A族鏈球菌表面新發(fā)現(xiàn)蛋白Fba真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答①

1、A族鏈球菌表面新發(fā)現(xiàn)蛋白Fba真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答    核心提示：中文摘要：目的：構(gòu)建新發(fā)現(xiàn)的A族鏈球菌（GAS）表面蛋白Fba 的真核表達(dá)質(zhì)粒，并將其以及Fba蛋白、M 蛋白分別免疫小鼠，對它們誘導(dǎo)的體液免疫及細(xì)胞免疫應(yīng)答進(jìn)行評價(jià)分析。探討Fba 蛋白作為GAS候選疫苗的可能性。方法：以SSI-9菌株（GASM 1血清型標(biāo)準(zhǔn)株）作為模板，采用PCR方法擴(kuò)增Fba.中文摘要：目的：構(gòu)建新發(fā)現(xiàn)的A族鏈球菌（GAS）表面蛋白Fba 的真核表達(dá)質(zhì)粒，并將其以及Fba蛋白、M 蛋白分別免疫小鼠，對它們誘導(dǎo)的體液免疫及細(xì)胞免疫應(yīng)答進(jìn)行評價(jià)分析。探

2、討Fba 蛋白作為GAS候選疫苗的可能性。方法：以SSI-9菌株（GASM 1血清型標(biāo)準(zhǔn)株）作為模板，采用PCR方法擴(kuò)增Fba基因，測序正確后克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/fba；將雌性CD1小鼠隨機(jī)分成6組，分別為Fba蛋白免疫組、M 蛋白免疫組、pcDNA3.1/fba+Fba蛋白免疫組、pcDNA3.1/fba免疫組、pcDNA3.1空質(zhì)粒對照及PBS對照組。EL ISA檢測各免疫組血清IgG的動(dòng)態(tài)變化水平；脾細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢細(xì)胞增殖水平，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠體內(nèi)CD4+ 、CD8+ 淋巴細(xì)胞的變化。試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)SPSS10. 0統(tǒng)計(jì)處理。結(jié)果：成功

3、構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/fba；質(zhì)粒或蛋白免疫后小鼠IgG產(chǎn)生水平以Fba蛋白免疫組增高最為明顯，其次為Fba質(zhì)粒蛋白混合免疫組及Fba質(zhì)粒組。特異性抗原誘導(dǎo)后體外脾細(xì)胞增殖試驗(yàn)顯示：pcDNA3.1/fba免疫組增殖水平明顯高于其它組，流式細(xì)胞檢測結(jié)果與此一致，并顯示以CD4+ T細(xì)胞水平升高為主，CD8+ T細(xì)胞水平在各組別之間也有一定的差異。結(jié)論：（1） Fba 蛋白與M 蛋白一樣均能有效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體，提示Fba蛋白很有希望成為GAS的候選疫苗。（2）成功構(gòu)建了Fba蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1/fba，且該重組質(zhì)粒能有效地誘導(dǎo)抗鏈球菌所需的抗體，并能增強(qiáng)CD4

4、+ T 細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞的增殖功能。     應(yīng)答李彩虹 馬翠卿 王 錦 ! 魏 林 (河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室,石家莊 050017)疫小鼠, 對它們誘導(dǎo)的體液免疫及細(xì)胞免疫應(yīng)答進(jìn)行評價(jià)分析。探討 Fba蛋白作為 GAS候選疫苗的可能性。方法: 以 SS I9菌株 ( GASM 1血清型標(biāo)準(zhǔn)株 )作為模板, 采用 PCR方法擴(kuò)增 Fba基因, 測序正確后克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3. 1, 構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3. 1 / fba; 將雌性 CD1小鼠隨機(jī)分成 6組,分別為 Fba蛋白免疫組、M蛋白免疫組、pcDNA3. 1

