蛋白質(zhì)含量測定法考馬斯亮藍法

1、蛋白質(zhì)含量測定法考馬斯亮藍法實驗?zāi)康膶W習、掌握考馬斯亮藍法（Bradford法）測定蛋白質(zhì)含量的方法實驗原理器材與試劑器材722型可見光分光光度計、漩渦混合器、試管16支試劑1.標準蛋白質(zhì)溶液，用牛血清清蛋白（BSA），配制成1.00mg/ml。2.考馬斯亮藍G-250染料試劑：稱100mg考馬斯亮藍，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀釋至1升。實驗方法標準方法1.取10支試管，分別編號后按 表1 劑量依次加入標準蛋白（或未知蛋白）、去離子水和考馬斯亮藍染料。每支試管加完后，立即在漩渦混合器上混合。2.加完染料20min后，使用722分光光度計，塑料比色皿，

2、在595nm處測量吸光度A595。3.用標準蛋白濃度（mg/ml）為橫坐標，用A595為縱坐標，進行直線擬合，得到標準曲線。根據(jù)測得的未知樣品的A595，代入公式即可求得未知樣品的蛋白質(zhì)含量。根據(jù)所測樣品的吸光度,在標準曲線上查得相應(yīng)的蛋白質(zhì)含量,按下式計算:樣品蛋白質(zhì)含量(g/g鮮重) =SDS干擾實驗1.取5支試管，分別編號后按表2劑量依次加入標準蛋白、SDS、去離子水和考馬斯亮藍染料。每支試管加完后，立即在漩渦混合器上混合。2.加完染料20min后，使用753分光光度計，塑料比色皿，在595nm處測量吸光度A595。實驗數(shù)據(jù)與結(jié)果分析（一）標準方法的數(shù)據(jù)和圖表1 考馬斯亮藍標準法實驗表格

3、管號12345678910標準蛋白質(zhì)（1.00mg/ml）00.010.020.040.060.080.10未知蛋白質(zhì)（約0.5mg/ml）0.040.080.10蒸餾水0.10.090.080.060.040.0200.060.020考馬斯亮藍G-250試劑3.03.03.03.03.03.03.03.03.03.0對應(yīng)的吸光度A595根據(jù)表1，以A595為縱坐標，標準蛋白質(zhì)量/（g）為橫坐標，作圖1。圖1 考馬斯亮藍標準法根據(jù)線性擬合公式y(tǒng)=ax+b計算所測溶液的蛋白質(zhì)的含量。（二）SDS干擾數(shù)據(jù)和圖表2 考馬斯亮藍SDS干擾實驗表格管號123456標準蛋白質(zhì)（1.00mg/ml）0.10

4、.10.10.10.10.1SDS (1mg/ml)00.10.20.40.60.8蒸餾水0.90.80.70.50.30.1考馬斯亮藍G-250試劑3.03.03.03.03.03.0對應(yīng)的吸光度A595根據(jù)表2，以A595為縱坐標，SDS濃度為橫坐標，作圖2。圖2 考馬斯亮藍SDS干擾實驗理論上，十二烷基硫酸鈉(SDS)對考馬斯亮藍法測蛋白質(zhì)含量有干擾，隨著SDS濃度的增加，其混合液的595nm處的吸收峰逐漸降低，而后有一小段回升，最后趨于漸近線。結(jié)論：1 考馬斯亮藍標準法測得未知溶液中蛋白質(zhì)含量為x mg/ml。2 干擾考馬斯亮藍方法的物質(zhì)中，SDS的干擾分析情況。干擾實驗結(jié)果分析：當溶

5、液中存在一定量的SDS后所測得的吸光度比正常值相對減小。但是隨著SDS濃度的增加，吸光度的減小量應(yīng)沒有呈現(xiàn)出很明顯的規(guī)律。從SDS與蛋白質(zhì)的作用機理來看，SDS可以斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)。SDS和蛋白質(zhì)結(jié)合后使蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物上帶有大量的負電荷，平均每兩個氨基酸結(jié)合一個SDS分子，這時各種蛋白質(zhì)分子本身的電荷完全被SDS掩蓋。由于SDS 的存在，阻礙了染料與堿性氨基酸和芳香族氨基酸的結(jié)合，使得吸光度減小。由于SDS與染料分子對蛋白質(zhì)的競爭結(jié)合，使得顯色減弱，吸光度值降低，因此在曲線前段呈下降趨勢；但由于SDS破壞氫鍵，使得蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)更加伸展，一些原來包裹

