li-COR 的網(wǎng)站。 . Western檢測(cè)方法NC 膜和 PVDF 膜都可以做蛋白印跡,但是 NC 膜效果更佳。能夠使用純硝酸纖維素更 好。按照標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)⒌鞍讖哪z轉(zhuǎn)到膜上,轉(zhuǎn)移模時(shí)只能使用鑷子夾住邊緣。轉(zhuǎn)膜后,按照如下步驟操作:

3、1. 將膜在 PBS 中潤(rùn)濕幾分鐘。 如果使用 PVDF 膜, 先要在 100%甲醇溶液中迅速預(yù)濕,再放入 PBS 之前先浸入雙蒸水里。注意 :z但多數(shù)鋼筆墨水或記號(hào)筆在 Odyssey 下有熒光, 墨水被洗掉然后又再到處沉淀在膜上, 產(chǎn)生大斑點(diǎn)和條紋, 使用鉛筆或 Odyssey 專用的記號(hào)筆可避免該問(wèn)題。 PVDF 膜只能使用鉛筆(潤(rùn)濕在甲醇中,墨水會(huì)被洗脫下來(lái)2. Odyssey 封阻液封阻膜 1小時(shí), 保證有足夠的封阻液以完全淹沒(méi)膜(建議最少 0.4 ml/cm2注意:z必要時(shí),封阻也可以在 4過(guò)夜完成z封阻時(shí) 切勿 加入 Tween-20, 在未結(jié)束封阻之前膜不能和 Tween-20

4、有任何接觸,否則會(huì)造成背景過(guò)高z使用 Odyssey 封阻液往往比其他封阻液得到的結(jié)果靈敏度更高。 脫脂奶粉或干酪素溶于 PBS 也可以作為封阻液和抗體的稀釋溶液,但是脫脂奶粉對(duì) PVDF 膜會(huì)造成較高的背景, 如果使用 0.1%的干酪素溶液 , 建議溶于 0. 2×PBSz當(dāng)使用抗羊的抗體, 則脫脂奶粉溶液會(huì)影響檢測(cè), 而且在 4條件下腐敗的速度也很快,因此被稀釋保存或重復(fù)使用不呼超過(guò)幾天zOdyssey 封阻液與 PBS 1:1稀釋不會(huì)影響檢測(cè)zOdyssey 封阻液可被保存、重復(fù)使用z含有 BSA 的封阻液,但是有些情況下會(huì)造成膜的背景過(guò)高。因此不推薦使用含 BSA 的封阻液,

5、除非一抗專門要求使用 BSA 作為封阻液3. 用 Odyssey 封阻液稀釋一抗,最佳稀釋比率取決于所用抗體和經(jīng)驗(yàn),推薦開(kāi)始的范圍在 1:1000 1:5000。為了降低背景,在孵育之前稀釋抗體時(shí)加入 0.1-0.2%的 Tween 20, Tween-20的最佳濃度也決定于抗體。注意:z雙色檢測(cè)要求抗體來(lái)源于不同的宿主, 如兔和鼠。 詳細(xì)信息請(qǐng)參考 . 雙色檢測(cè)指南4. 室溫下,孵育一抗 60 min或更長(zhǎng)時(shí)間并緩慢搖動(dòng)(一抗不同孵育最佳時(shí)間也不同 ,使用足夠的抗體溶液以覆蓋整張膜。5. 室溫下用足量的 PBS + 0.1% Tween-20溶液輕柔洗膜 4次,每次 5 min 。6. 用

6、Odyssey 封阻液稀釋紅外染料標(biāo)記的二抗, 避免裝有二抗的試劑瓶長(zhǎng)時(shí)間見(jiàn)光。推薦稀釋比率為 1:15,000(建議稀釋范圍:1:5,000 1:25,000 。與稀釋一抗一樣,二抗稀釋時(shí)也加入 Tween-20。如果需要也可加入 SDS ,但請(qǐng)注意下文提示。注意:z檢測(cè)量少的蛋白,則需要的二抗稍多(1:5,000 1:10,000z千萬(wàn)注意,切勿污染二抗試劑瓶z稀釋的二抗可在 4避光保存并重復(fù)使用。 但是為了得到最佳的靈敏度和效果,最好使用新鮮的二抗稀釋溶液z稀釋二抗時(shí)加入 0.01% - 0.02% SDS(也加 Tween-20可以降低背景,特別是使用 PVDF 膜時(shí)。但是,切勿在封阻

7、或稀釋一抗時(shí)加入 SDS 。請(qǐng)見(jiàn) .Western 檢測(cè)優(yōu)化 ,為什么、怎樣使用 SDS 稀釋二抗。7. 室溫條件下輕搖孵育二抗 30-60 min,此期間避光操作。注意:z孵育超過(guò) 60 min可能會(huì)增加背景8. 室溫下用足量的 PBS + 0.1% Tween-20溶液輕柔洗膜 4次,每次 5 min 。避光操作。9. 用 PBS 沖洗去除 Tween-20。這時(shí)膜已可以準(zhǔn)備掃描。注意:z選擇合適的通道掃描(見(jiàn) .需要的試劑 z掃描前,膜避光保存z如果準(zhǔn)備做 stripping 或再次使用,要保持膜濕潤(rùn),如果膜一旦干燥,則stripping 的效果將會(huì)降低z如果需要掃描前膜可以干燥,干膜的

8、信號(hào)可能更強(qiáng)。掃描后抹還可以再次被潤(rùn)濕z避光條件下,膜上的熒光信號(hào)可以保持?jǐn)?shù)月或更長(zhǎng)。膜可干燥保存也可在 PBS 緩沖液內(nèi) 4保存。z如果膜上的信號(hào)過(guò)強(qiáng)或過(guò)弱,重新掃描的時(shí)候相應(yīng)地調(diào)低或調(diào)低掃描亮度分子量 Marker若在凝膠電泳時(shí)用的是 Odyssey 預(yù)染分子量 Marker (LI-COR , 則在 700通道可見(jiàn), 600通道也可以看見(jiàn)淡信號(hào)非常微弱。如果 Marker 被數(shù)次反復(fù)凍融,則會(huì)降解,則在 800通道 出現(xiàn)數(shù)條高分子量條帶,出現(xiàn)這種情況請(qǐng)換用新的 Marker 。其他來(lái)源的藍(lán)色預(yù)染分子量 Marker 也可用于 Odyssey 。僅需使用常用量 1/3,若是用量 過(guò)大則分子