5、/ fba+ Fba蛋白免疫組、pcDNA3. 1 / fba免疫組、pcDNA3. 1空質(zhì)粒對照及 PBS對照組。EL ISA檢測各免疫組血清 IgG的動(dòng)態(tài)變化水平; 脾細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢細(xì)胞增殖水平,并用流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠體內(nèi) CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞的變化。試驗(yàn)結(jié)果經(jīng) SPSS10. 0統(tǒng)計(jì)處理。結(jié)果: 成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3. 1 / fba;質(zhì)粒或蛋白免疫后小鼠 IgG產(chǎn)生水平以 Fba蛋白免疫組增高最為明顯, 其次為于其它組, 流式細(xì)胞檢測結(jié)果與此一致, 并顯示以 CD4+ T細(xì)胞水平升高為主, CD8+ T細(xì)胞水平在各組別之間也有一定的差異。結(jié)論: ( 1) Fba蛋

6、白與M 蛋白一樣均能有效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體, 提示 Fba蛋白很有希望成為 GAS的候選疫苗。 ( 2)成功構(gòu)建了 Fba蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3. 1 / fba, 且該重組質(zhì)粒能有效地誘導(dǎo)抗鏈球菌所需的抗體, 并能增強(qiáng) CD4+ T細(xì)胞、 ( 1) Just as M protein, the antibody to Fba pro te in cou ld be e fficiently induced by immun ization w ith Fba pro te in, wh ich show ed that 本文為河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (C 200600125)!

7、 邢臺市醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校,邢臺 054056作者簡介:李彩虹 ( 1977年 - ) ,女,碩士,主要從事感染免疫學(xué)研究;通訊作者及指導(dǎo)教師:魏 林 ( 1961年 - ) ,女,教授,博士生導(dǎo)師,主 要從事感染與腫瘤免疫學(xué)的研究, Em ai:l 見的致病菌。在鏈球菌感染的疾病中 90%左右是由 GAS引起的,它能引起咽炎、壞死性筋膜炎、鏈球菌毒素休克綜合征等,鏈球菌感染后的變態(tài)反應(yīng)性疾病更是危害重大 1, 2。防治鏈球菌感染的研究由來已久, 80年代以來, 在發(fā)達(dá)國家發(fā)生的多起流行轉(zhuǎn)載又進(jìn)一步增強(qiáng)了人們研制疫苗預(yù)防 GAS感染的決心 3。過去的疫苗研究主要集中于 M蛋白, 但由于其血清型眾

8、多及其誘導(dǎo)有害的自身免疫反應(yīng)的可能性,阻礙了以它為基礎(chǔ)的疫苗研究。其他非 M蛋白疫苗包括 GAS糖、C5a肽酶、半胱氨酸蛋白酶、粘附素等, 因它們可能的自身免疫應(yīng)答性及毒性作用,迄今為止依然沒有一種有效安全的 GAS疫苗問世。至少存在于 18個(gè)血清型中, 且同源性很高 1, 2 。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn), Fba蛋白可與補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子 FH、FHL1結(jié)合, 以促進(jìn)鏈球菌粘附、入侵上皮細(xì)胞及抗吞噬作用,因此顯示它對鏈球菌在體內(nèi)的存活、毒力及致病性等諸多方面都有關(guān) 1。但對 Fba蛋白免疫原性,以及它在體內(nèi)能否誘導(dǎo)有效的抗 GAS感染的研究尚屬空白?；谝陨显? 本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建 Fba的真核表達(dá)質(zhì)粒,以 DN

9、A疫苗以及蛋白疫苗的形式免疫小鼠,評價(jià)其所誘導(dǎo)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答,以達(dá)到尋找和研制 GAS疫苗之目的。準(zhǔn)株 )由美國 K ansas大學(xué) Dr. Cue惠贈(zèng)。大腸埃希菌 ( Escherichia coli) DH5、質(zhì)粒 PGEX2T / fba、Fba蛋白及 M 蛋白為本室保存。真核表達(dá)載體 pcD核酸內(nèi)切酶, T4 DNA 連接酶購自 T aK aRa公司。購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司。玻璃珠 DNA膠回收試劑盒購自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。羊抗兔 IgGAP, 馬抗鼠 IgGAP 購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。弗氏完全佐劑購自 S igma公司。弗氏不完全佐劑及質(zhì)粒大提

