人的炎癥牙周膜干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)與鑒定-最新資料

1、人的炎癥牙周膜干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞的體外分離、 培養(yǎng)與鑒定牙周炎導(dǎo)致牙周支持組織破壞， 是成人失牙的主要原因 1 。 牙周治療的主要目的是控制牙周組織炎癥，維護(hù)牙周組織健康， 并使包括牙槽骨、牙骨質(zhì)、牙周膜、牙齦在內(nèi)的牙周組織達(dá)到形 態(tài)和功能上的再生與重建， 這也是牙周病治療的終極目標(biāo) 2-4 。 近年發(fā)展起來(lái)的組織工程技術(shù)為牙周組織再生治療開(kāi)辟了新途 徑，種子細(xì)胞、信號(hào)分子和支架是牙周組織工程技術(shù)的三大要素， 因此合理選擇種子細(xì)胞是牙周組織工程技術(shù)獲得成功的關(guān)鍵 5-6 ，目前已確認(rèn)可用于牙周組織工程技術(shù)的種子細(xì)胞有胚胎 干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞等 7-9 ，其來(lái)源

2、多為健康的人體組織，通常存在取材有創(chuàng)、來(lái)源 有限等弊端， 在一定程度上限制了臨床治療的可行性。 許多研究 表明在牙周炎時(shí)期也存在著組織的再生， 而組織的再生離不開(kāi)干 細(xì)胞的遷移， 只有適當(dāng)類(lèi)型的干細(xì)胞附著于根面， 增殖并分化為 功能性附著結(jié)構(gòu)（牙骨質(zhì) - 牙周膜 - 牙槽骨）的各種細(xì)胞組分，配 合適宜的刺激因子和基質(zhì)成分， 才可能形成再生組織， 否則可能 僅產(chǎn)生修復(fù)10 。Lin等11對(duì)3名重度牙周炎（山度根分叉病 變）患者需要拔除的患牙行 GTR 手術(shù)，術(shù)后 6 周，切取其中 2 名患者患牙周?chē)脑偕M織， 進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了 STRO-1、 CD146 和 CD44 陽(yáng)性的細(xì)胞，同時(shí)

3、拔除余下 1 名患者的患牙，取其再生組織進(jìn)行細(xì)胞體外培養(yǎng)并傳代，用流式細(xì)胞儀分析得到 STRO-1、CD146 和 CD44 陽(yáng)性的細(xì)胞百分比分別為 78.3%、94.9% 和 100%，所得細(xì)胞經(jīng)礦化和成脂誘導(dǎo) 4 周后可分別形成礦化結(jié) 節(jié)及脂滴，但其分化能力低于 PDLSCs和BMSC。該實(shí)驗(yàn)證明了 牙周炎癥再生組織中應(yīng)該存在具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞。 Chen 等 6 將臨床上因重度牙周炎而拔除的患牙制成組織切片，使用免 疫組化染色觀察發(fā)現(xiàn)，在牙周炎患牙的牙周組織中，STRO-1、CD146 和 CD44 陽(yáng)性細(xì)胞分布情況與健康牙周組織近似，而牙周 膜干細(xì)胞表面的陽(yáng)性標(biāo)記物是 STRO-1、

4、CD146、CD90、CD29、CD105、 陰性標(biāo)記物是 CD31CD45所以本實(shí)驗(yàn)利用 STRO-1 CD146 CD90 CD29 CD105和CD31 CD45對(duì)牙周膜干細(xì)胞和炎癥牙周膜干細(xì) 胞（i-PDLSCs）進(jìn)行鑒定。1 材料和方法1.1 主要試劑1.2 主要器械： 眼科剪 眼科鑷 刀柄 11 號(hào)刀片 平底 培養(yǎng)皿、25cm2培養(yǎng)瓶、10ml離心管、平底6孔板（Corning， 美國(guó)）、金屬濾器。1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器1.4 實(shí)驗(yàn)方法1.4.1 原代細(xì)胞的培養(yǎng)： 1 ）炎癥牙周膜干細(xì)胞的培養(yǎng)（iPDLSCs）：取材：選取臨床上年齡在 30-45歲之間的慢性牙 周炎患者， 收集其因重

