分光光度法測定絲肽液中氨基酸總含量-

1、F LAV OUR FR AGR AN CE C OSMETICS Ju ne ,2011,N O 13分光光度法測定絲肽液中氨基酸總含量作者 1.化學(xué)化工與生物工程學(xué)院,生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,東華大學(xué),上海201620;2.工業(yè)品與原材料檢測技術(shù)中心,上海出入境檢驗(yàn)檢疫局,上海200135黃威娜1,2楊勇2林苗1摘要采用分光光度法測定絲肽液中氨基酸總含量,確定以甘氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品、茚三酮為顯色劑的測定方法。最佳反應(yīng)條件:反應(yīng)p H 值為5.4,緩沖液的用量為2.0mL ,顯色劑的用量為1.0mL ,沸水浴加熱15min ,冷卻至室溫后,在最大吸收波長573nm 處測定吸光度。該方法操作簡便、

2、結(jié)果準(zhǔn)確,重現(xiàn)性良好,可用于化妝品產(chǎn)品的檢驗(yàn)。關(guān)鍵詞絲肽液茚三酮含量測定分光光度法Determination of Amino Acid Content in Silk Peptide Solution by SpectrophotometryH UA N G W ei na1,2YA N G Yong 2L I N M i ao 1(1.College of Chemist ry ,Chemical Engineering and Biotechnology ,Key Laboratory of Science &Tech 2nology of Eco 2Textile of Min

3、istry of Education ,Donghua University ,Shanghai 201620,China ;2.Inspec 2tion Center of Indust rial Product &Raw Materials ,Shanghai Entry 2Exit Inspection &Quarantine Bureau ,Shanghai 200135,China Abst ract :The total amount of amino acid in silk peptide solution was analyzed by spectromete

4、r.The measuring method wasinvestigated ,using glycine as the standard substance and ninhydrin as the chromogenic agent.The optimum conditions were proved as follows :buffer solution volume 2mL with p H of 5.4,chromogenic agent volume 1mL ,heating time 15minutes in boiling water bath ,absorption wave

5、length at 573nm after the sample solutions were cooled to the room temperature.It was shown that this method was a simple ,accurate ,and repeatable measurement ,which could be adopted to supervise and examine the amino acid content of cosmetic products.Key wor ds :silk peptide solution ninhydrin con

6、tent determination spectrophotometry收稿日期:2010209224絲肽1是天然蠶絲的水解產(chǎn)物,其基本結(jié)構(gòu)單元是氨基酸。分子中含有大量的氨基(2N H 2、羧基(2COO H 、羥基(2O H 等親水性基團(tuán),能夠像手一樣抓住水分子,將水束縛住,具有優(yōu)異的吸濕保濕作用。絲肽可以起到營養(yǎng)肌膚、延緩衰老、減少皺紋的功效,還能抑制酪氨酸酶的活性,減少黑色素形成,使皮膚白嫩。絲肽優(yōu)異的保濕作用及獨(dú)特的護(hù)膚特性正在被越來越多的人接受和認(rèn)可,在化妝品中的應(yīng)用日益普遍。測定絲肽液中氨基酸的含量,是絲肽類化妝品質(zhì)量評價(jià)中最為重要的指標(biāo)。根據(jù)氨基酸分析儀的工作原理和相關(guān)氨基酸的檢

7、測方法,以甘氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品,茚三酮為顯色劑,分光光度計(jì)為測定儀器,對紫外分光光度法測定氨基酸含量的方法條件和可行性進(jìn)行了一系列的研究,得到了比較滿意的結(jié)果。該方法所用試劑配制簡單、無毒害、操作過程簡便、穩(wěn)定性好,相關(guān)性在0.999以上,回收率在95%105%之間。1儀器與試劑1.1儀器AB2042N電子天平(梅特勒2托利多儀器有限公司;電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠;臺(tái)式酸度計(jì)6171(上海任氏電子有限公司;R2201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申勝生物技術(shù)有限公司;SHB2A循環(huán)多用式真空泵(陜西太康生物科技有限公司;EYEL A冷卻水循環(huán)裝置CA21111(上海愛朗儀器有限公司;Lambda35紫外2

8、可見分光光度儀(美國Perkin Elmer公司;721分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠。1.2試劑絲肽液(杭州萬景新材料有限公司;L2甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(99%,上海源葉生物科技有限公司;茚三酮(AR,上?？曝S化學(xué)試劑有限公司;其它試劑均為分析純。2實(shí)驗(yàn)方法2.1溶液的配制分別量取1mL1/15molL-1的Na2HPO4和99mL1/15molL-1的Na H2PO4,混勻,用酸度計(jì)精確測量混合緩沖溶液的p H值,若有偏差,微調(diào)并標(biāo)定至所需p H值。稱取1.5g水合茚三酮,加入適量乙二醇微熱溶解后,轉(zhuǎn)移至50mL棕色容量瓶中,用乙二醇定容至刻度,置4冰箱中備用(臨用時(shí)配制。準(zhǔn)確稱取0.0100g甘

