RNA干擾技術(shù)及防治水產(chǎn)動(dòng)物疾病專(zhuān)利技術(shù)現(xiàn)狀

1、RNA干擾技術(shù)防治水產(chǎn)動(dòng)物疾病專(zhuān)利技術(shù)現(xiàn)狀RNA干擾技術(shù)(RNA interference, RNAi)是山內(nèi)源性或外源性短鏈RNA誘導(dǎo) 同源mRNA降解，導(dǎo)致基因沉默的現(xiàn)象。從理論上來(lái)講，兒乎所有涉及到基因異常 高表達(dá)的人類(lèi)、動(dòng)物、植物疾病都有可能設(shè)計(jì)出相應(yīng)的siRNA來(lái)沉默疾病相關(guān)基 因，從而達(dá)到治療目的。由于RNAi在動(dòng)植物抵抗外源病毒、生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控方面起 著重要作用，而且在功能基因組研究、基因治療方面有著廣泛的應(yīng)用前景，2001、 2002年-RNAi技術(shù)連續(xù)兩次被Science)雜志評(píng)為當(dāng)年十大科學(xué)成就之一，并且 Fire A和Mello C兩位科學(xué)家因在RNA干擾領(lǐng)域的突出貢獻(xiàn)獲得

2、了 2006年度諾貝 爾醫(yī)學(xué)/生理學(xué)獎(jiǎng)。近兒年在國(guó)際上也掀起了一股研究RNAi的熱潮。一、RNA干擾技術(shù)簡(jiǎn)介(-)RNA干擾技術(shù)的發(fā)展歷史1990年，Napoli和van der Krol等共同發(fā)現(xiàn)了植物體轉(zhuǎn)基因的共抑制現(xiàn) 象。Napoli等將外源色素合成基因?qū)氚珷颗；ㄖ?，試圖加深花朵的紫顏色，結(jié) 果多數(shù)花瓣顏色并未加深，反而成了花斑的其至白的，這是因?yàn)閷?dǎo)入的基因及與其 相似的內(nèi)源基因同時(shí)都被抑制所致?！綨apoli C, Lemieux C, Jorgensen R. Introduction of a chimeric chaicone synthase gene into petuni

3、a results in reversible co-suppression of homologous genes in trans. Plant Cell, 1990, 2 (4) : 2792289.1995年康乃爾大學(xué)的Guo和Kemphues利用反義RNA技術(shù)試圖阻斷秀麗新小 桿線(xiàn)蟲(chóng)par-1基因的表達(dá)，同時(shí)在對(duì)照組實(shí)驗(yàn)中給線(xiàn)蟲(chóng)注射正義RNA,以期觀察 到基因表達(dá)增強(qiáng)的結(jié)果。但結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)正義RNA分子與反義RNA分子均能夠阻斷 par-1基因的表達(dá)。他們認(rèn)為正義RNA分子的這種作用是實(shí)驗(yàn)誤差而沒(méi)有進(jìn)行深入 研究。直到1998年，華盛頓卡耐基研究院的Fire A和馬薩諸塞大學(xué)癌癥中心的

4、Mello C首次將dsRNA正義鏈和反義鏈的混合物注入線(xiàn)蟲(chóng)，結(jié)果表現(xiàn)岀比單獨(dú)注射正義鏈或者反義鏈都要強(qiáng)得多的基因沉默現(xiàn)象，實(shí)際上這正是雙鏈RNA分子 在起阻斷基因表達(dá)的作用。他們將這種現(xiàn)象稱(chēng)為RNAio Fire A, XuS, MontgomeryMK, et al. Potent and specific genetic interference by double2stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Naure, 1998, 391 (6669): 8062811.(二) RNA干擾技術(shù)的原理RNA干擾的機(jī)制迄今還在不斷探索之中，U前公認(rèn)的R

5、NA干擾技術(shù)基本原理 包括兩個(gè)步驟。笫一步：siRNA的合成。長(zhǎng)雙鏈RNA分子在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)一種RNA酶 IIKRNAaselll核酸內(nèi)切酶)Dicer的酶切作用，dsRNA被分割成很多長(zhǎng)度約2123 個(gè)堿基對(duì)的雙鏈siRNA分子。第二步：siRNA與Dicer形成RNA引導(dǎo)沉默的復(fù)合 體(RNA-induced silencing complex, RISC),介導(dǎo) RISC 對(duì)靶 mRA 的切割。siRNA 作為引導(dǎo)序列，按照堿基互補(bǔ)原則識(shí)別靶基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA,并引導(dǎo)RICS結(jié)合 mRNAo隨后siRNA與mRNA在復(fù)合體中換位，核酸酶Dicer將mRNA切割成21 23nt的片段，特異性

6、地抑制靶基因的表達(dá)。而新產(chǎn)生的dsRNA片段可再次形成 RISC,繼續(xù)降解mRNA,從而產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)。因此，每個(gè)細(xì)胞只需要兒個(gè)siRNA 分子就能夠引起強(qiáng)烈的RNAi效應(yīng)。此外，siRNA還可以在RNA依賴(lài)性RNA聚合 酶(RNA dependentRNA polymerase, RdRp)的作用下進(jìn)行大量擴(kuò)增，并轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì) 胞，使RNAi擴(kuò)散到整個(gè)機(jī)體并可以傳代NykanesA, Haley B, Zamore PD. ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway.

