YYT 1849-2022 重組膠原蛋白

中華人民共和國(guó)醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)重組膠原蛋白R(shí)ecombinantcollagenpro2022-01-13發(fā)布國(guó)家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布 I 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語(yǔ)和定義 4質(zhì)量控制 24.1通則 24.2制備工藝的質(zhì)量控制 24.3重組膠原蛋白的質(zhì)量控制 25檢測(cè)項(xiàng)目、要求和檢測(cè)方法 5.1通則 5.2理化項(xiàng)目 35.3鑒別 45.4純度 4 55.6含量 65.7結(jié)構(gòu)表征 5.8生物學(xué)功能 5.9安全性試驗(yàn) 86穩(wěn)定性 7生物學(xué)評(píng)價(jià) 9 9附錄A(資料性)重組膠原蛋白特性分析 附錄B(規(guī)范性)細(xì)胞黏附性測(cè)定——離心法 附錄C(規(guī)范性)細(xì)胞移行試驗(yàn)——細(xì)胞劃痕法 參考文獻(xiàn) l本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專(zhuān)利的責(zé)任。本文件由國(guó)家藥品監(jiān)督管理局提出。本文件由中國(guó)食品藥品檢定研究院歸口。本文件起草單位：中國(guó)食品藥品檢定研究院、四川省藥品檢驗(yàn)研究院(四川省醫(yī)療器械檢測(cè)中心)、山東省醫(yī)療器械和藥品包裝檢驗(yàn)研究院、北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)療器械檢驗(yàn)中心、陜西巨子生物技術(shù)有限公司、山西錦波生物醫(yī)藥股份有限公司、江蘇創(chuàng)健醫(yī)療科技有限公司、江蘇江山聚源生物技術(shù)有1重組膠原蛋白本文件規(guī)定了重組膠原蛋白的質(zhì)量控制要求、檢測(cè)指標(biāo)及其檢測(cè)方法等。本文件適用于作為醫(yī)療器械原材料的重組膠原蛋白的質(zhì)量控制。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于GB/T16886.1醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第1部分：風(fēng)險(xiǎn)管理過(guò)程中的評(píng)價(jià)與試驗(yàn)GB/T16886.20醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第20部分：醫(yī)療器械免疫毒理學(xué)試驗(yàn)原則和方法GB18278.1醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌濕熱第1部分：醫(yī)療器械滅菌過(guò)程的開(kāi)發(fā)、確認(rèn)和常規(guī)控制GB18279.1醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌環(huán)氧乙烷第1部分：醫(yī)療器械滅菌過(guò)程的開(kāi)發(fā)、確認(rèn)和常規(guī)控制的要求GB18280.1醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌輻射第1部分：醫(yī)療器械滅菌過(guò)程的開(kāi)發(fā)、確認(rèn)和常規(guī)控制YY/T1453組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品I型膠原蛋白表征方法YY/T1465(所有部分)醫(yī)療器械免疫原性評(píng)價(jià)方法YY/T1805.2組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品膠原蛋白第2部分：I型膠原蛋白分子量檢測(cè)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法YY/T1805.3組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品膠原蛋白第3部分：基于特征多肽測(cè)定的膠原蛋白含量檢測(cè)液相色譜-質(zhì)譜法中華人民共和國(guó)藥典下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。一類(lèi)含有至少20種在遺傳學(xué)上不同類(lèi)型的分泌蛋白質(zhì)家族，主要擔(dān)任機(jī)體的結(jié)構(gòu)支撐功能，具有獨(dú)特的由三條多肽鏈(被稱(chēng)為α鏈)組成的三螺旋構(gòu)型，并具有一定的生物學(xué)功能。