9、氨酸標(biāo)準(zhǔn)品置于100mL 容量瓶中,加水溶解,定容至刻度,搖勻,置于4冰箱中備用。此溶液濃度為100g/mL。2.2樣品處理取準(zhǔn)確體積的絲肽液樣品于三口燒瓶中,加入5倍體積的6molL-1的HCl及23滴苯酚,封口,同時(shí)抽真空脫氣,N2密封保護(hù),油浴加熱,于150下水解1.5h,水解完畢,將水解液旋蒸至干,用蒸餾水定容至原體積,搖勻,即得絲肽水解液4。取準(zhǔn)確體積的絲肽水解液于1000mL容量瓶中,用蒸餾水定容至刻度,待測。2.3顯色條件的選擇配制不同濃度的甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和不同p H值的緩沖溶液。反應(yīng)體系:取1mL待測溶液于25mL 具塞試管中,加2mL磷酸鹽緩沖液,充分搖勻,加一定體積3%茚三

10、酮乙二醇溶液,搖勻。水浴加熱一定時(shí)間,冷卻后,于573nm處測定吸光度。研究不同p H值、顯色劑用量、加熱時(shí)間對吸光度的影響。2.4結(jié)果計(jì)算X=/1000V×1000式中:X樣品中氨基酸的含量,mg/mL;從回歸方程中計(jì)算出樣品氨基酸的濃度, g/mL;V移取絲肽水解液的體積,mL。3結(jié)果與討論3.1反應(yīng)條件的選擇采用比色法測定絲肽液中氨基酸總含量,測定原理5為:2氨基酸與水合茚三酮一起在水溶液中加熱,可發(fā)生反應(yīng)生成藍(lán)紫色物質(zhì)。首先是氨基酸被氧化分解,放出氨和二氧化碳,氨基酸生成醛,水合茚三酮?jiǎng)t生成還原型茚三酮。在弱酸性溶液中,還原茚三酮、氨和另一分子茚三酮反應(yīng),縮合成藍(lán)紫色物質(zhì)。分

11、別取甘氨酸對照品溶液、樣品溶液、蒸餾水各1mL于3支試管中,再各添加磷酸鹽緩沖液2mL和茚三酮溶液1mL,搖勻,水浴加熱15min,取出,冷卻。以蒸餾水為空白,在分光光度儀中進(jìn)行波長掃描,測定甘氨酸對照品溶液、樣品溶液的吸光度值。結(jié)果顯示對照品溶液和樣品溶液在(573±2nm處均有最大吸收。因此,確定本試驗(yàn)的最佳測定波長為573nm。不管2氨基酸和茚三酮按何種機(jī)理進(jìn)行反應(yīng),主要的顏色產(chǎn)物都是通過縮合形成的,這種縮合反應(yīng)在弱酸性條件下易于發(fā)生,它類似于羰基化合物和氨的衍生物之間的反應(yīng),生成的顏色在弱酸性條件下較為穩(wěn)定。在強(qiáng)酸性介質(zhì)中,縮合產(chǎn)物形成困難,也不穩(wěn)定。而在堿性條件下,茚三酮的

12、顯色反應(yīng)范圍擴(kuò)大,副反應(yīng)增多,不利于茚三酮對2氨基酸的檢驗(yàn)和測定。在堿性條件下,顏色的不穩(wěn)定也妨礙了對2氨基酸的準(zhǔn)確分析。因此,經(jīng)試驗(yàn)比較,本實(shí)驗(yàn)選擇弱酸性緩沖溶液(p H=5.4作為反應(yīng)環(huán)境。取1mL濃度為20g/mL的甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液于一組25mL的帶塞試管中,各加入2mL磷酸F LAVOUR FR AGR AN CE C OSMETICS Ju ne ,2011,N O 13鹽緩沖液(p H =5.4,分別往瓶中加入0.5、1.0、1.5、2.0mL 3%茚三酮溶液,顯色。測定各顯色體系的吸光度值,結(jié)果見圖1。由圖1可知:隨著顯色劑用量的不斷增加,吸光度不斷增大,當(dāng)顯色劑的用量為1.0m

