植物組織培養(yǎng)學(xué)課件

1、植物組織培養(yǎng)學(xué)植物組織培養(yǎng)學(xué)Plant tissue culture 植物組織培養(yǎng)學(xué)植物組織培養(yǎng)簡介 定義：離體（in vitro)條件下利用人工培養(yǎng)條件在無菌情況下培養(yǎng)、生長、發(fā)育再生出完整植株的過程。植物組織培養(yǎng)學(xué) 植物組織培養(yǎng)是二十世紀(jì)發(fā)展起來的新技術(shù)，近三十年來由于組織培養(yǎng)基礎(chǔ)理論研究的深入，發(fā)展極為迅速，發(fā)表的文獻(xiàn)浩如煙海，幾乎以植物為研究對象的各個(gè)分支學(xué)科都在廣泛進(jìn)行組織培養(yǎng)。 植物組織培養(yǎng)學(xué)發(fā)展簡史 1838-1839年，德國科學(xué)家Schleide 和Schwann發(fā)表了細(xì)胞學(xué)說，奠定了組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)。1902年，德國植物學(xué)家Haberlandt 根據(jù)細(xì)胞學(xué)說，提出單個(gè)細(xì)胞的

2、植物細(xì)胞全能性（totipotency）理論。1904年，Hanning 最先成功地培養(yǎng)了蘿卜和辣根菜的胚。1922年，Knudson 采用胚培養(yǎng)法獲得大量蘭花幼苗。1934年，White 用番茄根尖建立起第一個(gè)活躍生長的無性繁殖系，從而使非胚器官的培養(yǎng)首先獲得成功。1958年，英國科學(xué)家Steward 等用胡蘿卜根的愈傷組織細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，成功誘導(dǎo)出胚狀體并分化為完整的小植株，不但使細(xì)胞全能性理論得到證實(shí)，而且為組織培養(yǎng)的技術(shù)程序奠定了基礎(chǔ)。 1962年，Murashinge 和Skoog 在煙草培養(yǎng)中篩選出至今仍被廣泛使用的MS培養(yǎng)基。1964-1966年，印度科學(xué)家Guha 和Mahe

3、swari 在曼陀羅花藥培養(yǎng)中首次由花粉誘導(dǎo)得到了單倍體植株。1972年，Carlson 通過兩個(gè)種的煙草原生質(zhì)體融合培養(yǎng)，獲得了第一個(gè)體細(xì)胞雜交的雜種植株。植物組織培養(yǎng)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域1、快速繁殖 運(yùn)用組織培養(yǎng)的途徑，一個(gè)單株一年可以繁殖幾萬到幾百萬個(gè)植株。例如一株葡萄一年繁殖到3萬多株，一株蘭花一年繁殖到400萬株。2、種苗脫毒 針對病毒對農(nóng)作物造成的嚴(yán)重危害，通過組織培養(yǎng)可以有效地培育出大量的無病毒種苗。已經(jīng)取得成功的有馬鈴薯、草莓、香蕉、葡萄等等。3、遠(yuǎn)緣雜交 利用組織培養(yǎng)可以使難度很大的遠(yuǎn)緣雜交取得成功，從而育成一些罕見的新物種。比如遼寧果樹研究所利用這種方法獲得蘋果與梨的雜交種。4、突變

4、育種 采用組織培養(yǎng)可以直接誘變和篩選出具抗病、抗鹽、高賴氨酸、高蛋白等優(yōu)良性狀的品種。象中國林科院用逐步加大培養(yǎng)基中鹽的濃度，直接獲得耐鹽的楊樹株系。5、基因工程 基因工程主要研究DNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)，而基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后必須通過組織培養(yǎng)途徑才能實(shí)現(xiàn)植株再生。 6、生物制品 有些極其昂貴的生物制品，如抗癌首選藥物-紫杉醇等，可以用大規(guī)模培養(yǎng)植物細(xì)胞來直接生產(chǎn)。近年國內(nèi)在紅豆杉組織培養(yǎng)中獲得生長量高達(dá)0.49gFW/（gFWd）的細(xì)胞系，每升細(xì)胞培養(yǎng)物中紫杉醇的產(chǎn)量可達(dá)0.25mg。 植物組織培養(yǎng)學(xué)植物組織培養(yǎng)的分類 外植體（explant)：由活體（in vivo)植物體上提取下來的，接種在培養(yǎng)基上的無菌細(xì)胞