9、量條帶過(guò)強(qiáng),則會(huì)影響樣品泳道的成像。如果使用彩色 Marker ,一些條帶可能 不會(huì)在 Odyssey 上被看到。優(yōu)化提示嚴(yán)格遵循此 protocol每對(duì)抗體 -抗原最佳的封阻液是不同的。某些一抗可能在不同的封阻液中降低信號(hào)或非 特異條帶。 如果檢測(cè)蛋白出現(xiàn)困難, 或許更換封阻液會(huì)得到意外的結(jié)果。 如果某種封阻 液用化學(xué)發(fā)光方法可行的話,則在 Odyssey 上繼續(xù)使用它加入像 Tween-20的去垢劑可降低背景和非特異條帶。詳細(xì)內(nèi)容請(qǐng)參考 . Western檢測(cè)優(yōu)化為了避免膜上出現(xiàn)斑點(diǎn), 使用前后雙蒸水浸泡塑料托盤(pán)并配制緩沖液, 切勿將膜放入接 觸過(guò)考馬斯亮藍(lán)的容器移動(dòng)膜時(shí)只能是用鑷子夾住其

10、邊緣在將膜放入或取出抗體孵育溶液之后, 用雙蒸水或乙醇徹底清洗鑷子, 否則會(huì)在墨背景 上造成難以去除的斑點(diǎn)或條紋掃描時(shí), 首先要擦干凈 Odyssey 掃描面板上的灰塵或殘骸等, 這些污物影響成像質(zhì)量或 污染膜, 如果在膜上使用硅樹(shù)脂墊子, 則要將與膜接觸的一面弄干凈, 否則灰塵或其他 雜物會(huì)落在膜上,切勿使用紙巾擦試墊子,否則會(huì)產(chǎn)生更多的斑點(diǎn)掃描時(shí)不要使用塑料包裹膜如果準(zhǔn)備做 Stripping ,則千萬(wàn)不能膜變干燥,膜變干燥或局部出現(xiàn)干燥都會(huì)降低 Stripping 的效率 . 雙色檢測(cè)指南利用紅外染料標(biāo)記的抗體在不同的信號(hào)通路 (700通道和 800通道 , 同一張膜上的兩種 不同抗原可

11、同時(shí)被檢測(cè)到。雙色檢測(cè)需要仔細(xì)選擇一抗和二抗。下述指南有助于雙色檢測(cè)試驗(yàn)的設(shè)計(jì):兩種一抗的種屬來(lái)源要不同, 這樣才二抗的特征才能有所區(qū)別 (例如來(lái)源于兔和鼠的一 抗分別需要抗兔和抗鼠的二抗來(lái)匹配在組合雙色試驗(yàn)的一抗之前, 往往需要對(duì)每個(gè)一抗單獨(dú)在膜上檢測(cè), 看是否出現(xiàn)預(yù)期的 條帶和可能低背景條帶。 輕微的交叉反應(yīng)會(huì)在兩種抗體間發(fā)生, 這就使檢測(cè)的問(wèn)題更復(fù) 雜, 特別是抗原量比較大的情況下。 如果出現(xiàn)交叉反應(yīng), 則減小蛋白的上樣量或減小抗 體的用量一個(gè)抗體標(biāo)記 700通道的染料,則另一個(gè)抗體只能標(biāo)記 800通道的雙色檢測(cè)優(yōu)先選用高交聯(lián)吸附力的二抗,否則會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)為了不影響雙色檢測(cè),避免兩種分

12、別來(lái)源于親緣關(guān)系太近的小鼠和大鼠的一抗同時(shí)使 用,如果不得不這么使用的話,必須先做每種抗體的單色檢測(cè),確定出現(xiàn)預(yù)期的帶形 如果可能,二抗應(yīng)該選擇來(lái)源于同一宿主(例如,羊抗鼠和羊抗兔以減小二抗之間的 反應(yīng)。因?yàn)槎共粫?huì)識(shí)別來(lái)源于其他種屬的免疫球蛋白。如果進(jìn)行雙色檢測(cè),則遵循標(biāo)準(zhǔn)的 Western protocol并有以下區(qū)別:z第 3步,在抗體稀釋緩沖液中混合兩種一抗,同時(shí)與膜孵育(第 4步 。一抗 必須 來(lái)源 于不同宿主z第 6步,在抗體稀釋緩沖液中混合染料標(biāo)記的兩種二抗,同時(shí)與膜孵育(第 7步 . 膜的 StrippingPVDF 膜可以 Stripping ,一般不使用 NC 膜。如果準(zhǔn)備

13、 Striping ,則膜成像前后以及成像過(guò)程中都不能干(盡可能保證膜的濕潤(rùn)狀態(tài) 。其他檢測(cè)方法中常用的 Stripping 技術(shù)在 Odyssey 上也可以使用。Stripping 緩沖液:25 mM pH2.0的甘氨酸 + 1-2% SDSStripping 程序:1. 室溫下在 Stripping 緩沖液中搖動(dòng)孵育 10-15 min2. 換掉 Stripping 緩沖液,再搖動(dòng)孵育 10-15 min3. 在 PBS + 0.1% Tween-20溶液中搖動(dòng)沖洗 5 min4. PBS 溶液浸泡后, 在 337 µm的分辨率下快速掃描看信號(hào)是否完全去除,如果仍信號(hào)殘留則重復(fù)上

14、述步驟,特別是強(qiáng)帶或抗體。經(jīng)常更換Stripping 緩沖液會(huì)有作用的。5. 當(dāng)做下次檢測(cè)時(shí),重新封阻 30-60 min,并作后續(xù)的抗體孵育提示:如果膜被過(guò)度剝離,會(huì)造成目標(biāo)蛋白丟失,掃描膜看 stripping 是否完全,如果出現(xiàn)過(guò) 度剝離,則減小 Stripping 緩沖液中的 SDS 用量根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的強(qiáng)度,決定 stripping 的強(qiáng)度,如果很強(qiáng),則可以通過(guò)把 SDS 濃度 從 1%提高至 1.5-2%,或者預(yù)熱 stripping 緩沖液至 65,把熱緩沖液倒入在室溫下?lián)u 動(dòng),也可使用恒溫?fù)u床。如果溫度提高,則需要經(jīng)常掃描,檢查是否過(guò)度剝離 . Western檢測(cè)優(yōu)化當(dāng)從原有

