Rh血型系統(tǒng)研究進展

1、程變化等方面,脂聯(lián)素測定也有一定意義。最近多項研究表明,脂聯(lián)素的高分子量異構體(HMW與冠心病的相關性更強1-3。故今后通過大規(guī)模臨床試驗闡明HMW 在冠心病發(fā)生、發(fā)展中的意義,將是研究的熱點。6.2 治療 高血漿脂聯(lián)素水平能在體內抑制動脈粥樣硬化的發(fā)展。將表達人脂聯(lián)素的腺病毒轉染載脂蛋白E 缺乏的小鼠,第14d 后動脈竇處的動脈粥樣斑塊形成被抑制了30%,免疫組化分析顯示腺病毒攜帶的脂聯(lián)素轉移入粥樣硬化動脈處脂紋的泡沫細胞內19。脂聯(lián)素具有抑制機械損傷后血管內膜反應性增生的作用。Matsuda 等發(fā)現(xiàn),機械性動脈損傷可使脂聯(lián)素基因缺失的小鼠出現(xiàn)明顯的新生內膜增厚和平滑肌細胞增殖。而外源性補充

2、脂聯(lián)素后,可減弱其新生內膜的增殖。這為冠心病血管介入治療后,預防血管再狹窄提供了新的辦法20。參考文獻:1 Pajvani UB,Du X,Combs TP,et al .Structure -func tion s tudies of theadipocyte -secreted hormone Acrp30P adiponecti n:i mplications for meta -bolic regulation and bi oactivityJ.J Bi ol Chem,2003,278(11:9073-9085.2 Pajvani UB,Hawki ns M ,Combs TP,e

3、t al .Complex di stribution,not ab -s ol ute amount of adi ponectin,correlates with thiazolidinedione -mediatedimprove ment in insulin sensitivi ty J .J Biol Chem,2004,279(13:12152-12162.3 Kobayashi H,Ouchi N,Ki hara S,et al .Selective s uppres sion of endo -theli al cell apoptos is by the high mole

4、cular weight form of adi ponectinJ.Circ Res,2004,94(4:e27-31.4 Ohas hi K,O uchi N,Kihara S,et al .Adiponecti n I164T mutation i s as -s ociated with the metabolic s yndrome and coronary artery diseaseJ.JA m Coll Cardiol,2004,43(7:1195-1200.5 Stenvi nkel P,Marchlewska A,Pecoits -Fil ho R,et al .Adi p

5、onectin in re -nal disease:relations hip to phenotype and genetic variati on in the geneencoding adiponectinJ.Kidney Int,2004,65(1:274-281.6 Fruebis J,Tsao TS,Javorschi S,et al .Proteol ytic cleavage product of30-kDa adipocyte complemen-t related protei n i ncreases fatty aci d ox-i dati on in muscl

6、e and causes weight loss in miceJ.Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(4:2005-2010.7 Lin LY,Lin CY,Su TC,e t al .Angiotensin II -induced apoptos is in hu -man endothelial cells is inhibi ted by adiponectin through restoration ofthe as soci ation bet ween endothelial ni tric oxide synthas e and heat shock

7、protein 90J.FEBS Lett,2004,574(1-3:106-110.8 Ouchi N,Ki hara S,Arita Y,e t al .Novel modulator for endotheli al ad -hesion molecules:adipocyte -derived plasma protein adiponectin J .Circulati on,1999,100(25:2473-2476.9Ouchi N,Ki hara S,Arita Y,e t al .Adipocyte -derived plas ma protein,adi ponectin,

8、suppresses li pid accumulati on and class A scavenger re -ceptor expression in human monocyte -deri ved macrophagesJ.Circula -ti on,2001,103(8:1057-1063.10 劉巖,鄒大進,李慧,等.低脂聯(lián)素血癥是冠狀動脈粥樣硬化嚴重程度的重要標志J.中華內分泌代謝雜志,2005,21(1:5-8.11 Nakamura Y,Shi mada K,Fukuda D,et al .Implications of plasma con -centrations o