2采用重組DNA技術(shù)，對(duì)編碼所需人膠原蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行遺傳操作和(或)修飾，利用質(zhì)?；虿《据d體將目的基因帶入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞(細(xì)菌、酵母或其他真核細(xì)胞等)中，表達(dá)并翻譯成膠原蛋白(3.1)或類(lèi)似膠原蛋白(3.1)的多肽，經(jīng)過(guò)提取和純化等步驟制備而成。4質(zhì)量控制由于重組基因片段的型別與序列的不同，表達(dá)體系的差異，致使獲得的產(chǎn)物不盡相同，與天然膠原蛋白相比，氨基酸組成、分子量大小和(或)結(jié)構(gòu)可能差異很大，甚至行全面的特性分析(見(jiàn)附錄A),進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制。重組膠原蛋白的質(zhì)量控制與分子量大小、結(jié)構(gòu)特性、質(zhì)量屬性復(fù)雜程度以及生產(chǎn)工藝相關(guān)。質(zhì)量控制體系主要包括原輔料質(zhì)量控制、生產(chǎn)工藝和過(guò)程控制及最終成品的檢測(cè)等。應(yīng)通過(guò)成品檢測(cè)、過(guò)程控制和工藝驗(yàn)證相結(jié)合的方法，確保各類(lèi)雜質(zhì)已去除或降低至可接受水平。4.2制備工藝的質(zhì)量控制重組膠原蛋白屬于一種重組蛋白，應(yīng)參照《中華人民共和國(guó)藥典》“人用重組DNA蛋白制品總論”純化、原液、半成品和成品)和生產(chǎn)工藝變更要求，建立質(zhì)量控制體系。不適用條款或事項(xiàng)需給出合理的4.3重組膠原蛋白的質(zhì)量控制重組膠原蛋白成品的質(zhì)量控制包括采用參比品和經(jīng)驗(yàn)證的方法評(píng)估已知和(或)潛在的成品相關(guān)物質(zhì)和工藝相關(guān)物質(zhì)，以及采用適宜的方法對(duì)成品鑒別、生物學(xué)功能、純度和雜質(zhì)等進(jìn)行檢測(cè)和分析。選擇已證明足夠穩(wěn)定且適合臨床試驗(yàn)的一個(gè)(多個(gè))批次，或用一個(gè)代表批次作為參比品，用于鑒別、理化和生物學(xué)功能等各種分析。根據(jù)重組DNA蛋白制品特性，應(yīng)對(duì)參比品做全面深入的表征/特性分析。參比品的建立和制備應(yīng)參照《中華人民共和國(guó)藥典》“生物制品國(guó)家用于理化測(cè)定等方面的參比品，如用于肽圖或等電點(diǎn)測(cè)定的參比品，可用原液直接分裝制備，一70℃以下或經(jīng)驗(yàn)證的貯存條件下保存。根據(jù)重組DNA蛋白制品特性，參比品應(yīng)進(jìn)行必要的分析鑒分析(酵母或其他真核細(xì)胞表達(dá))等。收獲液經(jīng)提取、純化分裝于中間貯存容器中即為原液。原液的檢驗(yàn)項(xiàng)目取決于工藝的驗(yàn)證、一致性的確認(rèn)和預(yù)期成品相關(guān)雜質(zhì)與工藝相關(guān)雜質(zhì)的水平。應(yīng)采取適當(dāng)方法對(duì)原液質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，必要時(shí)應(yīng)與參比品進(jìn)行比較。經(jīng)工藝驗(yàn)證后，可由一批或多批原液合并生產(chǎn)半成品，制成成品前，如需對(duì)原液進(jìn)行稀釋或加入其他輔料制成半成品，應(yīng)確定半成品的質(zhì)量控制要求，包括檢測(cè)項(xiàng)目和可接受標(biāo)準(zhǔn)。3根據(jù)具體重組膠原蛋白成品的特性確定需要進(jìn)行的特性分析檢測(cè)項(xiàng)目。建立或驗(yàn)證重組膠原蛋白生產(chǎn)過(guò)程的有效性或可接受性的特性分析檢測(cè)項(xiàng)目可不納入常規(guī)質(zhì)量控制中，但應(yīng)對(duì)某一特定質(zhì)量屬性是否放入常規(guī)放行標(biāo)準(zhǔn)予以說(shuō)明。常規(guī)質(zhì)量控制的檢測(cè)項(xiàng)目包括如下幾個(gè)方面。肉眼直接觀(guān)測(cè)，供試品應(yīng)為白色/淡黃色/無(wú)色透明液體或凝膠，或白色/類(lèi)白色凍干粉或海綿狀適用時(shí)，按照《中華人民共和國(guó)藥典》“可見(jiàn)異物檢查法”的“燈檢法”進(jìn)行檢應(yīng)根據(jù)供試品的溶解特性，對(duì)供試品在水、稀酸或中性鹽溶液中的溶解程度進(jìn)行表征和闡述。約10mg按照《中華人民共和國(guó)藥典》“熱分析法”率升溫至105℃,保持60min。減失重量應(yīng)符合所標(biāo)示范圍。