大皰性系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者皮膚基底膜帶自身抗體的靶抗原定位研究

1、    大皰性系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者皮膚基底膜帶自身 抗體的靶抗原定位研究        1示IgG結(jié)合200000、130000、97000表皮抗原；2示IgG結(jié)合130000真皮抗原；3示BP血清IgG結(jié)合180000表皮抗原；4示EBA血清IgG結(jié)合290000真皮抗原；5示正常人血清不與真皮抗原反應(yīng)；M為標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量蛋白1BSLE患者血清中IgG與真、表皮抗原反應(yīng)情況大皰性系統(tǒng)性紅斑狼瘡（BSLE）是系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）中較少見(jiàn)的一種特殊類(lèi)型。我們?cè)?jīng)檢出B

2、SLE患者血清中存在皮膚基底膜帶自身抗體（BMZAb）1，其靶抗原大部分與獲得性大皰性表皮松解癥（EBA）或大皰性類(lèi)天皰瘡（BP）相同。國(guó)外亦有研究表明型膠原是BSLE的靶抗原24。我們進(jìn)一步采用免疫印跡（IB）、間接免疫熒光（IIF）及金標(biāo)記間接免疫電子顯微鏡（goldIIEM）技術(shù)檢測(cè)1例BSLE患者血清中BMZ自身抗體，并用親和純化抗體對(duì)其靶抗原進(jìn)行了定位研究。 一、材料與方法5，患者血清按120稀釋。真、表皮抗原的提取及IB方法參見(jiàn)文獻(xiàn)6，患者血清按15110稀釋。2.抗體的親和純化：親和純化結(jié)合真皮130000抗原IgG的方法參照文獻(xiàn)7并稍加改進(jìn)。在130000處切下約1cm寬的水平

3、條帶，在其下方切同樣寬度的NC條作對(duì)照，用50mmol/LTrisHCl緩沖液（含0.3吐溫20,0.5BSA,0.5mol/LNaCl,pH7.4）按15稀釋患者血清總量至3mL孵育過(guò)夜。0.15mol/LNaCl及0.01mol/LPBS各洗3次，500L抗體洗脫液（含0.2mol/L甘氨酸,1mmol/LEDTA,pH2.8）洗20min，洗脫液用1mol/LTris調(diào)pH值至7.0。3.IIEM：IIEM方法參見(jiàn)文獻(xiàn)8，患者血清稀釋度為140。親和純化的BMZAb靶抗原的定位方法亦根據(jù)文獻(xiàn)8進(jìn)行，僅將血清改為親和純化的抗體洗脫液。二、結(jié)果1.鹽裂皮膚IIF：IIF檢測(cè)BSLE患者血清中

4、BMZAb顯示,熒光抗體結(jié)合于鹽裂皮膚的真皮側(cè)，其抗體滴度為1640。作為對(duì)照的BP及EBA患者血清中BMZAb分別結(jié)合于鹽裂皮膚的表皮側(cè)和真皮側(cè)；正常人血清未發(fā)生反應(yīng)。2.IB：BSLE患者血清IgG型BMZAb與正常人表皮提取物相對(duì)分子質(zhì)量為200000、130000、97000及真皮提取物相對(duì)分子質(zhì)量為130000抗原結(jié)合。BP及EBA血清分別與表皮相對(duì)分子質(zhì)量為180000抗原和真皮290000抗原反應(yīng)。正常人血清未見(jiàn)陽(yáng)性條帶（1）。親和純化結(jié)合真皮130000抗原的IgG型自身抗體再次與表皮或真皮提取物反應(yīng)時(shí)，只與真皮130000抗原反應(yīng)。3.goldIIEM：以正常人皮膚為底物研究

5、BSLE血清中BMZAb發(fā)現(xiàn)，金顆粒主要沉積于富含錨原纖維的致密板下方，少數(shù)位于致密板及透明板內(nèi)，半橋粒上未見(jiàn)沉積，角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)部可見(jiàn)金顆粒的非特異性沉積（2）。以親和純化的抗體進(jìn)行IIEM研究，發(fā)現(xiàn)金顆粒主要沉積于致密板下，少數(shù)位于致密板內(nèi)（3）。BP患者血清BMZAb結(jié)合于透明板內(nèi)部，正常人血清未見(jiàn)金顆粒的特異性沉積。    2金標(biāo)記產(chǎn)接免疫電子顯微鏡顯示BSLE血清IgG與正常人皮膚反應(yīng),金顆粒主要沉積于富含錨原纖維的致密板下方,少數(shù)位于致密板及透明板內(nèi).LL:透明板;LD:致密板;AF:錨原纖維(×30000)3金標(biāo)記間接免疫電子顯微