9、f adiponectin i n patients with coronary artery diseaseJ.Heart (Briti sh Cardiac Socie ty,2004,90(5:528-533.12Pischon T,Gi rman CJ,Hotamisligil G S,et al .Plas ma adiponectin levels and risk of myocardial infarction i n menJ.J AMA,2004,291(14:1730-1737.13Zoccali C,M allamaci F,Tripepi G,et al .Adipo

10、nectin,metabolic risk factors ,and cardi ovascular events among patients with end -stage renal diseaseJ.J A m Soc Nephrol,2002,13(1:134-141.14 Schulze MB,Shai I,Ri mm EB,et al .Adi ponectin and future coronary heart disease events a mong men with type 2di abetes J .Diabetes,2005,54(2:534-539.15Kumad

11、a M,Kihara S,Ouchi N,e t al .Adiponec ti n s pecifically i ncreased tis sue inhibi tor of metalloproteinase -1through interleukin -10expression in human macrophagesJ.Circulation,2004,109(17:2046-2049.16Kojima S,Funahashi T,Saka moto T,et al .The variation of plas ma con -centrations of a novel,adipo

12、cyte deri ved protein,adiponecti n,in pa -ti ents w i th acute myocardial infarc tionJ.Heart (British Cardiac Soc-i ety,2003,89(6:667.17Is hika wa Y,Akasaka Y,Ishii T,et al .Changes in the di stribution pat -tern of gelatin -bindi ng protein of 28kDa (adiponectini n myocardial remodelli ng after isc

13、hae mic inj ury J .His topathology,2003,42(1:43-52.18 洪潔,顧衛(wèi)瓊,張翼飛,等.胰島素抵抗綜合征患者血清脂連素和胰島素敏感性的相關性研究J.中華內分泌代謝雜志,2003,19(3:173-176.19Yoshi hisa O,Shinji K,Noriyuki O,et al .Adiponecti n reduces athero -sclerosisi n apolipoprotein E -deficient miceJ.Circ ulati on,2002,106(22:2767-2770.20Matsuda M ,Shimomur

14、a I,Sata M.Role of adi ponectin in preventing vascular s tenosis.The mis sing link of adipo -vasc ular axis J.J Biol Che m,2002,277(40:37487-37491.收稿日期:2005-10-22 修回日期:2006-03-16Rh 血型系統(tǒng)研究進展卓傳尚1(綜述,卓孝福2,郭永建2(審校(1.福建醫(yī)科大學,福州350004;2.福建省血液中心,福州350004中圖分類號:R457.11 文獻標識碼:A 文章編號:1006-2084(200611-0684-03摘要:

15、Rh 血型系統(tǒng)是最具多態(tài)性的紅細胞血型系統(tǒng),在臨床輸血、新生兒溶血病和自身免疫性溶血性貧血中具有重要意義。本文就R H 基因結構、R H 等位基因、Rh 蛋白功能及Rh 血型基因分型等近年來的研究進展簡要綜述。關鍵詞:R h 血型;R H 基因;等位基因;基因分型 The Research Progress of Rh B lood G roup System Z HUO Chuan -shang 1,ZHUO Xiao -fu 2,GUO Yong -j ian 2.(1.Fuj ian Medic al Unive rsit y ,Fuzhou 350004,China ; 2.Blood

16、 Ce nter o f Fujian ,Fuzhou 350004Abstract :Rh blood group s ys tem is the mos t polymorphic s ys te m of the human red cell blood groups havi ng great si gni ficance in clinical trans fusion,he molytic di seas e of the ne wborn (HDNand autoi mmune hemol ytic anemia (AIHA.This review summariz es the

17、 developing kno wledge of Rh blood group i n recent years,including Rh gene s tructure,and i ts allele,the function of Rh protei n and genotyping in Rh blood group.Key words :Rh blood group;RH gene;Allele;Geotypi ngRh 血型系統(tǒng)是最具多態(tài)性的紅細胞血型系統(tǒng),至少由46種不同抗原組成,其中與臨床相關的主要為D 、C 、c 、E 和e 等5種抗原。Rh 血型不符可引起新生兒溶血病(HD