7、Cell, 2001, 107 (3) : 3092321.。(三) RNA干擾技術(shù)的特點(diǎn)與傳統(tǒng)的基因抑制工具相比，RNA干擾具有非常顯著的優(yōu)點(diǎn)【RNA干擾的生物 學(xué)原理與應(yīng)用，宋爾衛(wèi)，高等教育岀版社2005年6月第1版】。具體而言，RNAi 具有以下特征：1. 普遍性自然界的大部分物種都存在RNAi機(jī)制，從植物、低等動(dòng)物到人類(lèi)。兒乎已知 的基因都能被RNAi沉默。2. 特異性RNAi具有很高的特異性，siRNA嚴(yán)格按照堿基配對(duì)與inRNA位點(diǎn)結(jié)合，只降解 與之序列相應(yīng)的單個(gè)內(nèi)源基因的mRNAo3. 高效性抑制基因表達(dá)具有很高的效率，相對(duì)很少量的dsRNA分子（數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于內(nèi)源 mRNA的數(shù)量

8、）就能完全抑制相應(yīng)基因的表達(dá)，是以催化放大的方式進(jìn)行的，比反義 寡核昔酸和核酶沉默目標(biāo)基因的效應(yīng)強(qiáng)約101000倍不等。（四）RNA干擾分子的制備目前為止，較為常用的有5種制備siRNA方法，包括：化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn) 錄法、RNaselll或Dicer酶切dsRNA、siRNA表達(dá)載體法和siRNA表達(dá)框法。【鄭 亞婷等，RNA干擾技術(shù)及其應(yīng)用，醫(yī)學(xué)綜述2010年3月第16卷第5期】1. 化學(xué)合成法設(shè)計(jì)出siRNA序列后，由專(zhuān)用合成儀按照序列進(jìn)行合成及后續(xù)的純化，可得 到高純度siRNA, U前已經(jīng)可以商品化提供。該方法的優(yōu)點(diǎn)是得到的siRNA純度高 且無(wú)需任何其他實(shí)驗(yàn)，但缺點(diǎn)是價(jià)格昂貴，適用

9、于已經(jīng)找到最有效的siRNA序列， 需要大量制備siRNA進(jìn)行研究的情況，不適合于篩選siRNA序列。2. 體外轉(zhuǎn)錄法在體外，以寡聚DNA核昔酸為模板，在T7RNA聚合酶的催化作用下體外轉(zhuǎn)錄 出雙鏈的siRNA分子。該方法的優(yōu)點(diǎn)是費(fèi)用節(jié)約，試劑盒使用方便，但缺點(diǎn)是維持 時(shí)間短暫，且siRA合成量受到限制。3. RNaselH或 Dicer 酶切 dsRNA 法該方法模擬siRNA在體內(nèi)的工作原理，將一段長(zhǎng)2001000個(gè)堿基的靶mRNA 區(qū)段在體外轉(zhuǎn)錄生成長(zhǎng)鏈dsRNA,然后用RNaselH或Dicer消化產(chǎn)生siRNA片斷， 純化后即可使用。該方法的優(yōu)點(diǎn)是可以避開(kāi)繁瑣的siRNA設(shè)訃與篩選工

10、作，缺點(diǎn)是 可能產(chǎn)生非特異性基因的抑制，給真正起作用的siRNA的鑒別帶來(lái)困難。4. siRNA表達(dá)載體法利用質(zhì)粒、病毒等載體直接介導(dǎo)RNAi進(jìn)入細(xì)胞可以得到siRNA體內(nèi)表達(dá)效 果。該方法的優(yōu)點(diǎn)是使siRNA載體直接表達(dá)，載體可長(zhǎng)期循環(huán)使用，可以大規(guī)模制 備，但是需要大量克隆工作，耗時(shí)長(zhǎng)，且轉(zhuǎn)染效率低。5. siRXA表達(dá)框法siRNA表達(dá)框的本質(zhì)是一段含有能表達(dá)siRNA分子的PCR產(chǎn)物，無(wú)需克隆入 載體即可導(dǎo)入細(xì)胞抑制特定基因的表達(dá)。在表達(dá)框的上游含有RNA聚合酶III的啟 動(dòng)子，在下游含有RNA聚合酶III的終止序列。該方法是篩選有效的siRNA片段、 合適的啟動(dòng)子和siRNA片段組合