15、的 Western 方案向 Odyssey 轉(zhuǎn)換時(shí),或使用一個(gè)新的一抗時(shí),一抗?jié)舛鹊膬?yōu)化 尤為重要,以達(dá)到的靈敏度和穩(wěn)定性。3個(gè)因素需要優(yōu)化:一抗?jié)舛取⑷玖蠘?biāo)記的二抗?jié)舛?、抗體稀釋液內(nèi)的去垢劑濃度。一抗?jié)舛纫豢乖谫|(zhì)量、親和力和濃度上存在較大的差異。正常工作濃度范圍取決于所用一抗的特 性和目標(biāo)抗原的量。建議稀釋比率為 1:500、1:1500和 1:10,000(開(kāi)始可參照以前化學(xué)發(fā) 光法的濃度 。優(yōu)化一抗的濃度將其效果發(fā)揮到最大并妥善保存。二抗?jié)舛冉ㄗh稀釋比率為 1:5000、1:10,000和 1:20,000。二抗的用量與被待檢測(cè)抗原的多少密 切相關(guān)如果被檢測(cè)蛋白量越大,則需要的抗體量就越

16、小去垢劑濃度稀釋抗體時(shí)加入去垢劑可有效降低膜上的背景。由于使用的抗體、膜和封阻液的種類不 同,去垢劑的濃度也不同。有些一抗與抗原結(jié)合的不是很牢,過(guò)多的去垢劑會(huì)降之洗掉。在 封阻未結(jié)束之前,不要讓去垢劑與膜接觸,否則背景會(huì)很高。Tween-20z在未結(jié)束封阻之前,不能出現(xiàn) Tween-20z用封阻液稀釋一抗和二抗時(shí)均加入 Tween-20。建議, NC 膜最終濃度為 0.1-0.2%, PVDF 膜為 0.1%(濃度太高則背景也高z洗脫液內(nèi)含 0.1%Tween-20SDS :z二抗稀釋液中加入 0.01 - 0.02%的 SDS 可顯著降低整章膜的背景,并減少或消除非 特異條帶。但很重的一點(diǎn)就

17、是用量要少,作為一種離子去垢劑 SDS 的用量在檢測(cè)任 何步驟使用過(guò)量,都會(huì)破壞抗原 -抗體反應(yīng)。z對(duì) PVDF 膜降低背景更有效z封阻或稀釋一抗時(shí)切勿加入 SDS 。 一抗孵育時(shí)如果存在 SDS 則會(huì)大大降低信號(hào)強(qiáng)度。 只能在稀釋二抗時(shí)加入 SDS 。z封阻液稀釋二抗時(shí),可 同時(shí) 加入 0.1 0.2%的 Tween 和 0.01 0.02%的 SDS 。 z洗脫液只能包含 0.1% Tween-20,但決不能有 SDSz某些抗體 -抗原反應(yīng)對(duì) SDS 非常敏感,允許的濃度非常低(小于 0.01% ?？捎玫味?法測(cè)定最佳濃度。 . 常用提示封阻未結(jié)束之前切勿將膜與 Tween-20接觸,否則

18、膜背景會(huì)過(guò)高牛奶封阻液可能會(huì)含有 IgG 而與羊抗的抗體反應(yīng),會(huì)顯著增加背景和降低信號(hào)為延長(zhǎng)封阻液使用時(shí)間或降低使用量:重復(fù)使用封阻液稀釋抗體;與 PBS 1:1稀釋;過(guò) 量使用的封阻液護(hù)守保存在 4數(shù)天(不要倒回原是試劑瓶,分開(kāi)保存抗體 4避光保存,切勿反復(fù)凍融,否則抗體性能會(huì)降低。減小見(jiàn)光時(shí)間,避免試劑抗 體試劑瓶,使用前快速稀釋。若抗體溶液出現(xiàn)微粒,則需要先離心再使用。二抗孵育和洗脫時(shí),盡可能避光操作做膠時(shí)選用齒最窄的梳子,以利用上樣后濃縮目標(biāo)蛋白試驗(yàn)中抗體抗原不同, 則最佳的轉(zhuǎn)膜條件、 膜和封阻試劑也有所不同。 如果出現(xiàn)背景高, 信號(hào)弱時(shí),最先要解決的就是換另一種封阻液為了達(dá)到最佳的靈

19、敏度,請(qǐng)使用 NC 膜微量的純化蛋白可能不能有效轉(zhuǎn)膜, 可以加一些相同分子量的非特異蛋白, 產(chǎn)生 “攜帶” 效果,提高轉(zhuǎn)膜效率對(duì)于 <100kDa的蛋白, 無(wú) SDS 的 Tri-甘氨酸緩沖液溶液中轉(zhuǎn)膜 (含 20%的甲醇 。 SDS 無(wú)論對(duì)于 PVDF 還是 NC 膜都會(huì)降低蛋白和膜的結(jié)合效率轉(zhuǎn)膜前先把膠浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中 10 - 20min,可以起到平衡凝膠并去除 SDS 的作用。 不會(huì)將 SDS 帶入轉(zhuǎn)膜槽中要最大化蛋白和膜的結(jié)合力,轉(zhuǎn)膜后可完全風(fēng)干膜(約 1-2h 切勿過(guò)封阻。長(zhǎng)時(shí)間封阻,尤其是用 2%或濃度更高的脫脂牛奶,會(huì)造成膜上目標(biāo)蛋的 損失(J. Immunol. Me