13、L 時(shí),吸光度接近最大值,從保證試驗(yàn)效果和節(jié)約顯色劑的角度考慮,顯色劑的用量為1.0mL 比較恰當(dāng)。 圖1顯色劑用量對吸光度的影響。 圖2加熱時(shí)間對吸光度的影響分別吸取0.00、0.50、1.00、2.50、5.00、7.50、10.00mL 100g/mL 的甘氨酸儲(chǔ)備液于50mL 容量瓶中,用蒸餾水定容至刻度,搖勻。配制成0.0、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0g/mL 的甘氨酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取上述標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各1.0mL ,分別置于7支25mL 試管中,加入2mL 磷酸鹽緩沖液(p H =5.4,充分搖勻后,加2mL 3%茚三酮乙二醇溶液,搖勻。將7支試管同時(shí)置于沸

14、水浴中,待水沸騰后精確計(jì)時(shí)15min ,同時(shí)取出試管,置于冷水中冷卻至室溫,于573nm 波長處依次測定吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)甘氨酸濃度作橫坐標(biāo),以吸光度作縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見圖3。求得其回歸方程為y=0.0154x -0.0006,相關(guān)系數(shù)R 2=0.9993。因此,在濃度020g/mL 的范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。圖3甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線取一定量的絲肽液進(jìn)行多次測定(n =6,計(jì)算其氨基酸總含量,結(jié)果見表1。表1絲肽液中氨基酸總含量測定的重復(fù)性樣品號測定結(jié)果/(mg/mL 平均值/(mg/mL SD 值/%RSD 值9.459.369.389.329.389.419.384.410.47為了確定測

15、量的準(zhǔn)確度,取一定量的絲肽液,測定其氨基酸總量作為本底量,以5mg 和10mg 的甘氨酸分別作為加標(biāo)量,測定回收率,結(jié)果見表2。表2加標(biāo)回收率試驗(yàn)本底量/(mg/mL 加標(biāo)量/(mg/mL 測定總量/(mg/mL 回收率/%1019.2899.344結(jié)論1采用分光光度法測定絲肽液中的氨基酸總含量,最佳的試驗(yàn)條件為:p H =5.4,沸水浴加熱15min ,冷卻至室溫后在最大吸收波長573nm 處測定。該方法的變異系數(shù)小于0.47%,平均加標(biāo)回收率為98.30%。本法具有操作簡單、快速和重現(xiàn)性較好等優(yōu)點(diǎn)。2近年來,人們更加樂于使用天然綠色產(chǎn)品,天然護(hù)膚的概念在整個(gè)化妝品行業(yè)盛行,而絲肽源于天然蠶

16、絲,順應(yīng)了消費(fèi)者崇尚自然的心理,這預(yù)示著絲肽作為天然保濕劑具有廣闊的應(yīng)用和發(fā)展空間。測定絲肽液中氨基酸的總含量,為含絲肽類化妝品產(chǎn)品的測定提供了一個(gè)合理的判定標(biāo)準(zhǔn)。參考文獻(xiàn)1國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典M .北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:157.2余麗麗,朱雷,余佳麗.保濕因子與保濕化妝品J .中國化妝品(行業(yè)版,2009(4:84295.3胡京枝,董小海,余大杰.紫外分光光度法測定含乳飲料中游離氨基酸含量J .中國食品添加劑,2007(6:1642166.4丁雅韻,謝孟峽,康娟.蛋白質(zhì)水解液中氨基酸組成的定量分析J .分析化學(xué)研究簡報(bào),2002,30(4:4182421.5王鏡巖,朱

17、圣庚,徐長法.生物化學(xué)(第3版M .北京:高等教育出版社,2002.6張振華.2氨基酸與茚三酮顯色反應(yīng)影響因素的探討J .邵陽高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào),2000,13(1:42244.(上接第32頁3結(jié)論1采用感官評價(jià)的方法,通過4因素4水平的正交試驗(yàn),確定了冷榨茶油護(hù)膚霜的最佳生產(chǎn)工藝為:攪拌速度1400r/min ,乳化溫度70,水相兩次緩慢加入油相,乳化時(shí)間25min 。2在最佳工藝條件下,制取的冷榨茶油護(hù)膚霜具有滋潤皮膚、消炎止癢、修復(fù)創(chuàng)傷等功效以及穩(wěn)定性好、刺激性小、安全性高等特點(diǎn),為今后進(jìn)一步研制冷榨茶油化妝品奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)1陳珊,何庭玉.茶油的精制方法及應(yīng)用J .林產(chǎn)化工通訊,2005,39(6:39241.2柏愛云,宋大海,張富強(qiáng),等.油茶籽油與橄欖油營養(yǎng)價(jià)值的比較J .中國油脂,2008,33(