6、在結(jié)構(gòu)中的堿性氨基酸和芳香族氨基酸暴露出來，所以會有少量的吸光度回升；但最終SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合達到所處溶液條件下的“飽和”時，過量的SDS就不起作用了，曲線是最后為平緩段。要去除SDS的干擾，可以利用它與K+結(jié)合生成沉淀的性質(zhì)將其去除。K+對考馬斯亮藍方法不產(chǎn)生干擾。思考與討論1.用考馬斯亮藍法G-250測定蛋白質(zhì)含量有何特點，操作過程中應(yīng)注意什么？答：Bradford 法的優(yōu)點是（1）靈敏度高，其最低蛋白質(zhì)檢測量可達1g。這是因為蛋白質(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化很大。（2）測定快速、簡便、只需要加一種試劑。完成一個樣品

7、的測定，只需要5min左右，顏色在5min至20min之間穩(wěn)定性也很好。（3）干擾物質(zhì)相對其它方法少。缺點是（1）由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差。（2）仍有些物質(zhì)干擾此法測定：去污劑、Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1mol/L的NaOH。（3）標準曲線也有輕微的非線性。 操作注意事項：不可使用石英比色皿，可用塑料或者玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇蕩洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可以用乙醇或丙酮長時間浸泡。2.考馬斯亮藍G-250和R-250各有何特點，在電泳染色方面有何異同？答：考馬斯

8、亮藍G-250和R-250的結(jié)構(gòu)式不同，配方不同，染色方法也適合于不同性質(zhì)的蛋白。考馬斯亮藍R-250即三苯基甲烷。每個分子含有兩個-SO3H，偏酸性，與蛋白質(zhì)的堿性集團結(jié)合。在一定pH時，染料蛋白復(fù)合物可以被完全解聚。與不同蛋白結(jié)合呈現(xiàn)基本相同的顏色，并且在比較寬的范圍內(nèi)(15-20g)，掃描峰的面積與蛋白量有線性關(guān)系。通常用先固定，再進行染色和脫色的方法?？捡R斯亮藍G-250即二甲花青亮藍，其染色方法經(jīng)常是對蛋白質(zhì)同時進行固定和染色。這種方法的特點是快而簡便，有時甚至不需脫色。但靈敏度略遜于R-250。同時考馬斯亮藍G-250對小肽染色效果很好。3.試述幾種主要干擾物質(zhì)對考馬斯亮藍G-25

9、0蛋白測定法測定結(jié)果的影響及其作用機理。答：SDS的存在會使相同條件下的吸光度值減小，其作用機理為：斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)。SDS和蛋白質(zhì)結(jié)合后使蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物上帶有大量的負電荷，平均每兩個氨基酸結(jié)合一個SDS分子，這時各種蛋白質(zhì)分子本身的電荷完全被SDS掩蓋。由于SDS與染料分子與蛋白質(zhì)的競爭結(jié)合，會使顯色減弱，所以吸光度值減小。Tris，乙酸，2-巰基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污劑如TritonX-100，玻璃去污劑有少量顏色干擾，用適當?shù)木彌_液對照很容易除掉。4.說明各種蛋白質(zhì)含量測定法中哪幾種可以測出蛋白質(zhì)的絕對含量，哪幾種只能測定其相對含量，為什么？答：嚴格地講，只有凱氏定氮法可以測定蛋白質(zhì)的絕對含量，因為每6.25蛋白質(zhì)含1g氮，所以，通過氮含量的測定，可以得到蛋白質(zhì)的絕對含量。其他的幾種方法，由于都使用了標準蛋白制作標準曲線，所以，所測得的未知蛋白的含量，都是相對于標準蛋白含量而言的。參考資料：1 王德利等.食品中蛋白質(zhì)的快速消化簡便測定法.黑龍江八一農(nóng)墾大學學報. 15（4）：8082 2余冰賓.生物化學實驗指導(dǎo).清華大學出版社.20043 南亞,李宏高.考馬斯亮藍G-250