20、th. 122:129-135, 1989為了增強(qiáng)信號(hào),可嘗試延長(zhǎng)室溫下一抗的孵育時(shí)間或 4過(guò)夜 . 考馬斯亮藍(lán)染色蛋白凝膠檢測(cè)Odyssey 可以掃描考馬斯亮藍(lán)(甲醇溶和水溶染色的凝膠,可在 700通道成像, 800通 道有微弱信號(hào)。 Odyssey 較常規(guī)檢測(cè)靈敏度高,水溶的染色液靈敏度最高;水中對(duì)凝膠過(guò)夜 退色效果更好。凝膠檢測(cè)步驟:1. 在褪色液或水中完全浸泡凝膠去除染料顆粒,這些顆粒會(huì)造成像結(jié)果上出現(xiàn)斑點(diǎn)2. 將凝膠放在掃描面板上,不要產(chǎn)生氣泡?？捡R斯亮藍(lán)染色凝膠部建議使用硅樹(shù)脂墊子,因?yàn)橥耆サ魤|子上的污物有些困難3. 通道掃描凝膠。焦距是凝膠厚度的 1/2(即 1mm 厚的凝膠,

21、焦距設(shè)置為 0.5mm 4. 掃描結(jié)束后拿掉凝膠, 仔細(xì)清潔玻璃掃描面板,除去殘留污漬5. 如果仍出現(xiàn)條紋,用戴手套的手指無(wú)屑紙巾揩凝膠。制干膠也可以解決條紋問(wèn)題或在干膠溶液中洗膠不超過(guò) 5min 防止靈敏度降低。還可以使用 Odyssey 軟件中的 filter/noise消除功能以減小條紋(見(jiàn) Odyssey 使用指南 . 常見(jiàn)問(wèn)題問(wèn)題 可能原因 解決辦法封阻液中使用了 Tween-20 封阻之前膜不能和 Tween-20接觸封阻液中使用了 BSA 封阻液中含有 BSA 可導(dǎo)致高 背景, 加入 SDS 以降低背景或 更換封阻液未使用優(yōu)化的封阻試劑 比較不同的封阻液選擇最佳 的使用;延長(zhǎng)封阻

22、時(shí)間 NC 膜的背景 抗體稀釋液中加入 Tween-20降低背景。 加入 SDS 稀釋二抗 PVDF 膜的背景 抗體稀釋液中 Tween-20的濃 度降低至 0.1%。加入0.01-0.02%的 SDS 稀釋二抗 抗體濃度過(guò)高 優(yōu)化一抗和二抗的濃度 增加洗脫次數(shù)和緩沖液體積 洗脫不足確定緩沖液內(nèi)含 0.1%的 Tween-20,必要時(shí)也可增加。 過(guò)量的 Tween-20(0.5-1% 也 會(huì)降低信號(hào)緩沖液內(nèi)的雜物和抗體交叉 反應(yīng) 將牛奶換成 Odyssey 封阻液。 牛奶中可能存在的 IgG 會(huì)與 羊抗的二抗交叉反應(yīng)高背景、不規(guī)則分布抗體體積不足 使用足夠體積的抗體使膜一時(shí)也可使用熱密封袋 。

23、切勿 使膜任何位置干燥抗體體積不足(接上頁(yè) 在搖床上孵育高背景、不規(guī)則分布(接上 頁(yè)膜污染小心使用鑷子移動(dòng)膜。 膜不能 干燥。 使用干凈的盒子、 袋子 或托盤(pán)小體積體系內(nèi)同時(shí)封阻多張 膜多張膜同時(shí)封阻時(shí), 使用足夠 體積的緩沖液, 膜可自由移動(dòng) 并完全被液體淹沒(méi)膜一直處于潤(rùn)濕狀態(tài), 如果膜 要重復(fù)使用或作剝離則這一 點(diǎn)很重要膜未完全潤(rùn)濕或出現(xiàn)局部干 燥若使用 PVDF 膜,則需要先用 100%的甲醇潤(rùn)濕在鑷子從抗體溶液拿出后仔 細(xì)清洗, 特別是染料標(biāo)記的二 抗溶液。 臟鑷子會(huì)在膜上留下 不能洗掉的染料沉淀 鑷子或盤(pán)子已被污染孵育時(shí), 使用潔凈的盤(pán)子、 袋 子或托盤(pán)掃描面板或硅樹(shù)脂墊子不干 凈每

24、次使用時(shí)仔細(xì)清潔面版和 墊子。 灰塵、 碎屑或殘留物都 會(huì)在膜上造成條紋不合適記號(hào)筆或鋼筆在膜上 做記號(hào)只能使用鉛筆或 Odyssey 專用 記號(hào)筆在膜上標(biāo)記未使用最好的封阻試劑 使用不同封阻劑, 一抗的表現(xiàn) 也不同一抗結(jié)合力可能過(guò)低, 增加抗 體的量環(huán)更換其他來(lái)源的抗 體延長(zhǎng)一抗孵育時(shí)間(室溫 4-8小時(shí),或4過(guò)夜 增加一抗或二抗的用量并優(yōu) 化更換為其他可替代的二抗 抗體量不足一抗或二抗可能過(guò)保質(zhì)期或 保存不當(dāng)而失效去垢劑使用過(guò)量; 信號(hào)被洗脫 掉減少抗體稀釋液中的Tween-20和 /或 SDS 的含量。 推薦 SDS 濃度為 0.01 0.02%,某些抗體可能要求更 低的濃度背景出現(xiàn)不規(guī)

25、則的氣泡或條 紋蛋白上樣量過(guò)低提高上樣量, 制膠時(shí)使用齒最檢查轉(zhuǎn)膜緩沖液和轉(zhuǎn)膜步驟 蛋白轉(zhuǎn)膜質(zhì)量不高 蛋白轉(zhuǎn)膜質(zhì)量不高(接上頁(yè) 使用預(yù)染分子量 Marker 監(jiān)控轉(zhuǎn)膜。 轉(zhuǎn)膜后對(duì)凝膠染色, 確 保凝膠不能被著色 檢測(cè)過(guò)程中蛋白損失封阻時(shí)間太長(zhǎng)或抗體稀釋液 中去垢劑含量過(guò)高都會(huì)造成 膜上抗原的損失轉(zhuǎn)膜后膜完全風(fēng)干(1-2h , 將有助于不可逆轉(zhuǎn)的結(jié)合 加入 20%的甲醇也利于蛋白 與膜的結(jié)合。注意:甲醇會(huì)縮小凝膠的孔 徑, 因而可能會(huì)阻止大分量蛋 白的轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜緩沖液內(nèi)的 SDS 可能會(huì) 對(duì)膜上的蛋白造成干擾, 特別 是小分量的蛋白, 因而減小或 不用 SDS 。 注意:對(duì)某些蛋白 SDS 能提高