5、、組織、器官等。 廣義的組織培養(yǎng)依外植體不同，可分為：器官培養(yǎng)（organ culture）、莖尖分生組織培養(yǎng)(shoot tip culture,shoot apex culture,apical meristem culture)、愈傷組織培養(yǎng)(calluse cultrue)、細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)、原生質(zhì)體培養(yǎng)(protoplast culture) 愈傷組織（callus）在人工培養(yǎng)基上由外植體上形成的一團(tuán)無序生長狀態(tài)的薄壁細(xì)胞。植物組織培養(yǎng)學(xué)返回植物組織培養(yǎng)學(xué)返回植物組織培養(yǎng)學(xué)植物組織培養(yǎng)學(xué)植物組織培養(yǎng)學(xué)植物組織培養(yǎng)學(xué)植物組織培養(yǎng)學(xué)植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)植物細(xì)胞的全能

6、性 植物細(xì)胞的全能性（植物細(xì)胞的全能性（totipotent)：植物細(xì)胞具有該植物體全部遺傳的可能性，在一定條件下具有發(fā)育成完整植物體的潛在能力。 原理原理：生物體的每一個(gè)細(xì)胞都包含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)，都有發(fā)育成為完整個(gè)體所必需的全部基因，從理論上講，生物體的每一個(gè)活細(xì)胞都應(yīng)該具有全能性。 差異：差異：（1） 受精卵的全能性最高 （2） 受精卵分化后的細(xì)胞中，體細(xì)胞的全能性比生殖細(xì)胞的低。 潛在全能性的原因潛在全能性的原因：基因表達(dá)的選擇性 科學(xué)研究表明，處于離體狀態(tài)的植物活細(xì)胞，在一定的營養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件的作用下，就可能表現(xiàn)出全能性，發(fā)育成完整的植株。人工條件下實(shí)現(xiàn)的這一

7、過程，就是植物組織培養(yǎng)。 植物組織培養(yǎng)學(xué)植物細(xì)胞全能性的表達(dá) 脫分化（dedifferentiation)：將來自已分化組織的已停止分裂的細(xì)胞從植物體部分的抑制性影響下解脫出來，恢復(fù)細(xì)胞的分裂活性。 再分化（redifferentiation):經(jīng)脫分化的組織或細(xì)胞在一定的培養(yǎng)條件下可有轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞣N不同細(xì)胞類型的能力。植物組織培養(yǎng)學(xué)離體的植物離體的植物器官、組織、器官、組織、細(xì)胞細(xì)胞脫分化脫分化愈愈傷傷組組織織再分化再分化根根芽芽植植物物體體植物組織培養(yǎng)過程植物組織培養(yǎng)過程植物組織培養(yǎng)條件植物組織培養(yǎng)條件： 含有全部營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基、一定的溫度、空氣、無菌環(huán)境、適合的PH、適時(shí)光照等。植物組織培

8、養(yǎng)學(xué)植物組織培養(yǎng)特點(diǎn)培養(yǎng)條件可以人為控制 組織培養(yǎng)采用的植物材料完全是在人為提供的培養(yǎng)基質(zhì)和小氣候環(huán)境條件下進(jìn)行生長，擺脫了大自然中四季、晝夜的變化以及災(zāi)害性氣候的不利影響，且條件均一，對植物生長極為有利，便于穩(wěn)定地進(jìn)行周年培養(yǎng)生產(chǎn)。 生長周期短，繁殖率高 植物組織培養(yǎng)是由于人為控制培養(yǎng)條件，根據(jù)不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培養(yǎng)條件，因此生長較快。另外，植株也比較小，往往2030d為一個(gè)周期。所以，雖然植物組織培養(yǎng)需要一定設(shè)備及能源消耗，但由于植物材料能按幾何級數(shù)繁殖生產(chǎn)，故總體來說成本低廉，且能及時(shí)提供規(guī)格一致的優(yōu)質(zhì)種苗或脫病毒種苗。 管理方便，利于工廠化生產(chǎn)和自動(dòng)化控制 植物組織

9、培養(yǎng)是在一定的場所和環(huán)境下，人為提供一定的溫度、光照、濕度、營養(yǎng)、激素等條件，既利于高度集約化和高密度工廠化生產(chǎn)，也利于自動(dòng)化控制生產(chǎn)。它是未來農(nóng)業(yè)工廠化育苗的發(fā)展方向。它與盆栽、田間栽培等相比省去了中耕除草、澆水施肥、防治病蟲害等一系列繁雜勞動(dòng)，可以大大節(jié)省人力、物力及田間種植所需要的土地。 植物組織培養(yǎng)學(xué)第二章 組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)技術(shù) 第一節(jié)第一節(jié) 實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 室室 在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)工作之前，首先應(yīng)對工作中需要哪些最基本的設(shè)備條件有個(gè)全面的了解，以便因地制宜地利用現(xiàn)有房屋，或新建、改建實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室的大小取決于工作的目的和規(guī)模。以工廠化生產(chǎn)為目的，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模太小，則會(huì)限制生產(chǎn)，影響效率。在設(shè)計(jì)