11、的最佳選擇，但不適用于大規(guī)模制備。二、RNA干擾技術(shù)防治水產(chǎn)動(dòng)物疾病專(zhuān)利現(xiàn)狀（一）統(tǒng)計(jì)方法和指標(biāo)1. 檢索范圍在中國(guó)專(zhuān)利數(shù)據(jù)庫(kù)（CPAT）、徳溫特世界專(zhuān)利索引數(shù)據(jù)庫(kù)（WPI）、歐洲專(zhuān) 利數(shù)據(jù)庫(kù)（EPODOC）、STN國(guó)際聯(lián)機(jī)檢索系統(tǒng)（Caplus）中，對(duì)這些數(shù)據(jù)庫(kù)從最早 收錄日期至2011年6月15日的專(zhuān)利文獻(xiàn)進(jìn)行檢索。2. 檢索策略采用分類(lèi)號(hào)、關(guān)鍵詞、分類(lèi)號(hào)和關(guān)鍵詞相結(jié)合的檢索方式，最后手工篩選檢 索結(jié)果。CPAT 中的關(guān)鍵詞：siRNA, shRNA, microRNA, RNA 干擾，RNAi, iRNA, dsRNA,靶向mRNA,小干擾RNA,發(fā)夾RNA,片段RNA,干擾核糖核酸，核

12、酸干擾, 干擾基因，RNA抑制，核背酸沉默，基因沉默，基因抑制，基因失活，基因治療， 表達(dá)調(diào)控，靶基因互補(bǔ)，mRNA調(diào)控，mRNA靶，mRNA抑制，mRNA互補(bǔ)，RNA靶，小 分子干擾，海洋，海生，水生，水產(chǎn)，海產(chǎn)，甲殼，節(jié)肢，貝，蝦，魚(yú)等英文庫(kù)中的關(guān)鍵詞：interfere, interference, interfering siRNA, shRNA, microRNA, RNAi, iRNA, dsRNA, short hairpin RNA, short intering RNA, oligonucleotide, o1igoribonuc1eotide, gene silence,

13、mRNA target, gene inactivation, gene inhibitor, suppressor gene, marine, aquaculture, aquatic, fishery, crustaceans, Arthropoda, shellfish, seashell, shrimp, monodon, fish, monodon baculovirus (MBV), yellow headbaculovirus (YBV), gill-associated virus (GAV), white spot syndrome virus (WSSV) et alo分類(lèi)

14、號(hào):C12N, A61K, C12Q, C07H, C07K。3 檢索結(jié)果在WPI和EPODOC數(shù)據(jù)庫(kù)中共檢索到4件專(zhuān)利。在STN國(guó)際聯(lián)機(jī)檢索的Caplus數(shù)據(jù)庫(kù)中共檢索到4件專(zhuān)利。在CNPAT中檢索到2件專(zhuān)利。（二）世界范圍內(nèi)專(zhuān)利申請(qǐng)世界范圍內(nèi)關(guān)于RNA干擾技術(shù)防治水產(chǎn)動(dòng)物疾病的專(zhuān)利僅4篇，如下表所 示。這四件專(zhuān)利申請(qǐng)兩件屬于美國(guó)，1件屬于荷蘭，1件優(yōu)先權(quán)為英國(guó)，但申請(qǐng)人 為瑞士諾瓦提斯公司（在中國(guó)為諾華公司）。這四個(gè)申請(qǐng)人均為美、歐國(guó)家，顯示 了這三國(guó)在RNA干擾技術(shù)防治水產(chǎn)動(dòng)物疾病方面的強(qiáng)大實(shí)力。其中三件為PCT途徑 的專(zhuān)利申請(qǐng)，有兩件進(jìn)入中國(guó)，顯示了中國(guó)市場(chǎng)的受重視程度。表1世界范圍內(nèi)關(guān)于RA干擾技術(shù)防治水產(chǎn)動(dòng)物疾病的專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)優(yōu)先權(quán)日申請(qǐng)人優(yōu) 先 權(quán) 國(guó) 家技術(shù)領(lǐng)域進(jìn)入國(guó)家*020040856452003年3月24日Novartis A. 一G,Switz；NovartisPharma G. m. b H諾瓦提斯公司英國(guó)siRNA可用于水 生生物如他類(lèi)疾 病如WSSV、TSV、 IHHNV、YHV防治無(wú)*02005079236,CS2008194504,AU2005213981,MXPA06009005,IN2006KN02560,CN19467332004年2月6日ADVANCEDBIONUTRITION CORP高級(jí)生物營(yíng)養(yǎng)公司美國(guó)RNA干擾技術(shù)治 療陸生和水產(chǎn)