26、 轉(zhuǎn)膜效率背景出現(xiàn)不規(guī)則的氣泡或條 紋(接上頁(yè)轉(zhuǎn)膜過(guò)程中蛋白不能保留在 膜上小分量蛋白直接穿過(guò)膜, 則換 用孔徑較小的膜, 或縮短轉(zhuǎn)膜 時(shí)間降低抗體用量 縮短抗體孵育時(shí)間 抗體稀釋液中提高 Tween-20的用量抗體濃度太高 二抗稀釋液中增加或提高 SDS 用量未使用優(yōu)化的封阻液 更換封阻液核對(duì)一抗和二抗的來(lái)源和宿 主種屬(見(jiàn) . 雙色檢測(cè)指 南只使用高吸附的二抗 雙色檢測(cè)存在交叉反應(yīng)的可 能, 可減小二抗的用量降低發(fā) 生交叉反應(yīng)的幾率非特異或非目標(biāo)條帶雙色檢測(cè)中的交叉反應(yīng)盡可能避免同時(shí)使用抗小鼠 和抗大鼠的抗體, 由于種屬親 緣關(guān)系太近, 一定程度上抗小 鼠的抗體與大鼠的 IgG 會(huì)發(fā) 生反

27、應(yīng), 同樣的反應(yīng)也存在于 抗綿羊和抗山羊的抗體之間Odyssey Western Protocol 檢查所用的染料。像 Alexa Fluor 750熒光染料在兩個(gè)通 道之間都可發(fā)光, 不推薦使用 如果信號(hào)在一個(gè)通道很強(qiáng) (接 近或達(dá)到飽和 ,則可能會(huì)在 另一個(gè)通道有少量泄露, 調(diào)低 掃描亮度可解決此問(wèn)題 非特異或非目標(biāo)條帶(接上 頁(yè) 信號(hào)在兩個(gè)通道之間的泄露以后的實(shí)驗(yàn)可以降低蛋白上 樣量或抗體用量 近紅外雙色激光成像系統(tǒng)In-Gel Western Protocol(中文版基因有限公司 2007年 1月目 錄 . 所需試劑 . - 1 - . 描述 . - 1 - . 雙色 In-Gel W

28、estern蛋白檢測(cè)指南 . - 1 - . 電泳 . - 2 - . In-Gel Western檢測(cè) Protocol . - 2 - . 優(yōu)化 . - 3 - . Stripping和 Reprobing . - 3 - . 常見(jiàn)問(wèn)題 . - 4 - . 所需試劑Odyssey 試劑z近紅外染料標(biāo)記的二抗(LI-COR *其他試劑z電泳所用的 SDS 凝膠z50%異丙醇 + 5%乙酸(超純水配制z封阻液(5%BSAz一抗zTween-20zPBS 緩沖液z超純水* IRDyeTM 800CW染料標(biāo)記的二抗也可以從 Rockland 采購(gòu), Alexa Fluor® 680染料標(biāo)

29、記的二抗也可以從 Invitrogen 采購(gòu)。 . 描述Western 蛋白檢測(cè)需要電泳分離蛋白混合樣品,然后再將分離后的蛋白從凝膠轉(zhuǎn)到 NC 膜或 PVDF 膜上。 Odyssey 可以不需要轉(zhuǎn)膜而直接在凝膠中檢測(cè)蛋白,這個(gè)技術(shù)可大大節(jié)省 時(shí)間和費(fèi)用,而且還能消除轉(zhuǎn)膜、封阻過(guò)程中可變因素的影響。 In-Gel Western檢測(cè)僅需常 規(guī)的 Odyssey 試劑而無(wú)須特殊的試劑盒。電泳之后,凝膠在異丙醇乙酸溶液里簡(jiǎn)單固定之后,沖洗,然后和傳統(tǒng)的 Western 檢測(cè) 一樣,在凝膠上孵育、洗脫。濕膠直接在 Odyssey 上掃描。該過(guò)程無(wú)需底物、塑料包裹和曝 光底片。用 Odyssey 在凝膠

30、上還可以實(shí)現(xiàn)兩個(gè)蛋白的雙色檢測(cè)。In-Gel 檢測(cè)可以快速得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果,也能讓結(jié)果更準(zhǔn)確,因?yàn)楸苊廪D(zhuǎn)膜過(guò)程中蛋白的損 失等問(wèn)題。 如果目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)膜效果不好 (比如, 轉(zhuǎn)膜過(guò)程中, 大分子量蛋白很難從膜中轉(zhuǎn)出, 或小分子量蛋白穿過(guò)膜 , In-Gel 檢測(cè)避免這類問(wèn)題。然而重要的是請(qǐng)注意 In-Gel 檢測(cè)可能 不能作定量。 . 雙色 In-Gel Western蛋白檢測(cè)指南雙色檢測(cè)的抗體謹(jǐn)慎選擇是非常重要的,否則會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)。關(guān)于一抗和二抗的選擇 請(qǐng)參考以下指南:a. 兩個(gè)二抗要求必須是高吸附性的, 以消除交叉反應(yīng)b. 兩個(gè)一抗必須是來(lái)源于不同種屬的宿主, 這樣才可以被不同特性的二抗區(qū)分并識(shí)

31、別 (如,一抗來(lái)源于兔和小鼠的,可分別被抗兔和抗小鼠的二抗識(shí)別c. 兩個(gè)二抗必須來(lái)源于同一種屬的宿主 ,以避免二抗之間的交叉反應(yīng)。樣品中可能存 在的其他種屬免疫球蛋白是不會(huì)被二抗識(shí)別的d. 一個(gè)二抗標(biāo)記 IRDye 800的染料, 則另一個(gè)就要標(biāo)記 IRDye 680(或 Alexa Fluor 680、 Cy 5.5等e. 雙色檢測(cè)之前,先對(duì)每個(gè)抗體單獨(dú)作轉(zhuǎn)膜檢測(cè)看是否達(dá)到預(yù)期效果?？赡軙?huì)出現(xiàn)輕 微的交叉反應(yīng),特別是抗體用量過(guò)大時(shí),是檢測(cè)的問(wèn)題更復(fù)雜。如果確實(shí)存在交叉 反應(yīng),將降低蛋白的上樣量或抗體的用量。f. 為了取得最佳的結(jié)果,雙色檢測(cè)盡量避免同時(shí)使用來(lái)源于小鼠和大鼠的一抗。因?yàn)?親緣關(guān)