5、度牙周炎需要拔除的患牙， 患牙無(wú)牙根吸 收、根尖周炎和根尖囊腫等牙髓和根尖周疾病， 刮取其炎癥牙周 膜組織；漂洗組織：將獲得組織用 8 萬(wàn) U 慶大霉素浸泡 3-5min，用PBS反復(fù)漂洗3遍，將其剪成約 2mm 2mm 2mm大 小的組織塊；消化與接種：把漂洗后的組織塊收集到離心管中， 然后加入1-2ml膠原酶，置于含有5% CO2 37C二氧化碳培養(yǎng) 箱中消化，每 15min 搖動(dòng)離心管一次， 40min 后拿出，然后吹打 均勻， 以 800rpm 離心 6min ，棄去上清液， 加入 2ml 培養(yǎng)液（含 10%胎牛血清、200U/ml慶大霉素和100U/ml青霉素的a -MEM 下同）再

6、次吹打均勻，接種于 6 孔板中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)（5%CO2 37C）,每3d換液一次。2）健康牙周膜干細(xì) 胞的培養(yǎng)（ PDLSC）s ：取材：選取臨床上年齡在 20-35 歲之間 的非牙周炎患者， 收集其因正畸需要所拔牙齒或拔除的無(wú)炎癥的 阻生第三磨牙，刮取其根中部 1/3 牙周膜；消化與接種：將獲 得組織用 PBS 漂洗 3 遍，余步驟同上。1.4.2 細(xì)胞的純化： 本次試驗(yàn)使用有限稀釋法對(duì) iPDLSCs 和PDLSC進(jìn)行純化，顯微鏡下觀察原代細(xì)胞鋪滿 6孔板底達(dá)80% 匯合時(shí)，棄去原培養(yǎng)液，用 PBS 沖洗 2 遍，然后加入胰蛋白酶 2ml 消化 2-3min ，鏡下見(jiàn)細(xì)胞團(tuán)

7、漂浮在液體之上時(shí)加入等量的培 養(yǎng)液終止消化， 反復(fù)吹打數(shù)次后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中， 以 800rpm離心6min,棄上清，加入適量培養(yǎng)液進(jìn)行倍比稀釋?zhuān){(diào) 整細(xì)胞密度至10-20個(gè)/ml，以1-2個(gè)/孔的密度接種于96孔 板，每孔加入培養(yǎng)液100卩l(xiāng)，次日挑選出單個(gè)細(xì)胞孔，將培養(yǎng) 液加至200卩l(xiāng)繼續(xù)培養(yǎng)，每3d換液1次，待細(xì)胞長(zhǎng)滿孔底 1/3-1/2 時(shí)消化并接種培養(yǎng)瓶，常規(guī)培養(yǎng)傳代。1.5 流式細(xì)胞儀表面分子鑒定： 取篩選培養(yǎng)的人牙周膜干 細(xì)胞和炎癥牙周膜干細(xì)胞，棄原培養(yǎng)液，PBS沖洗兩遍，用胰蛋白酶2ml消化1min，a -MEN中和消化，1000r/min 離心6min， 棄上清，用

8、含30%胎牛血清的PBS緩沖液將牙周膜細(xì)胞制成單細(xì) 胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度 4.0x105/L ，每個(gè) Eppendof 管加 400ul 的細(xì)胞懸液， 室溫下分別避光加入 CD45-PE、CD31-PE、CD90-PE、 STRO-1-FITC、CD29-FITC CD105-PE/J、鼠抗人單克隆抗體 2ul , 4C冰箱避光孵育2h,用含30%臺(tái)牛血清PBS緩沖液清洗細(xì)胞兩 到三遍，1000r/min離心5min,將細(xì)胞重懸于含30%臺(tái)牛血清PBS 中，使用同型對(duì)照單克隆抗體確定背景標(biāo)記， 用流式細(xì)胞儀分析 熒光細(xì)胞，專(zhuān)用配套軟件計(jì)算細(xì)胞表面抗原陽(yáng)性率，單位用%表示。 2 結(jié)果2.1 原代

