蛋白質(zhì)含量測(cè)定法考馬斯亮藍(lán)法

1、蛋白質(zhì)含量測(cè)定法考馬斯亮藍(lán)法實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)、掌握考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法實(shí)驗(yàn)原理器材與試劑器材722型可見光分光光度計(jì)、漩渦混合器、試管16支試劑1.標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用牛血清清蛋白（BSA），配制成1.00mg/ml。2.考馬斯亮藍(lán)G-250染料試劑：稱100mg考馬斯亮藍(lán)，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀釋至1升。實(shí)驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)方法1.取10支試管，分別編號(hào)后按 表1 劑量依次加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白（或未知蛋白）、去離子水和考馬斯亮藍(lán)染料。每支試管加完后，立即在漩渦混合器上混合。2.加完染料20min后，使用722分光光度計(jì)，塑料比色皿，

2、在595nm處測(cè)量吸光度A595。3.用標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度（mg/ml）為橫坐標(biāo)，用A595為縱坐標(biāo)，進(jìn)行直線擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)測(cè)得的未知樣品的A595，代入公式即可求得未知樣品的蛋白質(zhì)含量。根據(jù)所測(cè)樣品的吸光度,在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的蛋白質(zhì)含量,按下式計(jì)算:樣品蛋白質(zhì)含量(g/g鮮重) =SDS干擾實(shí)驗(yàn)1.取5支試管，分別編號(hào)后按表2劑量依次加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白、SDS、去離子水和考馬斯亮藍(lán)染料。每支試管加完后，立即在漩渦混合器上混合。2.加完染料20min后，使用753分光光度計(jì)，塑料比色皿，在595nm處測(cè)量吸光度A595。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與結(jié)果分析（一）標(biāo)準(zhǔn)方法的數(shù)據(jù)和圖表1 考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)法實(shí)驗(yàn)表格

3、管號(hào)12345678910標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（1.00mg/ml）00.010.020.040.060.080.10未知蛋白質(zhì)（約0.5mg/ml）0.040.080.10蒸餾水0.10.090.080.060.040.0200.060.020考馬斯亮藍(lán)G-250試劑3.03.03.03.03.03.03.03.03.03.0對(duì)應(yīng)的吸光度A595根據(jù)表1，以A595為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量/（g）為橫坐標(biāo)，作圖1。圖1 考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)法根據(jù)線性擬合公式y(tǒng)=ax+b計(jì)算所測(cè)溶液的蛋白質(zhì)的含量。（二）SDS干擾數(shù)據(jù)和圖表2 考馬斯亮藍(lán)SDS干擾實(shí)驗(yàn)表格管號(hào)123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（1.00mg/ml）0.10

4、.10.10.10.10.1SDS (1mg/ml)00.10.20.40.60.8蒸餾水0.90.80.70.50.30.1考馬斯亮藍(lán)G-250試劑3.03.03.03.03.03.0對(duì)應(yīng)的吸光度A595根據(jù)表2，以A595為縱坐標(biāo)，SDS濃度為橫坐標(biāo)，作圖2。圖2 考馬斯亮藍(lán)SDS干擾實(shí)驗(yàn)理論上，十二烷基硫酸鈉(SDS)對(duì)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白質(zhì)含量有干擾，隨著SDS濃度的增加，其混合液的595nm處的吸收峰逐漸降低，而后有一小段回升，最后趨于漸近線。結(jié)論：1 考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)法測(cè)得未知溶液中蛋白質(zhì)含量為x mg/ml。2 干擾考馬斯亮藍(lán)方法的物質(zhì)中，SDS的干擾分析情況。干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：當(dāng)溶

5、液中存在一定量的SDS后所測(cè)得的吸光度比正常值相對(duì)減小。但是隨著SDS濃度的增加，吸光度的減小量應(yīng)沒有呈現(xiàn)出很明顯的規(guī)律。從SDS與蛋白質(zhì)的作用機(jī)理來看，SDS可以斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。SDS和蛋白質(zhì)結(jié)合后使蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物上帶有大量的負(fù)電荷，平均每兩個(gè)氨基酸結(jié)合一個(gè)SDS分子，這時(shí)各種蛋白質(zhì)分子本身的電荷完全被SDS掩蓋。由于SDS 的存在，阻礙了染料與堿性氨基酸和芳香族氨基酸的結(jié)合，使得吸光度減小。由于SDS與染料分子對(duì)蛋白質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，使得顯色減弱，吸光度值降低，因此在曲線前段呈下降趨勢(shì)；但由于SDS破壞氫鍵，使得蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)更加伸展，一些原來包裹