10、試劑為本室自行配制。心 ( NCB I)公布的 SSI9菌株 fba基因序列, 借助端添加 BamH ?、Xho?酶切位點(diǎn), 引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成, PCR 產(chǎn)物約為過夜。將連接產(chǎn)物 PMD18T / fba轉(zhuǎn)入大腸桿菌后,取 200 l菌液涂于 LB瓊脂平板上 (含羧芐青霉素,送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。段, 將兩片段 16? 連接過夜構(gòu)建 pcDNA3. 1 / fba, 之后轉(zhuǎn)入大腸桿菌, 涂 LB瓊脂平板上 (含羧芐青霉素, 100 l/m l), 挑陽性菌落用 LB培養(yǎng)基進(jìn)行增菌,構(gòu)建成功的 pcDNA3. 1 / fba。初免時(shí) 4周齡。 60只小鼠隨機(jī)分

11、為 6組, 分別為及 PBS對照組 ( 6組 ) ,加強(qiáng)免疫 2次,每次免疫均間隔 2周,在每次免疫前、后一周斷尾采血。末次免疫后 2周,眼球取血處死小鼠 6。免疫方法: 取純化的 M蛋白或 Fba蛋白 50 g溶于 100 l PBS及等體積弗氏完全佐劑完全乳化,皮內(nèi)多點(diǎn)注射免疫。質(zhì)粒用 PBS稀釋成 1000 g / 分鐘后在同一部位肌注 100 l質(zhì)粒稀釋液, pcD 第 3次用蛋白加強(qiáng)免疫。鼠血清用間接 ELISA法對其 IgG水平進(jìn)行檢測, 以純化的 M蛋白和 Fba蛋白作為包被抗原, 包被濃度 分別為 2、10 g /m l。免疫后的鼠血清 1: 40稀釋后 作為一抗, 1: 2

12、000稀釋的馬抗鼠 IgGAP作為二抗,同時(shí)設(shè)立陰性、陽性及空白對照。取脾,研磨,用 RPM I1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度到 5 %激, 同時(shí)設(shè)立 ConA和 PBS刺激對照孔。 37? 、5%淋巴細(xì)胞的增殖能力。泳得到 1100 bp目的片段,與預(yù)期一致,結(jié)果見圖 1。測序結(jié)果與美國生物技術(shù)信息中心 ( NCB I)公布的表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3. 1 / fba。 圖 1 重組質(zhì)粒 pcDNA3. 1 / fba及 pMD18T/ fba雙酶切的 瓊脂糖凝膠電泳分析 圖 2 免疫前后小鼠血清中特異性 IgG變化情況 圖 3 免疫小鼠脾細(xì)胞流式分析 蛋白及 M 重組蛋白包被 96孔板,將免疫前后

13、采集的小鼠血清以 1 /40稀釋,間接 ELISA法檢測小鼠血清 IgG水平。結(jié)果顯示,見圖 2, 相對于空質(zhì)粒, 其他免疫組血清的 IgG水平呈逐漸升高趨勢, 而其中蛋白免疫組又高于質(zhì)粒免疫組, M蛋白免疫組最高達(dá)到 1: 9 600, Fba蛋白組為 1: 4 800。在質(zhì)粒免疫組中,聯(lián)合免疫組優(yōu)于單純接受質(zhì)粒免疫的組別,性和抗原特異性, pcDNA3. 1 / fba組雖不及 Fba蛋白組, 但也能引起有效的體液免疫。培養(yǎng) 72小時(shí)后,經(jīng) MTT測淋巴細(xì)胞增殖能力, pcD蛋白 + pcDNA3. 1 / fba組為 1. 16 & 0. 15, pcDNA3. 1空質(zhì)粒對照為 1. 16 & 0. 08, PBS對照組為 1. 10 & 0.增殖水平明顯高于其他組, 具有統(tǒng)計(jì)顯著性 (P < 0.析 取免疫后小鼠脾細(xì)胞,經(jīng)流式細(xì)胞儀分析結(jié)果如圖 3。結(jié)果經(jīng) SPSS統(tǒng)計(jì)分析表明 pcDNA3. 1 / fba組的