規(guī)定仲裁方法為水分測(cè)定法。用0.9%氯化鈉溶液將供試品制成1mg/mL的溶液，若使用其他溶劑溶解應(yīng)明確說(shuō)明使用溶劑及如適用，用0.9%氯化鈉溶液將供試品制成1mg/mL的溶液或根據(jù)臨床預(yù)期使用，將供試品配制驗(yàn)條件，動(dòng)力黏度值應(yīng)符合所標(biāo)示范圍。5.2.9.1采用差示掃描量熱法(DSC)進(jìn)行解聚溫度分析。按照《中華人民共和國(guó)藥典》“熱分析法”進(jìn)行。初始溫度20℃,以2℃/min速度升溫至200℃,記錄熱分析曲線(xiàn)。根據(jù)供試品的通常貯存性狀(如凍干粉等)和預(yù)期使用性狀進(jìn)行相同或相似樣品條件下的差示掃描量熱分析。5.2.9.2將供試品原液，或重組膠原蛋白凍干粉或海綿加水制成10mg/mL的溶液，置(57±0.5)℃水4浴中保溫4h后，用可見(jiàn)異物檢查裝置，肉眼觀(guān)察應(yīng)無(wú)凝膠化或絮狀物。等)和裝量的不同確定裝量的允差要求。行測(cè)定，應(yīng)與參比品肽圖一致，主要特征肽段相對(duì)比例(響應(yīng)強(qiáng)度)應(yīng)與參比品基本一致。進(jìn)行定性，序列覆蓋率應(yīng)符合所標(biāo)示范圍。用氨基酸序列分析儀或質(zhì)譜法測(cè)定N端和/或C端氨基酸序列，其結(jié)果應(yīng)符合理論預(yù)測(cè)(每年應(yīng)至少做一次)。5.3.3.1按照YY/T1805.2規(guī)定的方法條件進(jìn)比品(經(jīng)過(guò)飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定過(guò)的重組膠原蛋白)保持一致。標(biāo)示范圍內(nèi)。濃度為15%,供試品加水制成濃度為1mg/mL～2mg/mL的溶液，點(diǎn)樣量10μL,考馬斯亮藍(lán)R250染應(yīng)符合標(biāo)示要求。5質(zhì)的質(zhì)量控制(如蛋白質(zhì)A、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、DNA、其他潛在的培養(yǎng)或純化殘留物等)通常在原液階段進(jìn)行。如經(jīng)充分驗(yàn)證證明生產(chǎn)工藝對(duì)工藝相關(guān)雜質(zhì)的去除已達(dá)到高水平時(shí)，工藝相關(guān)雜質(zhì)的質(zhì)量控制可在恰當(dāng)工藝步驟的中間產(chǎn)物進(jìn)行，可不列入放行檢測(cè)中。雜質(zhì)檢測(cè)項(xiàng)目可能涉及，但不限于如下測(cè)定，“熒光染色法”的樣品加標(biāo)回收率應(yīng)滿(mǎn)足70%～130%;“定量PCR法”的樣品加標(biāo)回收率應(yīng)滿(mǎn)足50%～150%,應(yīng)規(guī)定殘留限量。如果樣品中外源性DNA殘留量低于“熒光染色法”的檢測(cè)限，則應(yīng)采按照《中華人民共和國(guó)藥典》“大腸埃希菌菌體蛋白質(zhì)殘留量測(cè)定法”或采盒進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果應(yīng)在總蛋白的0.05%以下(體內(nèi)植入),或0.1%以下(外用)。按照《中華人民共和國(guó)藥典》“酵母工程菌菌體蛋白質(zhì)殘留量測(cè)定法”或采用經(jīng)驗(yàn)證的酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果應(yīng)在總蛋白的0.05%以下(體內(nèi)植入),或0.1%以下(外用)。采用經(jīng)驗(yàn)證的酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行測(cè)定，CHO細(xì)胞蛋白質(zhì)殘留量應(yīng)在總蛋白的0.05%以下(體內(nèi)植入),或0.1%以下(外用)。應(yīng)根據(jù)工藝中采用的表達(dá)體系和使用的抗生素類(lèi)型，采用經(jīng)驗(yàn)證的方法測(cè)定殘余抗生素含量/活性，并根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)分析規(guī)定可接受的限量要求。不應(yīng)有殘余抗生素活性。中，氨芐西林殘留量也可采用高效液相色譜-質(zhì)譜法。推薦液相色譜條件可采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動(dòng)相A為水(甲酸0.1%),流動(dòng)相B為乙腈(甲酸0.1%)梯度洗脫；質(zhì)譜采用電噴霧電離離子源(ESI)為離子源。