18、N、溶血性輸血反應和自身免疫性溶血性貧血(AIHA。20世紀90年代初,Rh 血型系統(tǒng)cDNA 被克隆出來。此后,Rh 血型系統(tǒng)的研究取得了巨大進展,Rh 血型基因結構和多數(shù)變異體的分子基礎已經闡明,Rh 血型基因分型的研究方興未艾,Rh 血型蛋白功能研究也初現(xiàn)端倪。1 Rh 血型基因結構Rh血型基因(RH位于人類染色體1p34.336.1,由緊密連鎖的RhD蛋白基因(RHD基因和RhCE蛋白基因(RHCE 基因串聯(lián)排列組成。RHD基因和RHCE基因高度同源(93.8%,都有10個外顯子和9個內含子,長分別為57932bp 和58575bp,都編碼417個氨基酸1。二者的第8個外顯子完全相同,

19、差異較大是外顯子3、4、5、7、9和內含子4;與RHCE 基因相比,RHD基因的內含子4缺失651bp。R HD基因和RHCE基因的開放閱讀框架(ORF在RH基因座位上方向相反,3c末端相對,相距約30000bp,包括下游Rh盒(Rhesus box和約20000bp的小膜蛋白1(SMP1基因。下游Rh盒起于RHD基因終止密碼子3c端104bp處,長9145bp;此外,在距RHD基因起始密碼子5c端約4900bp處還存在1個9142bp的上游Rh盒。上、下游Rh盒的方向與RHD基因相同,前二者同源性高達98.6%。在上、下游Rh盒的57017163之間有一段1463bp的相同區(qū)域,在該區(qū)域除下

20、游Rh盒有1個4bp的多聚體插入外,其他序列完全相同。Wagner等2認為R HD陰性單倍體是由上下游Rh盒觸發(fā)的不等交換引起,并且確定RHD基因缺失的903bp斷裂點區(qū)就位于該區(qū)域。2Rh蛋白及其功能RhD蛋白由RHD基因編碼,攜帶D抗原,RhCE蛋白由RHCE基因編碼,攜帶C P c和E P e抗原。RhD和RhCE蛋白結構相似,都是由416個氨基酸殘基組成的疏水性非糖基化蛋白,分子質量分別為30103和32103;二者都有12個疏水跨膜結構域和6個細胞外環(huán),其C端和N端都位于胞漿內。通常,2條RhD蛋白或2條RhCE蛋白與2條RhAG形成四聚體,再與CD47、Landsteiner-Wi

21、ener糖蛋白(簡稱LW糖蛋白和血型糖蛋白B(GPB等附屬蛋白組成蛋白復合體插入紅細胞膜,參與構成紅細胞膜骨架,維持紅細胞膜結構完整性3。Rh 蛋白還可影響紅細胞膜上的其他骨架蛋白的表達,例如RhCE 蛋白表達明顯減少或缺失(如D-表型都將使CD47表達下降3。此外,Rh蛋白可能還參與氨(NH3或銨離子(NH+4跨膜轉運,維持紅細胞內外電荷平衡。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)Rh 蛋白家族(RhD、RhCE、Rh AG、RhBG和RhCG與原核生物銨轉運體(Amt P MEP有共同的保守性區(qū)域。深入研究顯示,表達RhAG的釀酒酵母氨轉運體缺陷突變株能夠利用氨為惟一氮源4,表達RhAG的非洲蟾卵對14C-甲