32、系太近,不可能完全避免交叉反應(yīng)。如果確實(shí)要同時(shí)使用這兩種一抗,則需 要先祖但通道檢測(cè)的預(yù)實(shí)驗(yàn)雙色檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方案的調(diào)整對(duì)于雙色外檢測(cè),請(qǐng)遵照下文的標(biāo)準(zhǔn)操作步驟并作如下的調(diào)整:1. 使用兩種染料標(biāo)記的二抗2. 確定抗體特性和宿主來(lái)源的合適性,以免出現(xiàn)交叉反應(yīng)3. 在第 5步,用抗體稀釋液混合兩種一抗,同時(shí)與凝膠孵育4. 在第 8步,用抗體稀釋液混合兩種二抗,同時(shí)與凝膠孵育 . 電泳1. 電泳分離目標(biāo)蛋白注意:z凝膠類型會(huì)影響 In-Gel Western檢測(cè)的成功和靈敏度。 因此需要對(duì)凝膠作 優(yōu)化z凝膠厚度和丙烯酰胺的濃度會(huì)影響抗體分子進(jìn)入凝膠。通常建議凝膠濃 度不高于 12%,厚度在 1-1.5m

33、mz不同預(yù)制膠的表現(xiàn)也有一定的差異。推薦 NOVEX Tris-glycine預(yù)制膠, 當(dāng)然,其他的預(yù)制膠也可以使用 . In-Gel Western檢測(cè) Protocol2. 電泳之后分開(kāi)兩塊玻璃板,濃縮膠(堆積膠可能會(huì)造成掃描時(shí)高背景。如果 出現(xiàn)疊加,可用手術(shù)刀切除濃縮膠,并且切一個(gè)角作為記號(hào)3. 異丙醇 + 5%乙酸(超純水配制中孵育凝膠 15min ,溶液足量保證凝膠被 完全淹沒(méi)病可自由移動(dòng),緩慢搖動(dòng)In-Gel Western Protocol 重要:凝膠輕拿輕放,積壓會(huì)在掃描圖像上出現(xiàn)斑點(diǎn)或指紋 4. 去掉異丙醇 /乙酸, 超純水洗 15分鐘并緩慢搖動(dòng)。 足量水保證凝膠完全淹沒(méi)且可

34、自由移動(dòng)。凝膠可能會(huì)卷曲并 /或浮在液面,輕輕鋪平凝膠或反轉(zhuǎn),保證液體完 全覆蓋凝膠。凝膠表面殘留的酒精會(huì)造成條帶擴(kuò)散提示:如果需要,可在這步暫停,在水中 4保存過(guò)夜 5. 只要還沒(méi)有開(kāi)始準(zhǔn)備孵育抗體就不要做封阻。在含有 0.1%Tween的 Odyssey 封阻液、 PBS 或 5%BSA(BSA 效果最好 中按照需要的濃度稀釋一抗。 由于 In-Gel Western 檢測(cè)的靈敏度不及標(biāo)準(zhǔn)的 Western 檢測(cè),一抗的用量應(yīng)較平時(shí)的量多一 些。確定凝膠被抗體稀釋溶液完全淹沒(méi)。緩慢搖動(dòng)孵育一抗 1h 6. 一抗孵育可延長(zhǎng)至 7h ,或 4過(guò)夜7. 在足量的 PBS + 0.1%Tween-

35、20緩慢搖動(dòng)分 3次洗膠 10min8. 在含有 0.1%Tween-20合適的封阻液中按 1:1000 1:5000的比例稀釋抗體, 緩慢搖動(dòng)凝膠上孵育二抗 1h ,避光操作。足夠的溶液已完全覆蓋凝膠 9. 在足量的 PBS + 0.1%Tween-20緩慢搖動(dòng)分 3次洗膠 10min 10. 中洗膠 5min11. 濕膠直接放在 Odyssey 系統(tǒng)掃描面板上,可直接掃描或塑料包裹防止凝膠干燥。焦距設(shè)置為凝膠厚度的 1/2。如果濃縮較未切除,可在掃描成像圖片后,用 Odyssey 軟件裁剪 12. 如果掃描背景過(guò)高,可將凝膠浸泡在 PBS 過(guò)夜之后再掃描。 4避光保存。在 4凝膠可被保存數(shù)

36、日 . 優(yōu)化對(duì)于您的目標(biāo)蛋白或凝膠, In-Gel Western protocol可能需要優(yōu)化。 然而, 無(wú)論怎樣, In-Gel Western 檢測(cè)的靈敏度都不及標(biāo)準(zhǔn)的 Western 檢測(cè)。轉(zhuǎn)膜對(duì)蛋白有濃縮作用,而在凝膠里, 蛋白石分布在整個(gè)凝膠厚度上的。對(duì)于優(yōu)化有如下原則:優(yōu)化抗體稀釋液及其 Tween-20的濃度,可優(yōu)化信噪比 使用不同的抗體稀釋緩沖液, 包括單獨(dú)的 PBS 、 Odyssey 封阻液、 脫脂牛奶、 BSA 、 PierceSuperBlock 等。不同的封阻液的效果也有很大不同。 BSA 效果最佳(通常轉(zhuǎn)膜 Western 檢測(cè)不推薦使用 BSA ,然而在 In-

37、Gel Western中 BSA 效果非常好 . Stripping和 ReprobingIn-Gel Western檢 測(cè) 也 可 作 Stripping 和 Reprobing 。 Stripping 緩 沖 液 推 薦 25mM Glycine-HCl pH 2.0 + 2%SDS。足量剝離液中室溫條件下,剝離凝膠 30-60min ,每 15-30min 換一次剝離緩沖液。之后在 PBS + 0.1%Tween-20中全面洗膠。為了監(jiān)控剝離效果,高分辨 率(337µm快速掃描凝膠。完成剝離的時(shí)間取決于原始信號(hào)的亮度,以及一抗和抗原結(jié)合 的強(qiáng)度。 . 常見(jiàn)問(wèn)題問(wèn)題 可能的原因解