65.5.7促炎性污染物(肽聚糖等)采用經(jīng)驗(yàn)證的方法或經(jīng)驗(yàn)證的市售細(xì)菌肽聚糖檢測(cè)試劑盒(ELISA)檢測(cè)殘留肽聚糖，應(yīng)根據(jù)其致熱反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)規(guī)定可接受的限量要求。耦合等離子體質(zhì)譜法”進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果應(yīng)符合標(biāo)示的限量要求?！?0μg/g(質(zhì)量分?jǐn)?shù))?；蛳喈?dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行測(cè)定(應(yīng)進(jìn)行方法學(xué)確認(rèn)和驗(yàn)證),其結(jié)果應(yīng)符合限量要求：砷(As)≤1μg/g,汞(Hg)≤4μg/g,鉛(Pb)≤15μg/g,鉻(Cr)、鎘(Cd)≤50μg/g(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。預(yù)期植入用的重組膠原蛋白成品中銅(Cu)、鉬(Mo)、鐵(Fe)、鎳(Ni)均≤5如果使用了防腐劑、凍干保護(hù)劑等添加劑，應(yīng)給出其限量要求和檢測(cè)方法。5.6.1重組膠原蛋白含量用總蛋白含量和純度計(jì)算?？偟鞍缀康臏y(cè)定按照《中華人民共和國(guó)藥典》“蛋白質(zhì)含量測(cè)定法”的“凱氏定氮法”進(jìn)行測(cè)定，純度按5.4進(jìn)行檢測(cè)。含量結(jié)果應(yīng)在標(biāo)示量的如果是液體或凝膠狀樣品，以重組膠原蛋白含量除以樣品總體積，即可得到相對(duì)于單位體積樣品中重組膠原蛋白的相對(duì)含量數(shù)據(jù)，標(biāo)示為mg/mL;如果為固體樣品或凍干品，以重組膠原蛋白含量除以總質(zhì)量，即可得到單位質(zhì)量樣品中重組膠原蛋白的相對(duì)含量數(shù)據(jù)，標(biāo)示為mg/mg。5.6.2特征多肽法：用高效液相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行特異性特征多肽的定量檢測(cè)，得到重組膠原蛋白特征多肽含量。基于特異性特征多肽的高效液相色譜-質(zhì)譜方法按照YY/T1805.3的規(guī)定進(jìn)行。N-連接和O-連接的寡糖、糖基化、聚集等)?？墒褂酶叻直媛噬V質(zhì)譜技術(shù)(如：LCMS-QTOF)對(duì)樣品適宜的蛋白質(zhì)酶(如：胰蛋白酶)酶解產(chǎn)物進(jìn)行肽圖指紋圖譜分析，通過(guò)將天冬酰胺脫酰胺化和甲硫氨酸氧化修飾設(shè)置為可變修飾，分析多見(jiàn)的脫酰胺化和氧化異質(zhì)性。應(yīng)通過(guò)適合的理化方法分析高級(jí)結(jié)構(gòu)，并通過(guò)生物學(xué)功能進(jìn)行確證，也可采用體外或體內(nèi)證實(shí)其發(fā)揮功能或作用的分析方法，作為高級(jí)結(jié)構(gòu)確證的補(bǔ)充。應(yīng)采用氨基酸序列分析儀或質(zhì)譜法進(jìn)行氨基酸序列分析。其結(jié)果應(yīng)符合理論序列。每種重組膠原蛋白都有其特征的紅外光譜，供試品的紅外光譜圖應(yīng)與參比品一致。光譜圖應(yīng)規(guī)定7膠原的CD譜圖在195nm附近的波長(zhǎng)處有負(fù)峰，在221nm附近的波長(zhǎng)處有正峰。如果檢測(cè)不到在221nm附近處的正峰，則提示沒(méi)有三螺旋結(jié)構(gòu)。如果定性檢測(cè)證實(shí)供試品中有三螺旋結(jié)構(gòu)，則可利用不同比例的系列膠原蛋白對(duì)照品和其完全變性的膠原蛋白對(duì)照品混合物作為外標(biāo)法對(duì)照品，與在221nm附近波長(zhǎng)處的正峰強(qiáng)度進(jìn)行擬合，實(shí)現(xiàn)三螺旋含量的相對(duì)定量分析。推薦使用組織提取膠原蛋白國(guó)家醫(yī)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為對(duì)照品。膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)的特征表現(xiàn)出特定的吸收峰，如組織提取牛I型膠原蛋白在(43±1)℃有吸收峰，如果檢測(cè)不到特征峰則提示供試品中沒(méi)有三螺旋結(jié)構(gòu)。如果定性檢測(cè)已證實(shí)供試品含有三螺旋結(jié)構(gòu)，則可利用不同比例的系列膠原蛋白對(duì)照品和其完全變性的膠原蛋白對(duì)照品混合物作為外標(biāo)法對(duì)照品，對(duì)三螺旋含量進(jìn)行相對(duì)定量分析。推薦使用組織提取膠原蛋白國(guó)家醫(yī)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為對(duì)照品。