6、鏡顯示和純化結(jié)合真皮提取物1300000抗原的IgG與正常人皮膚反應(yīng)時(shí),金顆粒特異性沉積于致辭密板下及致密內(nèi)部.LL:透明板;LD:致密板;AF:錨原纖維(×40000)三、討論越來(lái)越多的研究表明，BSLEBMZ自身抗原存在明顯的異質(zhì)性，除了早期公認(rèn)的型膠原外，已報(bào)道的可被BSLE自身抗體識(shí)別的BMZ成分有BPAG1、板層素5、板層素6等9。我們的結(jié)果表明，本例BSLE患者血清中自身抗體分別與真皮提取物130000抗原及表皮提取物200000、130000、97000抗原反應(yīng)。IIEM研究發(fā)現(xiàn)自身抗體除主要結(jié)合于致密下層外，也有少量位于透明板和致密板內(nèi)，這與IB研究結(jié)果相一致。綜合上

7、述研究結(jié)果，我們認(rèn)為SLE作為一種自身免疫性疾病，本身就具有針對(duì)多種細(xì)胞內(nèi)抗原及細(xì)胞外基質(zhì)抗原的自身抗體，BSLE作為SLE病譜中一特殊類(lèi)型，亦有可能存在與BP、EBA等自身免疫性疾病相同的靶抗原。本例患者的自身抗體雖然與多種BMZ抗原反應(yīng)，但以結(jié)合鹽裂皮膚真皮側(cè)的抗體滴度最高。實(shí)驗(yàn)證實(shí)BMZAb不結(jié)合型膠原，而以結(jié)合真皮側(cè)130000抗原為主，推測(cè)真皮130000抗原抗體反應(yīng)可能是導(dǎo)致皮膚水皰的直接原因。目前已報(bào)道的BMZ中相對(duì)分子質(zhì)量為130000的分子有64整合素的6亞單位10及uncein中的一種多肽成分，前者位于半橋粒內(nèi)，后者主要位于透明板中，可能是錨細(xì)絲中的一種成分11。我們通過(guò)I

8、IEM研究發(fā)現(xiàn)，該患者的自身抗體所結(jié)合的真皮側(cè)130000抗原定位于致密板下邊緣及致密板內(nèi)部，且與型膠原不存在交叉反應(yīng)，從其所在的位置來(lái)看，該抗原與上述兩種分子均不相同。從患者臨床表現(xiàn)有全身泛發(fā)的張力性水皰及其具有高滴度的結(jié)合真皮130000分子的自身抗體推測(cè)，該分子可能在表皮真皮粘附中發(fā)揮作用。國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（39570659）劉江波（山東省濱州市立醫(yī)院皮膚性病科，256600）張學(xué)軍（安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科合肥市，230022）王再興（安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科合肥市，230022）楊森（安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科合肥市，230022）楊春俊（安徽醫(yī)科

9、大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科合肥市，230022）王培光（安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科合肥市，230022）郝麗（安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科合肥市，230022）向全桂（安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科合肥市，230022）參 考 文 獻(xiàn) 2， Burge S, Schomberg K, Wojnarowska F. Bullous eruption of SLE a case report and investigation of the relationship of anti basement membrane zone antibodies to blistering.

10、Clin Exp Dermatol, 1991,16:133 138.3， Gammon WR, Heise ER, Burke WA, et al. Increased frequency of HLA DR2 in patients with autoantibodies to epidermolysis bullosa acquisita antigen: evidence that the expression of autoimmunity to type collagen is HLA class allele associated. J Invest Dermatol, 1988

11、,91:228 232.4， Woodley DT, Sarret Y, Briggaman RA. Autoimmunity to type collagen. Semin Dermatol, 1991,10:232 239.7， Mueller S, Klaus Kovtun V, Stanley JR. A 230kD basic protein is the major bullous pemphigoid antigen. J Invest Dermatol, 1989,92: 33 38.9， Chan LS, Lapiere JC, Chen M, et al. Bullous

12、systemic lupus erythematosus with autoantibodies recognizing multiple skin basement membrane components, bullous pemphigoid antigen 1, laminin 5, laminin 6, and type VII collagen. Arch Dermatol, 1999,135:569 573.10， Borradori L, Sonnenberg A.Hemidesmosomes: roles in adhesion, signaling and human diseases.