38、決辦法濃縮膠存在 電泳后切掉濃縮膠 抗體用量過(guò)大降低二抗的濃度由于孵育的緩沖液用量不足造成 的背景不均勻每個(gè)步驟 (固定、 洗脫和抗體孵育 都是用足夠的緩沖液且凝膠可自 由移動(dòng)擠壓可造成背景上出現(xiàn)斑點(diǎn) 輕拿輕放凝膠、 并每次只能接觸凝 膠邊緣使用足量的緩沖液凝膠可自由移 動(dòng)。防止凝膠粘在容器底部 凝膠背景高凝膠未徹底洗脫延長(zhǎng)洗脫時(shí)間或增加洗脫次數(shù), 室 溫下凝膠避光浸泡在 PBS 中過(guò)夜 也能降低背景增加一抗和 /或二抗的量。 4過(guò)夜 孵育一抗抗體用量不足In-Gel Western檢測(cè)沒(méi)有轉(zhuǎn)膜檢測(cè) 那么靈敏, 需要相應(yīng)增加樣品上樣 量和抗體濃度嘗試不同的稀釋液, 對(duì)于某些一抗 的效果是有影響

39、的稀釋一抗的緩沖液不理想建議緩沖液含 3-5%BSA, Odyssey 封 阻 液 和 PBS 或 TBS (都 含 0.1%Tween-20 。其他封阻液(脫 脂牛奶、 干酪素、 其他商業(yè)化封阻 液和 Tween-20的濃度也可嘗試凝膠類型不理想 檢測(cè)推薦 NOVEX 的預(yù)制膠。 其他來(lái)源的或自制的凝膠也可 使用, 但可能靈敏度降低或需要更 多的優(yōu)化 丙烯酰胺含量太高, 可降低膠濃度 增加抗體溶液體積, 保證凝膠完全 浸沒(méi)在抗體中抗體未完全或不均勻進(jìn)入凝膠確定凝膠已被充分固定。 某些單克 隆抗體對(duì)凝膠內(nèi)殘留的酸很敏感, 遇到這樣的問(wèn)題, 可在固定液中去 除乙酸或延長(zhǎng)水洗時(shí)間無(wú)信號(hào)或信號(hào) 弱凝

40、膠在異丙醇 /乙酸溶液中時(shí)間過(guò) 長(zhǎng)蛋白會(huì)從凝膠中損失。固定只能 15min條帶模糊或不 規(guī)則凝膠類型不合適 檢測(cè)推薦 NOVEX 的預(yù)制膠。 其他來(lái)源的或自制的凝膠也可 使用, 但可能靈敏度降低或需要更多的優(yōu)化上樣量過(guò)大嘗試降低蛋白上樣量; 如果條帶內(nèi) 的蛋白上樣量太高則條帶會(huì)出現(xiàn) “滿是斑點(diǎn)”凝膠固定不充分如果按照上述方案問(wèn)題依然存在, 可嘗試調(diào)節(jié)異丙醇或乙酸 抗體濃度太高減少抗體用量或縮短抗體孵育時(shí) 間雙色檢測(cè)中抗體交叉反應(yīng) 躋身選用抗體,見(jiàn) . 雙色 In-Gel Western 蛋白檢測(cè)指南嘗試不同的稀釋液, 對(duì)于某些一抗 的效果是有影響的一抗稀釋緩沖液不理想建議緩沖液含 3-5%BS

41、A, Odyssey 封 阻 液 和 PBS 或 TBS (都 含 0.1%Tween-20 。其他封阻液(脫 脂牛奶、 干酪素、 其他商業(yè)化封阻 液和 Tween-20的濃度也可嘗試非特異或非目 標(biāo)條帶兩個(gè)通道之間的信號(hào)泄露如果信號(hào)在一個(gè)通道很強(qiáng) (接近或 達(dá)到飽和 ,則可能會(huì)在另一個(gè)通 道有少量泄露, 調(diào)低掃描亮度或減 少抗體的用量可解決此問(wèn)題 近紅外雙色激光成像系統(tǒng)In-Cell Western ProtocolEGF 對(duì) A431細(xì)胞刺激效應(yīng)的評(píng)估(中文版基因有限公司 2007年 1月目 錄 . 需要的試劑 . - 1 - . 養(yǎng)細(xì)胞、刺激和檢測(cè) A431細(xì)胞對(duì) EGF 的反應(yīng) . -

42、 1 - . 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) . - 4 - . 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 . - 5 - . 需要的試劑Odyssey 試劑zIRDye 800CW標(biāo)記的山羊抗小鼠的二抗(LI-COR Cat.# 926-32210 *zIRDye 680標(biāo)記的山羊抗兔二抗(LI-COR Cat.# 926-32221 * LI-COR和 Rockland 也有其他類型 IRDye 800CW標(biāo)記的二抗; Invitrogen 也有其他類型 Alexa Fluor 680二抗zOdyssey 封阻液(LI-COR Cat.# 927-40000其他試劑z1×PBS洗脫液z細(xì)胞培養(yǎng)試劑(血清,DMEM,胰島素,1&#

43、215;PBSz20% Tween-20zEGF(表皮生長(zhǎng)因子 (Upstate Cat.# 01-107z37%甲醛z10% Triton X-100zNunc 96孔板(Nunc Cat.# 167008z下述的一抗特別注意:磷酸化 EGFR 和磷酸化 ERK 分別從 CST 和 Santa Cruz購(gòu)買。血清饑餓細(xì)胞要達(dá) 到最大的反應(yīng)。 . 養(yǎng)細(xì)胞、刺激和檢測(cè) A431細(xì)胞對(duì) EGF 的反應(yīng)1. 按照標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)步驟,在 DMEM 和 10%小牛血清(FCS ; Gibco 的長(zhǎng)頸瓶 中培養(yǎng) A431細(xì)胞,直到達(dá)到 80-90%的細(xì)胞覆蓋度(confluency (約 1.5×