結(jié)構(gòu)的單鏈含量，間接獲得三螺旋結(jié)構(gòu)的含量比。通過(guò)加熱變性處理和非加熱變性處理樣品的蛋白酶酶解產(chǎn)物中特征多肽含量的比較分析，如果二者特征多肽檢測(cè)的響應(yīng)強(qiáng)度(譜峰高度或面積)一致，則提示無(wú)三螺旋結(jié)構(gòu)；如果加熱變性處理后樣品的響應(yīng)強(qiáng)度明顯高于非加熱變性處理樣品，則提示可能含有三螺旋結(jié)構(gòu)。如果重組膠原蛋白中存在三螺旋結(jié)構(gòu)，應(yīng)選擇2種或2種以上方法進(jìn)行充分的表征和確證。推薦使用組織提取膠原蛋白對(duì)照品進(jìn)行對(duì)比分析。如適用，應(yīng)進(jìn)行脯氨酸羥基化分析，按照YY/T1453規(guī)定的方法，使用氨基酸分析儀定量檢測(cè)羥脯如適用，應(yīng)進(jìn)行糖譜/糖基化修飾分析，參照《中華人民共和國(guó)藥典》“單抗N糖譜測(cè)定定，供試品測(cè)定結(jié)果應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)。必要時(shí)應(yīng)將供試品與參比品進(jìn)行比較。重組膠原蛋白的生物學(xué)功能是指以重組膠原蛋白生物學(xué)特性相關(guān)屬性為基礎(chǔ)的生物學(xué)作用，對(duì)聲稱(chēng)的生物學(xué)功能宜進(jìn)行定性/定量分析。膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分。重組膠原蛋白的主要生物學(xué)功能是為細(xì)胞提供支架和良好的微環(huán)境，如促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖生長(zhǎng)、分化等。因此，可通過(guò)評(píng)價(jià)細(xì)胞-膠原蛋白相互作用來(lái)評(píng)價(jià)重組膠原蛋白的生物學(xué)功能。8用重組膠原蛋白包被細(xì)胞培養(yǎng)板或其他經(jīng)驗(yàn)證的方法，采用合適的預(yù)期臨床應(yīng)用時(shí)可能接觸的細(xì)胞(如皮膚成纖維細(xì)胞),接種密度在50%左右，常規(guī)培養(yǎng)2天～3天后檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，考察重組膠原蛋白包被梯度濃度的劑量-效應(yīng)關(guān)系。具體檢測(cè)方法可采用MTT法、CCK8法等進(jìn)行檢測(cè)(按照試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行),采用無(wú)重組膠原蛋白包被的細(xì)胞培養(yǎng)板作為對(duì)照，分析細(xì)胞增殖率。如需要，可采用組織提取膠原蛋白國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照材料，對(duì)比分析重組膠原蛋白的促細(xì)胞增殖用重組膠原蛋白包被細(xì)胞培養(yǎng)板或其他經(jīng)驗(yàn)證的方法，采用合適的預(yù)期臨床應(yīng)用時(shí)可能接觸的細(xì)胞(如皮膚成纖維細(xì)胞),接種密度在90%左右，常規(guī)培養(yǎng)3天～7天后檢測(cè)細(xì)胞分化情況。具體方法可采用RT-PCR方法測(cè)定細(xì)胞的分化標(biāo)志物(如：a-SMA、Vimentin、Fibroblastsurfaceantigen),采用無(wú)重組膠原蛋白包被的細(xì)胞培養(yǎng)板作為對(duì)照，分析細(xì)胞分化情況。如需要，可采用組織提取膠原蛋白國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照材料，對(duì)比分析重組膠原蛋白的促細(xì)胞分化細(xì)胞貼壁情況可通過(guò)細(xì)胞貼壁率試驗(yàn)簡(jiǎn)單地評(píng)價(jià)細(xì)胞黏附性。但是，細(xì)胞黏附性還包括細(xì)胞黏附強(qiáng)度(相對(duì)細(xì)胞黏附百分比),按照附錄B或其他經(jīng)驗(yàn)證的方法進(jìn)行。如需要，可采用組織提取膠原蛋白國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照材料，對(duì)比分析重組膠原蛋白的細(xì)胞黏附重組膠原蛋白用于組織修復(fù)與重建時(shí)，應(yīng)有利于細(xì)胞的識(shí)別、移行，細(xì)胞移行試驗(yàn)按照附錄C或其他經(jīng)驗(yàn)證的方法進(jìn)行。如需要，可采用組織提取膠原蛋白國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照材料，對(duì)比分析重組膠原蛋白的細(xì)胞的識(shí)5.9安全性試驗(yàn)應(yīng)根據(jù)所采用的表達(dá)體系(細(xì)菌、酵母或其他真核細(xì)胞等)而定，檢測(cè)指標(biāo)包括，但不限于如下幾項(xiàng)。