9、細(xì)胞生長(zhǎng)情況： 使用酶消化組織塊法原代培養(yǎng)iPDLSCs和PDLSCs接種3-7d后可以看到有細(xì)胞從組織塊周?chē)?爬出，在遠(yuǎn)離組織塊的地方也有數(shù)個(gè)細(xì)胞爬出， 大部分細(xì)胞大、 均一，為成纖維細(xì)胞樣，呈長(zhǎng)梭形，少數(shù)細(xì)胞體積較、，呈多角 形或橢圓形，胞漿豐滿，兩種細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差異，PDLSCS接種 2w 左右達(dá) 80%匯合， iPDLSCs 接種 3w 左右達(dá) 80%匯合。（圖 1 、2）2.2 細(xì)胞純化情況： 炎癥牙周膜干細(xì)胞接種 96 孔板后 25d左右，約 20%的單細(xì)胞孔細(xì)胞形成克隆并增殖鋪滿孔底1/3-1/2 ，細(xì)胞排列密度大，細(xì)胞體積略小，呈梭形， 9d 左右可傳代一次。健康牙周膜干細(xì)胞

10、接種 96 孔板后 15d 左右，約 30%的單細(xì) 胞孔細(xì)胞形成克隆并增殖鋪滿孔底 1/3-1/2 ，細(xì)胞形態(tài)與炎癥牙 周膜干細(xì)胞無(wú)明顯差異， 7d 左右可傳代一次。2.3流式細(xì)胞儀表面分子鑒定：分離得到的PDLSCSiPDLSCs具有干細(xì)胞的分子表型和較高的純度（圖3）,即均表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞分子陽(yáng)性 （ STRO-1、CD29、CD105、CD90），（ CD31、 CD45為陰性，其中PDLSC表面分子CD105勺陽(yáng)性表達(dá)率為26.6%（圖A-1 ）、CD29的陽(yáng)性表達(dá)率為 96.1% （圖A-2 ）、STRO-1的 陽(yáng)性表達(dá)率為5.4% （圖A-3 ）、CD90的陽(yáng)性表達(dá)率為85.2%

11、（圖 A-4）, iPDLSCs表面分子CD105的陽(yáng)性表達(dá)率為50.2%（圖B-1 ）、 CD29的陽(yáng)性表達(dá)率為95.3% （圖B-2 ）、STRO-1的陽(yáng)性表達(dá)率為 7.0% （圖B-3）、CD90的陽(yáng)性表達(dá)率為 85.8% （圖B-4）3 討論牙周膜干細(xì)胞（ periodontal ligament stem cell ， PDLSC 是來(lái)源于牙周膜的成體干細(xì)胞， 具有自我更新能力， 能夠被誘導(dǎo) 形成多種組織細(xì)胞， 能夠維持牙周膜功能的穩(wěn)定， 發(fā)揮生理性細(xì) 胞更新和修復(fù)組織損傷的作用 12-13 。近年來(lái)許多學(xué)者利用 PDLSC體外培養(yǎng)模型，在牙周組織疾病的發(fā)病機(jī)制及治療研究等 方面取得

12、了一定進(jìn)展， 如何獲取大量的人牙周膜干細(xì)胞， 是建立 體外研究模型的關(guān)鍵之一。 目前牙周膜細(xì)胞的分離培養(yǎng)主要有酶 消化法和組織塊法， 其中組織塊法被廣泛采用， 但是它的培養(yǎng)成 功率較低，近年來(lái)有些研究表明利用酶消化組織塊法來(lái)培養(yǎng)牙周 膜干細(xì)胞， 可以提高原代細(xì)胞培養(yǎng)的成功率 14 ，采用該法我們 成功培養(yǎng)出人炎癥牙周膜干細(xì)胞的原代， 原代培養(yǎng)成功率達(dá)到了 50%。為了獲得更多的干細(xì)胞， 我們采用傳統(tǒng)方法對(duì)原代炎癥牙周 膜干細(xì)胞和健康牙周膜干細(xì)胞進(jìn)行了純化， 即對(duì)炎癥牙周膜干細(xì) 胞和健康牙周膜干細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋法， 挑選單細(xì)胞克隆， 繼而 擴(kuò)大培養(yǎng)，克隆化生長(zhǎng)的能力至少滿足了干細(xì)胞應(yīng)具有克隆形成 能力這一條件， 為我們的鑒定工作奠定了一定的基礎(chǔ)， 同時(shí)我們 采用流式細(xì)胞技術(shù)來(lái)鑒定炎癥牙周膜干細(xì)胞和健康牙周膜干細(xì) 胞的表面分子，結(jié)果表明 STRO-1 CD29