22、基-NH3Cl的攝取率比對照組高810倍5。此外,研究表明非紅系Rh蛋白同源物RhBG和RhCG也能促進銨離子轉運6。最近,Hemker等7研究顯示,在NH4Cl類似物14C-甲基-NH3Cl溶液孵育后,調節(jié)型RHnull 紅細胞(不表達Rh蛋白內積聚的14C-甲基-NH3Cl明顯高于正常紅細胞,而無效基因型RH null紅細胞(表達少量Rh蛋白內積聚中等量的14C-甲基-NH3Cl。雖然上述研究表明,Rh 蛋白家族成員RhCE P RhD蛋白、RhAG、RhB G和RhCG以及Rh復合體具有參與NH3跨膜轉運功能,仍需進一步的研究證實。3RH等位基因人類正常RH基因編碼區(qū)序列一致,但在漫長的

23、進化途中,不同人種間發(fā)生各種不同的分子事件,包括基因缺失、基因重組和堿基變異等,形成了眾多的RH等位基因。3.1R HD等位基因目前已經發(fā)現(xiàn)的RHD等位基因有80多種,其中單核苷酸多態(tài)性(SNPs引起的RHD等位基因達40多種,RHCE和RHD基因交換引起的RHD等位基因也有30多種。這些RHD等位基因可分為以下四大類:¹RhD陰性等位基因:大部分D陰性的高加索人和中國人完全缺失RHD基因,約有15.8%真實D陰性中國人攜帶RhD陰性等位基因8,而D陰性非洲黑人則普遍攜帶RhD陰性等位基因(82%,其中66%為RHD偽基因(RHD W9。目前已經發(fā)現(xiàn)22種不同的RhD陰性等位基因,其

24、分子基礎包括基因重組(如各種RHD-CE-D雜交基因、堿基突變(如RHD48A、RHD 121T和RHD270A等、堿基缺失(如RHD488del4和RHD 710delC或插入(如RHD IVS8+1G>A和RHD IVS6+1-4de-l GTAA,904-905insGGC TT。堿基突變?yōu)殄e義突變或無義突變,堿基插入和缺失引起框移突變,導致終止密碼子提前產生,最終的結果是紅細胞表面Rh蛋白表達缺失;º部分D等位基因:該型的分子基礎是堿基突變和基因交換,但是RHD基因的ORF未發(fā)生改變,導致RhD蛋白缺失一個或多個D抗原表位;例如,DÖ是高加索人最常見的部分D,

25、就是由于RHD基因的2、3或4個外顯子被相應的RHCE基因的外顯子所置換,分別為DÖa、DÖb和DÖc;»弱D等位基因:目前已經發(fā)現(xiàn)近30種弱D等位基因,其分子基礎都是點突變,這些突變位點編碼的氨基酸殘基通常集中在RhD蛋白的213、149、179225和269397位氨基酸殘基等4個區(qū)域,都位于RhD蛋白的胞質區(qū)或跨膜區(qū),因此可影響該蛋白有效插入紅細胞膜,導致紅細胞膜上RhD蛋白表達量的下降10;¼D el等位基因:主要存在亞洲人群中,大約25.5%相對RhD陰性中國人實際為D el 表型8。目前已經報道的D el等位基因有6種11-14:

26、RHD1227A、RHD885T、RHDIVS3+1G>A、RHDdel1013bp、RHD (X418L和RHDIVS5-38del4,其中RHD1227A引起錯義突變, RHDIVS3+1G>A和RHD885T引起mRNA剪接點改變,RHD (X418L則是由于RHD基因外顯子10的1252和1253位核苷酸插入1個T核苷酸,引起框移突變,造成原先RHD基因翻譯終止密碼子TAA(X變成TTA(L,導致編碼的RhD蛋白從417個氨基酸變?yōu)?88個氨基酸。但是仍不清楚這些突變是如何造成RhD蛋白表達異常減少。3.2RHCE等位基因人類最為古老的RHCE等位基因為RHce等位基因,R