如果重組膠原蛋白成品以無(wú)菌的方式提供，則應(yīng)按照GB18278.1、GB18279.1、GB18280.1對(duì)滅菌9如果重組膠原蛋白成品以非無(wú)菌的方式提供，每1g、1mL或10cm2供試品中需氧菌總數(shù)不得超過(guò)102CFU,霉菌和酵母菌菌落數(shù)不得超過(guò)10CFU,不得檢出大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單檢測(cè)方法：用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液或pH7.2無(wú)菌磷酸鹽緩沖液制備供試品溶液。按照《中華人民共和國(guó)藥典》“非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法”“非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度重組膠原蛋白穩(wěn)定性受多種因素影響，包括純化工藝、微生物負(fù)載、包裝貯存條件等。重組膠原蛋性進(jìn)行動(dòng)態(tài)評(píng)價(jià)和分析。與穩(wěn)定性相關(guān)的工藝驗(yàn)證宜采用連續(xù)三批次重組膠原蛋白進(jìn)行。在相關(guān)工藝條件無(wú)變化時(shí)，每年宜進(jìn)行至少一個(gè)批次產(chǎn)品的穩(wěn)定性檢驗(yàn)。在工藝條件有變化時(shí)，應(yīng)考慮對(duì)重組膠原蛋白穩(wěn)定性的影響，必要時(shí)進(jìn)行再次驗(yàn)證。7生物學(xué)評(píng)價(jià)作為制備醫(yī)療器械產(chǎn)品的原材料，應(yīng)按照GB/T16886.1的要求對(duì)重組膠原蛋白進(jìn)行相應(yīng)必要的生物學(xué)評(píng)價(jià)。基于部分人膠原蛋白核酸序列進(jìn)行編輯組合而重組的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，可能引起人體預(yù)測(cè)不到的免疫原性，特別是長(zhǎng)期反復(fù)使用時(shí)。因此，如果不能排除免疫原性風(fēng)險(xiǎn)，則宜增加免疫學(xué)研究。試驗(yàn)方法應(yīng)按照GB/T16886.20及YY/T1465系列標(biāo)準(zhǔn)的要求進(jìn)行。如果產(chǎn)品以非無(wú)菌的方式提供，可將樣品滅菌后用于生物學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)，宜考慮滅菌方式及滅菌對(duì)重組膠原蛋白的影響。8.1若生產(chǎn)商作為本單位研發(fā)醫(yī)療器械產(chǎn)品的初始材料(原材料)時(shí)，應(yīng)按照醫(yī)療器械生產(chǎn)中對(duì)原材料8.2若生產(chǎn)商作為醫(yī)療器械研發(fā)的原材料銷(xiāo)售時(shí)，應(yīng)提供必要的信息，在品名和來(lái)源的信息中應(yīng)至少包括：表達(dá)體系、DNA模板種屬及其膠原蛋白類(lèi)型、氨基酸長(zhǎng)度和編輯情況，如：(aaX—aaY)n(重復(fù)次數(shù)),并建議考慮相關(guān)醫(yī)療器械產(chǎn)品對(duì)原材料包裝、貯存、運(yùn)輸?shù)囊蟆?資料性)重組膠原蛋白特性分析研發(fā)階段對(duì)重組膠原蛋白的理化特性、生物學(xué)功能/作用、免疫學(xué)特性、純度和雜質(zhì)等進(jìn)行嚴(yán)格的特性分析鑒定是建立并確定產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)。需采用廣泛的分析技術(shù)來(lái)表征其理化性質(zhì)(如：分子量、等電點(diǎn)、氨基酸組成、疏水性等),以及對(duì)糖基化等各種翻譯后修飾進(jìn)行充分鑒定，并納入適當(dāng)?shù)臋z測(cè)，以確認(rèn)終產(chǎn)物具有預(yù)期的構(gòu)象、聚集和(或)降解狀態(tài)及其高級(jí)結(jié)構(gòu)。A.2.1一級(jí)結(jié)構(gòu)包括二硫鍵(氫鍵)連接方式的氨基酸序列。宜測(cè)定目標(biāo)產(chǎn)品的氨基酸序列，并與其基因序列推斷的理論氨基酸序列進(jìn)行比較。氨基酸序列測(cè)定還宜考慮可能存在的N端甲硫氨酸(如大腸桿菌來(lái)源的制品),信號(hào)肽或前導(dǎo)序列和其他可能的N端、C端修飾(如乙?