6、在結(jié)構(gòu)中的堿性氨基酸和芳香族氨基酸暴露出來，所以會(huì)有少量的吸光度回升；但最終SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合達(dá)到所處溶液條件下的“飽和”時(shí)，過量的SDS就不起作用了，曲線是最后為平緩段。要去除SDS的干擾，可以利用它與K+結(jié)合生成沉淀的性質(zhì)將其去除。K+對(duì)考馬斯亮藍(lán)方法不產(chǎn)生干擾。思考與討論1.用考馬斯亮藍(lán)法G-250測(cè)定蛋白質(zhì)含量有何特點(diǎn)，操作過程中應(yīng)注意什么？答：Bradford 法的優(yōu)點(diǎn)是（1）靈敏度高，其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1g。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化很大。（2）測(cè)定快速、簡(jiǎn)便、只需要加一種試劑。完成一個(gè)樣品

7、的測(cè)定，只需要5min左右，顏色在5min至20min之間穩(wěn)定性也很好。（3）干擾物質(zhì)相對(duì)其它方法少。缺點(diǎn)是（1）由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差。（2）仍有些物質(zhì)干擾此法測(cè)定：去污劑、Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1mol/L的NaOH。（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性。 操作注意事項(xiàng)：不可使用石英比色皿，可用塑料或者玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇蕩洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可以用乙醇或丙酮長時(shí)間浸泡。2.考馬斯亮藍(lán)G-250和R-250各有何特點(diǎn)，在電泳染色方面有何異同？答：考馬斯

8、亮藍(lán)G-250和R-250的結(jié)構(gòu)式不同，配方不同，染色方法也適合于不同性質(zhì)的蛋白。考馬斯亮藍(lán)R-250即三苯基甲烷。每個(gè)分子含有兩個(gè)-SO3H，偏酸性，與蛋白質(zhì)的堿性集團(tuán)結(jié)合。在一定pH時(shí)，染料蛋白復(fù)合物可以被完全解聚。與不同蛋白結(jié)合呈現(xiàn)基本相同的顏色，并且在比較寬的范圍內(nèi)(15-20g)，掃描峰的面積與蛋白量有線性關(guān)系。通常用先固定，再進(jìn)行染色和脫色的方法?？捡R斯亮藍(lán)G-250即二甲花青亮藍(lán)，其染色方法經(jīng)常是對(duì)蛋白質(zhì)同時(shí)進(jìn)行固定和染色。這種方法的特點(diǎn)是快而簡(jiǎn)便，有時(shí)甚至不需脫色。但靈敏度略遜于R-250。同時(shí)考馬斯亮藍(lán)G-250對(duì)小肽染色效果很好。3.試述幾種主要干擾物質(zhì)對(duì)考馬斯亮藍(lán)G-25

9、0蛋白測(cè)定法測(cè)定結(jié)果的影響及其作用機(jī)理。答：SDS的存在會(huì)使相同條件下的吸光度值減小，其作用機(jī)理為：斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。SDS和蛋白質(zhì)結(jié)合后使蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物上帶有大量的負(fù)電荷，平均每兩個(gè)氨基酸結(jié)合一個(gè)SDS分子，這時(shí)各種蛋白質(zhì)分子本身的電荷完全被SDS掩蓋。由于SDS與染料分子與蛋白質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，會(huì)使顯色減弱，所以吸光度值減小。Tris，乙酸，2-巰基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污劑如TritonX-100，玻璃去污劑有少量顏色干擾，用適當(dāng)?shù)木彌_液對(duì)照很容易除掉。4.說明各種蛋白質(zhì)含量測(cè)定法中哪幾種可以測(cè)出蛋白質(zhì)的絕對(duì)含量，哪幾種只能測(cè)定其相對(duì)含量，為什么？答：嚴(yán)格地講，只有凱氏定氮法可以測(cè)定蛋白質(zhì)的絕對(duì)含量，因?yàn)槊?.25蛋白質(zhì)含1g氮，所以，通過氮含量的測(cè)定，可以得到蛋白質(zhì)的絕對(duì)含量。其他的幾種方法，由于都使用了標(biāo)準(zhǔn)蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，所以，所測(cè)得的未知蛋白的含量，都是相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量而言的。參考資料：1 王德利等.食品中蛋白質(zhì)的快速消化簡(jiǎn)便測(cè)定法.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào). 15（4）：8082 2余冰賓.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo).清華大學(xué)出版社.20043 南亞,李宏高.考馬斯亮藍(lán)G-250