27、Hce等位基因經過突變或與RHD基因交換形成RHcE、RHCe和RHCE等位基因15。RHce、RHcE、RHCe 和RHCE等位基因進一步發(fā)生基因缺失(如D-、堿基變異(如ceMO、cE MI、ceEK、ceBI和ceAR等、或與RHD基因發(fā)生基因交換(如E變異體Ò和Ó型、ceNR和RHEKK等,產生眾多的RHCE等位基因。目前至少已經發(fā)現(xiàn)22種RHCE等位基因1,而且隨著研究的不斷深入,還將不斷發(fā)現(xiàn)新的R HCE等位基因。多數(shù)RHCE等位基因引起e抗原表達改變,少數(shù)引起E抗原表達異常,而影響c抗原表達改變的則較為少見。4Rh血型基因分型目前臨床Rh血型鑒定仍采用傳統(tǒng)的血

28、清學方法,該方法檢測的結果較為準確,而且與臨床輸血和疾病相關性密切。但該方法的結果判定具有主觀性,在弱的或混合視野型凝集反應時尤其突出,從而影響結果的可靠性;對于存在同種抗體或自身抗體的個體,其Rh血型的鑒定常需用酶或其他技術處理紅細胞,這些處理往往會破壞紅細胞表面抗原,從而可能影響鑒定結果,而且實驗步驟較為繁瑣;對多次輸血或大量輸血的患者,由于這些個體的外周血中存在大量的供者紅細胞,因此用該方法通常難以準確定型;此外,Rh血型變異體眾多,尤其是某些罕見變異體,不僅制備這些變異體的抗體的費用昂貴,也難以獲得滿意的譜細胞。隨著Rh血型基因結構和多數(shù)變異體的分子基礎的闡明,許多學者開始致力于Rh血

29、型基因分型的研究。第一個Rh血型基因分型方法建立于1991年,該方法應用Southern Blotting檢測RhD基因型,但是該方法繁瑣且需要特殊儀器,不適用于臨床實驗室。1993年,Bennett等16首次建立RHD 基因的聚合酶鏈反應(PCR分型方法,該方法通過檢測RHD 基因3c端非編碼區(qū)來預測RhD表型,但隨后的研究發(fā)現(xiàn)該方法存在較大的假陽性和假陰性問題。近年來,出現(xiàn)了多種以PCR為基礎的Rh血型基因分型方法,而以下列4種方法運用較多:¹PCR-序列特異性引物(PCR-SSP:根據(jù)RH基因特異性位點設計序列特異性引物,特異性擴增RH基因某個外顯子或內含子,是最常用的Rh血型

30、基因分型技術之一。目前傾向于應用多重PCR-SSPs進行Rh血型基因分型,同時分析多個RH基因特異性位點,該策略因簡便和準確而備受關注;ºPCR-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP:限制性酶切PCR 擴增產物進行長度多態(tài)性分析,可以檢測限制性位點的單核苷酸替換,但是與PCR-SSP相比,PCR-RFLP比較繁瑣費時,且不適用于多重PCR。PCR-RFLP在Rh血型基因分型上的兩個重要應用是RHD合子型鑒定和D P c P C分型;»實時定量PCR:常用于檢測孕婦外周血中微量的胎兒DNA,是胎兒Rh血型鑒定的首選方法,也適用于直接檢測RHD合子型。最近研究顯示,由于Rh盒

31、的DNA序列(尤其是非高加索人群存在較多變異,該技術在鑒定非高加索人個體的RHD合子型時優(yōu)于PCR-RFLP和PC R-SSP法17,18。實時定量PCR的不足之處在于需要特殊的儀器,且費用昂貴;¼DNA測序:對PCR產物進行直接測序可以檢測RH基因多態(tài)性,確定各種堿基變異位點,但費用較高,難以廣泛用于臨床。雖然Rh血型基因的分型技術有多種,但是單獨運用這些技術檢測RH基因的某個外顯子或內含子,可能產生假陽性或假陰性結果。假陽性通常由無效等位基因引起,假陰性則由其他R H等位基因引起。目前,Rh血型基因分型策略通常是,根據(jù)不同民族或人群中RHD和RHCE等位基因分布頻率和特點,設計特