；Ⅴ０坊蛘哂捎谕庠疵笇?dǎo)致的部分降解以及C端加工、N端焦谷氨酸等),以及各種其他異質(zhì)性(如脫酰胺化、氧化、異構(gòu)化、碎片化、二硫鍵錯(cuò)配、N-連如有(如酵母菌發(fā)酵工藝或其他真核細(xì)胞表達(dá)體系制備的產(chǎn)品),則宜對(duì)糖基化修飾進(jìn)行全面的分析和確定，如糖基化修飾與產(chǎn)品半衰期和生物學(xué)作用相關(guān)，則宜確定糖的含量(如中性糖、氨基糖和唾液酸)。糖型結(jié)構(gòu)可能與不良反應(yīng)相關(guān)(如非人類(lèi)的糖型結(jié)構(gòu)或其殘基),宜盡可能對(duì)糖鏈的結(jié)構(gòu)、糖型以及多肽鏈的糖基化位點(diǎn)進(jìn)行深入分析。必要時(shí)應(yīng)進(jìn)一步就電荷異質(zhì)性進(jìn)行檢測(cè)分析。A.2.3高級(jí)結(jié)構(gòu)如有，則宜通過(guò)適合的理化方法分析高級(jí)結(jié)構(gòu)，并且通過(guò)生物學(xué)功能或作用來(lái)確認(rèn)。生物學(xué)功能或作用是對(duì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的確證，也可采用體外或體內(nèi)證實(shí)其發(fā)揮功能或作用的分析方法，作為高級(jí)結(jié)構(gòu)確證A.3.1概述：重組膠原蛋白的雜質(zhì)主要包括自身相關(guān)雜質(zhì)、工藝相關(guān)雜質(zhì)以及外源污染物。宜盡可能地對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行分析鑒定，并采用適宜的方法評(píng)價(jià)其對(duì)生物學(xué)功能的影響。A.3.2自身相關(guān)物質(zhì)/雜質(zhì)：主要源于重組膠原蛋白的異質(zhì)性和降解產(chǎn)物。需要對(duì)目標(biāo)重組膠原蛋白的各種分子變異體進(jìn)行分離、鑒別和分析。如變異體的功能與目標(biāo)產(chǎn)物一致時(shí)可不做雜質(zhì)考慮。但宜考慮在生產(chǎn)和/或貯存期間產(chǎn)品降解產(chǎn)物是否顯著增加及其與免疫原性的相關(guān)性。A.3.3工藝相關(guān)雜質(zhì)：包括來(lái)源于生產(chǎn)工藝本身，如細(xì)胞基質(zhì)來(lái)源、細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)源和下游工藝。宜對(duì)潛在的工藝相關(guān)雜質(zhì)(如宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、宿主細(xì)胞DNA、細(xì)胞培養(yǎng)殘留物、下游工藝的殘留物等)進(jìn)行鑒A.3.4污染物：指所有引入的，且并非生產(chǎn)過(guò)程所需的物質(zhì)(如各種微生物、細(xì)菌內(nèi)毒素)。此外，還宜考慮采用其他適宜檢測(cè)方法對(duì)可能污染的包括肽聚糖等在內(nèi)的非細(xì)菌內(nèi)毒素促炎性污染物進(jìn)行控制。A.4生物學(xué)功能評(píng)價(jià)重組膠原蛋白實(shí)現(xiàn)預(yù)期的生物學(xué)功能的特定能力、潛力，如膠原蛋白-細(xì)胞相互作用。同時(shí)也宜關(guān)注可能引起的負(fù)效應(yīng)?；诓糠秩四z原蛋白核酸序列進(jìn)行編輯組合而重組的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，作為一種完整的蛋白質(zhì)物質(zhì)屬于非人體內(nèi)存在的全新蛋白質(zhì)，需要進(jìn)行詳盡的結(jié)構(gòu)分析和生物學(xué)功能(正向、負(fù)向)分析。A.5免疫化學(xué)特性天然膠原蛋白有一定的糖基化，酵母發(fā)酵技術(shù)制備的膠原蛋白產(chǎn)物可能有輕度的糖基化。糖基化可能影響產(chǎn)品的生物學(xué)功能和免疫原性，宜進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶匦匝芯?。必要時(shí)宜對(duì)目標(biāo)分子中與相應(yīng)表位作用的部分進(jìn)行分析確證，包括對(duì)這些結(jié)構(gòu)的生物化學(xué)鑒別(如蛋白質(zhì)、低聚糖、糖合的特征研究(如氨基酸序列和糖型)?；诓糠秩四z原蛋白核酸序列進(jìn)行編輯組合而重組的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，不僅可能影響產(chǎn)品的生物學(xué)功能，也可能引起預(yù)測(cè)不到的免疫原性，特別是長(zhǎng)期反復(fù)使用時(shí)，因免疫原性評(píng)價(jià)。A.6含量膠原蛋白含量以質(zhì)量/質(zhì)量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))或質(zhì)量/體積(質(zhì)量濃度)表示。