44、;107個(gè) 細(xì)胞2. 去除培養(yǎng)基、滅菌的 1×PBS洗細(xì)胞,然后再用胰島素酶化細(xì)胞3. 離心法轉(zhuǎn)移細(xì)胞培養(yǎng)基和細(xì)胞小球4. 輕輕敲打管壁, 去除上清和懸浮的細(xì)胞球。 避免用移液器大力吸打或用 V oetex 震 蕩,以保證細(xì)胞的完整性5. 用全培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞至 20ml ,并用血球計(jì)計(jì)數(shù)6. 用全培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞至 200,000細(xì)胞 /ml7. 輕輕的充分混合細(xì)胞懸浮頁(yè)8. 滅菌條件下,向 96孔板每孔分裝 200µl細(xì)胞懸浮液(40,000細(xì)胞 /孔9. 孵育細(xì)胞并監(jiān)測(cè)細(xì)胞密度,直到每個(gè)孔內(nèi)細(xì)胞都匯合,這個(gè)過(guò)程大約需要 3天 10. 加熱不含血清的培養(yǎng)基(D-MEM ;

45、Gibco 到 3711. 用真空器抽氣去除微孔板內(nèi)的全培養(yǎng)基12. 向每個(gè)孔內(nèi)更換 200µl不含血清、預(yù)熱的培養(yǎng)基,孵育 4-6h13. 在另一個(gè) 96孔板的每個(gè)孔內(nèi)分裝 100µl D-MEM14. 第一和第二個(gè)孔不加 EGF (休眠細(xì)胞對(duì)照 。其余的孔內(nèi)加入 EGF ,濃度按倍比 梯度從 0.2-100ng/ml。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)圖 1。15. 抽氣法去除每個(gè)孔內(nèi)的饑餓培養(yǎng)基16. 將分裝微孔板內(nèi)的 EGF 稀釋溶液轉(zhuǎn)移到含有細(xì)胞的微孔板內(nèi)17. 孵育 7.5min18. 準(zhǔn)備新鮮的 固定緩沖液 :1×PBS 45.0 ml37%甲醛 5.0 ml3.7%甲醛

46、50.0 ml19. 抽氣法去除含有 EGF 的培養(yǎng)基, 迅速加入 150µl的新鮮 固定緩沖液 固定細(xì)胞, 免 搖動(dòng)在室溫條件下孵育 20min 。 加固定緩沖液時(shí),小心地用移液器沿管壁加入, 避免使細(xì)胞分離20. 準(zhǔn)備 Triton 洗脫緩沖液 :1×PBS 495 ml10% Triton X-100 5 ml1×PBS + 10% Triton X-100500 ml21. 抽氣法去除 固定緩沖液22. 用 Triton 洗脫緩沖液 分 4次洗脫細(xì)胞,每次 200µl 5min,以保證可以滲透細(xì)胞 注意:z每次洗脫可在搖床上進(jìn)行,室溫條件下 5m

47、inz洗脫過(guò)程中,切勿讓孔 /細(xì)胞變干,每次操作之后快速加入洗脫液23. 抽氣法去除 Triton 洗脫緩沖液24. 每個(gè)孔內(nèi), 小心地從管壁加入 150µl LI-COR Odyssey封阻液 (#927-40000 , 在搖 床上緩慢搖動(dòng)室溫下孵育 1.5h 。注意:z一種封阻液不是對(duì)每對(duì)抗原 -抗體的效果都理想的,某些一抗在不同的封 阻液中可能會(huì)出現(xiàn)信號(hào)大幅度降低或表現(xiàn)非特異性條帶。如果目標(biāo)蛋白 不能被檢測(cè),嘗試更換一種封阻液可能會(huì)大大改善實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如果以前 化學(xué)發(fā)光所用的封阻液和一抗效果不錯(cuò),那么在 In-Cell Western中繼續(xù) 使用這個(gè)抗體和封阻液zOdyssey

48、封阻液于其他封阻液相比,具有更高的靈敏度和高穩(wěn)定的表現(xiàn)。 脫脂奶粉或干酪素溶于 PBS 也可用于封阻和稀釋抗體。如果使用抗羊的 的抗體,則脫脂奶粉封阻液會(huì)有干擾,而且即使 4條件下很容易腐敗, 所以難以長(zhǎng)期保存,且只能在數(shù)天之內(nèi)重復(fù)使用。如果使用干酪素,推 薦在 0.2×PBS緩沖液里濃度為 0.1%z也可使用含有 BSA 的封阻液,但某些情況下會(huì)造成背景過(guò)高,所以通常 不推薦使用這類封阻液,除非一抗特別要求封阻液含有 BSA In-Cell Western Protocol25. 在 LI-COR Odyssey封阻液中稀釋抗體要注意如下提示:一抗可以按照不同組合加入,通常一種抗體

49、可以抗磷酸化目標(biāo)蛋白,另一種抗體 是抗目標(biāo)蛋白(無(wú)論磷酸化狀態(tài)如何 。下列建議的一抗組合取決于被檢測(cè)的目 標(biāo)蛋白:a. Phospho-EGFR Tyr1045(兔, 1:100稀釋, CST 2237Total EGFR(小鼠, 1:500稀釋, Biosource International AHR5062 b. Phospho-EGFR Tyr1045(兔, 1:100稀釋, CST 2237Total ERK2(小鼠 ; 1:75稀釋, Santa Cruz Biotechnology SC-1647 c. Phospho-ERK (小鼠, 1:100稀釋, Santa Cruz Bi

50、otechnology SC-7383 Total ERK1(兔, 1:200稀釋, Santa Cruz Biotechnology SC-94d. Phospho-EGFR Tyr1045(兔, 1:100稀釋, Cell Signaling Technology 2237 Phospho-ERK (小鼠, 1:100稀釋, Santa Cruz Biotechnology SC-7383 26. 在一批微孔內(nèi)分別加入 50µl的 LI-COR Odyssey封阻液,作為由于近紅外染料標(biāo) 記的二抗可能產(chǎn)生背景的對(duì)照。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)圖 1的例子27. 在加入微孔前充分混合兩種一抗溶液28. 抽吸其他微孔內(nèi)的封阻液并加入 50µl已混合好的一抗,一抗溶液應(yīng)該覆蓋管底 29. 室溫條件下緩慢搖動(dòng),孵育一抗 2h注意:a. 為達(dá)到最高的靈敏度,4不搖動(dòng)孵育過(guò)夜b. 為防止細(xì)胞干燥,過(guò)夜孵育時(shí)需蓋住微孔板30. 準(zhǔn)備 Tween 洗脫液 :1×PBS 995 ml20% Tween-20 5 ml1×PBS + 0.1% Tween-201000 ml