32、異性引物,擴增RH基因的多個特異性位點及多種等位基因,從而即簡化操作又準確分型,將假陽性率和假陰性率降到較低水平。目前Rh血型基因分型已逐漸進入臨床應用,在2004年的國際輸血聯(lián)合會第28屆年會上Danials等19提出以下5種情況可以應用血型基因分型:¹產前胎兒血型鑒定,預測胎兒和新生兒溶血病(HDFN的危險性;º多次輸血患者或大量輸血患者的Rh血型鑒定;»當血清學試劑質量較差或試劑短缺時,亦可用血型基因分型篩選供者;¼血型基因分型還適用于直接抗球蛋白試驗(DAT陽性,但間接抗球蛋白試驗(IAT又無法分型血液標本的鑒定;½作為血清學參比實驗室

33、的輔助技術,用于試劑紅細胞的篩選和質量控制20,也可以用于檢測Rh血型變異體。5結束語Rh血型系統(tǒng)是最具多態(tài)性的紅細胞血型系統(tǒng),不同種族間的RH基因結構特點可能存在較大差異。目前,多數(shù)Rh血型的PCR分型方法是根據(jù)歐美人的RH基因結構特點建立的,不完全適用于中國人。要想建立針對中國人的Rh血型基因分型方法,首先必需深入研究各民族、各地區(qū)中國人R H基因結構特點,充分了解中國人各等位基因的分子基礎與基因頻率。值得注意的是,由于D el表型在相對D陰性中國人群中比率較高13,而真實D陰性個體可產生針對D el表型的同種抗D抗體17,因此,深入研究中國人D el表型及其分子生物學基礎具有重要意義。參

34、考文獻:1Westhoff C M.The Rh blood group s ys te m in review:a ne w face for thenext decadeJ.Trans fusion,2004,44(11:1663-1673.2Wagner FF,Flegel WA.R HD gene deletion occurred in the Rhesus boxJ.Blood,2000,95(12:3662-3668.3Dahl KS,Westhoff CM,Discher DE.Fractional attachment of CD47(IAPto the erythrocyt

35、e cytoskeleton and vis ual colocalization with Rhprotein co mplexesJ.Bl ood,2003,101(3:1194-1199.4Marini A M,Matassi G,Raynal V,et al.The human Rhes us-as soci atedRhAG protein and a kidne y homologue pro mote ammoni um transport inyeastJ.Nat Genet,2000,26(3:258-259.5Westhoff C M,Ferrer-i Jacobia M,

36、Mak D OD,et al.Identificati on of theErythrocyte Rh Blood G roup Glycoprotei n as a Mammalian A mmoniumTrans porterJ.J Bi ol Che m,2002,277(15:12499-12502.6Li u Z,Peng J,Mo R,et al.Rh Type B gl ycoprotein is a new member ofthe Rh superfamily and a putative ammonia trans porter in mammalsJ.J Bi ol Ch

37、e m,2001,276(2:1424-1433.7Hemker MB,Cheroutre G,van Zwieten R,et al.The R h c omple x ex-ports ammoni um from human red blood cellsJ.Br J Haematol,2003,122(3:333-340.8Shao CP,Maas J H,Su YQ,e t al.Molecular background of Rh D-pos-iti ve,D-negative,D el and weak D phenotypes in ChineseJ.Vox Sang,2002

38、,83(3:156-161.9Singleton BK,G reen CA,Avent ND,e t al.The presence of an R HDpseudogene containi ng a37base pair duplication and a nons ense muta-ti on in Africans with the Rh D-negative blood group phenotypeJ.Blood,2000,95(1:12-18.10Wagner FF,Gass ner C,M ller TH,e t al.Molecular Basis of Weak DPhenotypesJ.Blood,1999,93(1:385-393.11Wagner FF,Frohmajer A,Flegel WA.R HD positive hapl otypes in Dnegative EuropeansJ.BMC Genet,2001,2:10.12Chang TH,Wang JC,Yang TY,et al.Human R hDel Is Caused