進(jìn)行目標(biāo)蛋白質(zhì)含量檢測(cè)時(shí)宜除外宿主蛋白質(zhì)殘留等雜蛋白?？赏ㄟ^(guò)高效液相色譜法(HPLC)或絕對(duì)定量的方法，如：利用合成的能夠代表擬測(cè)定的重組膠原蛋白產(chǎn)物的特征多肽標(biāo)準(zhǔn)品外標(biāo)法，采用高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)技術(shù)進(jìn)行膠原蛋白含量測(cè)定，并可用于鑒別、溯源和驗(yàn)A.7參比品宜選擇已證明足夠穩(wěn)定或用一個(gè)代表性批次作為參比品，用于鑒別、理化和生物學(xué)活性等各種分析，并按特性分析要求進(jìn)行全面分析鑒定。用于理化測(cè)定等方面的對(duì)照品，如用于肽圖或等電點(diǎn)測(cè)定的對(duì)照品，可用原液直接分裝制備，一般-70℃以下或經(jīng)驗(yàn)證的貯存條件下保存。根據(jù)重組DNA蛋白制品特性，對(duì)照品宜進(jìn)行必要的分析鑒二硫鍵分析及糖基分析(酵母或其他真核細(xì)胞表達(dá))等。(規(guī)范性)細(xì)胞黏附性測(cè)定——離心法B.1試驗(yàn)原理為研究材料與細(xì)胞的黏附作用大小，可通過(guò)離心法定量測(cè)定膠原蛋白與細(xì)胞形成黏附后分離所需的力。將細(xì)胞懸液在涂有膠原蛋白的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)一定時(shí)間，用熒光標(biāo)記細(xì)胞，在最佳相對(duì)離心力(RCF)洗脫未黏附的細(xì)胞，測(cè)定離心前后細(xì)胞分離百分比，評(píng)價(jià)待測(cè)重組膠原蛋白樣品的相對(duì)促細(xì)胞黏附性。試驗(yàn)原理示例圖見(jiàn)圖B.1。離心后細(xì)胞計(jì)數(shù)離心后細(xì)胞計(jì)數(shù)反轉(zhuǎn)板子和離心粘合密封物鏡圖B.1細(xì)胞黏附性測(cè)定——離心法試驗(yàn)原理示例圖a)試驗(yàn)細(xì)胞：如NIH/3T3細(xì)胞(ATCCCRL-1658小鼠胚胎成纖維細(xì)胞);b)陰性D-PBS溶液；c)對(duì)照材料：膠原蛋白國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品；e)細(xì)胞培養(yǎng)板(96孔，平底)、封口膜(醋酸密封帶或等效材料)、鋁箔。B.3試驗(yàn)步驟與方法向96孔板內(nèi)分別加入100μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品、D-PBS空白對(duì)照。每個(gè)樣品包被制備4個(gè)孔，在37℃,5%CO?培養(yǎng)箱中孵育1h～4h。從孔中除去多余的包被溶液，加入100μL1%BSA-PBS溶液，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育1h。移除孔內(nèi)液體后，用D-PBS洗滌三次，棄除清洗液，用封口膜密封后置于4℃?zhèn)溆?。B.3.2細(xì)胞制備將NIH/3T3細(xì)胞于37℃,5%CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天在倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞密度及狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶的80%～90%時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代或細(xì)胞接種。使用已經(jīng)與Hoechst33342熒光染色劑(10%)預(yù)混合的完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞稀釋至5×10*/mL。將100μL細(xì)胞加入孔中，用鋁箔覆蓋，并在37℃,5%CO?下孵育1h。測(cè)量3個(gè)重復(fù)樣品，第4個(gè)孔用來(lái)調(diào)整顯微鏡參數(shù)，不使用其測(cè)B.3.3檢測(cè)確定最佳相對(duì)離心力(RCF),使膠原蛋白國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)細(xì)胞黏附性比值宜為50%～60%。使中取出上清液。用D-PBS清洗1次后，加入100μLD-PBS。對(duì)于3個(gè)孔中的每個(gè)孔進(jìn)行拍攝。計(jì)算每個(gè)樣品大約2400個(gè)～3600個(gè)細(xì)胞[(800細(xì)胞/孔～1200細(xì)胞/孔)×3孔]。(規(guī)范性)細(xì)胞移行試驗(yàn)——細(xì)胞劃痕法C.1試驗(yàn)原理