10、組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室時(shí)，應(yīng)按組織培養(yǎng)程序來沒計(jì)，避免某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后工作混亂。植物組織培養(yǎng)是在嚴(yán)格無菌的條件下進(jìn)行的。要做到無菌的條件，需要一定的設(shè)備、器材和用具，同時(shí)還需要人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。植物組織培養(yǎng)學(xué)1 實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)原則：保證無菌操作，達(dá)到工作方便，防止污染。2 實(shí)驗(yàn)室組成： 化學(xué)實(shí)驗(yàn)室、洗滌菌室、無菌操作室（接種室）、培養(yǎng)室、細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室。植物組織培養(yǎng)學(xué) 化學(xué)實(shí)驗(yàn)室（準(zhǔn)備室）：完成所使用的各種藥品的貯備、稱量、溶解、配制、培養(yǎng)基分裝等。 主要設(shè)備： 藥品柜、防塵櫥（放置培養(yǎng)容器）、冰箱、天平、蒸餾水器、酸度計(jì)及常用的培養(yǎng)基配制用玻璃儀器. 洗滌、滅菌室：完成各種器具的洗

11、滌、干燥、保存、培養(yǎng)基的滅菌等。 主要設(shè)備：水池、操作臺(tái)、高壓滅菌鍋、干燥滅菌器（如烘箱）等。植物組織培養(yǎng)學(xué) 無菌操作室（接種室）無菌操作室（接種室）：主要用于植物材料的消毒、接種、培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)移、試管苗的繼代、原生質(zhì)體的制備以及一切需要進(jìn)行無菌操作的技術(shù)程序。 主要設(shè)備：紫外光源、超凈工作臺(tái)、消毒器、酒精燈、接種器械（接種鑷子、剪刀、解剖刀、接種針）等。 接種室宜小不宜大，一般78平米，要求地面、天花板及四壁盡可能密閉光滑，易于清潔和消毒。配置拉動(dòng)門，以減少開關(guān)門時(shí)的空氣擾動(dòng)。 接種室要求干爽安靜，清潔明亮。在適當(dāng)位置吊裝12盞紫外線滅菌燈，用以照射滅菌。最好安裝一小型空調(diào)，使室溫可控，這樣可

12、使門窗緊閉，減少與外界空氣對流。 接種室應(yīng)設(shè)有緩沖問，面積1m2為宜。進(jìn)入無菌操作室前在此更衣?lián)Q鞋，以減少進(jìn)出時(shí)帶入接種室雜菌。緩沖間最好也安一盞紫外線滅菌燈，用以照射滅菌。 植物組織培養(yǎng)學(xué) 培養(yǎng)室培養(yǎng)室：培養(yǎng)室是將接種的材料進(jìn)行培養(yǎng)生長的場所。培養(yǎng)室的大小可根據(jù)需要培養(yǎng)架的大小、數(shù)目、及其他附屬設(shè)備而定。其設(shè)計(jì)以充分利用空間和節(jié)省能源為原則。高度比培養(yǎng)架略高為宜，周圍墻壁要求有絕熱防火的性能。 培養(yǎng)材料放在培養(yǎng)架上培養(yǎng)。培養(yǎng)架大多由金屬制成，一般設(shè)5層，最低一層離地高約lOcm，其他每層間隔30cm左右，培養(yǎng)架即高17m左右。培養(yǎng)架長度都是根據(jù)日光燈的長度而設(shè)計(jì)， 如采用40W日光燈，則長I

13、3m，30W的長lm，寬度一般為60cm。 培養(yǎng)室最重要的因子是溫度，一般保持在2027左右，具備產(chǎn)熱裝置，并安裝窗式或立式空調(diào)機(jī)。由于熱帶植物和寒帶植物等不同種類要求不同溫度，最好不同種類有不同的培養(yǎng)室。 室內(nèi)濕度也要求恒定，相對濕度以保持在70%80%為好，可安裝加濕器?？刂乒庹諘r(shí)間可安裝定時(shí)開關(guān)鐘，一般需要每天光照10-16h，也有的需要連續(xù)照明。短日照植物需要短日照條件，長日照植物需要長日照條件。現(xiàn)代組培實(shí)驗(yàn)室大多設(shè)計(jì)為采用天然太陽光照作為主要能源，這樣不但可以節(jié)省能源，而且組培苗接受太陽光生長良好，馴化易成活。在陰雨天可用燈光作補(bǔ)充。 主要設(shè)備：培養(yǎng)架（控溫控光控濕）、搖床、培養(yǎng)箱、

14、紫外光源等。植物組織培養(yǎng)學(xué) 細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室：用于對培養(yǎng)物的觀察分析與培養(yǎng)物的計(jì)數(shù)等。 主要設(shè)備：雙筒實(shí)體顯微鏡、顯微鏡、倒置顯微鏡等。 其他小型儀器設(shè)備：分注器、血球計(jì)數(shù)器、移液槍、過濾滅菌器、電爐等加熱器具、磁力攪拌器、低速臺(tái)式離心機(jī)等。 植物組織培養(yǎng)學(xué)第二節(jié) 植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)條件一、營養(yǎng)條件培養(yǎng)基(culture medium) 培養(yǎng)基：是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)。在離體培養(yǎng)條件下，不同種植物的組織對營養(yǎng)有不同的要求，甚至同一種植物不同部位的組織對營養(yǎng)的要求也不相同，只有滿足了它們各自的特殊要求，它們才能很好地生長。因此，沒有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類型的植物組織或器官，在建立一項(xiàng)新的培養(yǎng)系統(tǒng)

15、時(shí)，首先必須找到一合適的培養(yǎng)基，培養(yǎng)才有可能成功。 植物組織培養(yǎng)學(xué)培養(yǎng)基的種類 培養(yǎng)基有許多種類，根據(jù)不同的植物和培養(yǎng)部位及不同的培養(yǎng)目的需選用不同的培養(yǎng)基。 培養(yǎng)基的產(chǎn)生最早是Sacks(1680)和Knop(1681)，他們對綠色植物的成分進(jìn)行了分析研究，根據(jù)植物從土中主要是吸收無機(jī)鹽營養(yǎng)，設(shè)計(jì)出了由無機(jī)鹽組成的Sacks和Knop溶液，至今仍在作為基本的無機(jī)鹽培養(yǎng)基得到廣泛應(yīng)用。以后根據(jù)不同目的進(jìn)行改良產(chǎn)生了多種培養(yǎng)基，White培養(yǎng)基在40年代用得較多，現(xiàn)在還常用。而到60和70年代則大多采用MS等高濃度培養(yǎng)基，可以保證培養(yǎng)材料對營養(yǎng)的需要，并能生長快、分化快，且由于濃度高，在配制、消

16、毒過程中某些成分有些出入，也不致影響培養(yǎng)基的離子平衡。 培養(yǎng)基的名稱，一直根據(jù)沿用的習(xí)慣。多數(shù)以發(fā)明人的名字來命名，如White培養(yǎng)基，Murashige和Skoog培養(yǎng)基(簡稱MS培養(yǎng)基)，也有對某些成分進(jìn)行改良稱作改良培養(yǎng)基。 植物組織培養(yǎng)學(xué) 目前國際上流行的培養(yǎng)基有幾十種，常用的培養(yǎng)基及特點(diǎn)如下：(1)MS培養(yǎng)基 它是1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。特點(diǎn)是無機(jī)鹽和離子濃度較高，為較穩(wěn)定的平衡溶液。其養(yǎng)分的數(shù)量和比例較合適，可滿足植物的營養(yǎng)和生理需要。它的硝酸鹽含量較其他培養(yǎng)基為高，廣泛地用于植物的器官、花藥、細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)，效果良好。有些培養(yǎng)基是由它

17、演變而來的。(2)B5培養(yǎng)基 是1968年由Galmborg等為培養(yǎng)大豆根細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。其主要特點(diǎn)是含有較低的銨，這可能對不少培養(yǎng)物的生長有抑制作用。從實(shí)踐得知有些植物在B5培養(yǎng)基上生長更適宜，如雙子葉植物特別是木本植物。(3)White培養(yǎng)基 是1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計(jì)的。1963年又作了改良，稱作White改良培養(yǎng)基，提高了MsSO4的濃度和增加了硼素。其特點(diǎn)是無機(jī)機(jī)鹽數(shù)量較低，適于生根培養(yǎng)。（4）N6培養(yǎng)基 是1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的。其特點(diǎn)是成分較簡單，KNO3和（NH4）2SO4含量高。在國內(nèi)已廣泛應(yīng)用于小麥、水稻及其他植物的花藥培養(yǎng)和其

18、他組織培養(yǎng)。(5)KM8P培養(yǎng)基 它是1974年為原生質(zhì)體培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的。其特點(diǎn)是有機(jī)成分較復(fù)雜，它包括了所有的單糖和維生素，廣泛用于原生質(zhì)融合的培養(yǎng)。 植物組織培養(yǎng)學(xué)培養(yǎng)基的成分 培養(yǎng)基的成分主要可以分水、無機(jī)鹽、有機(jī)物、天然復(fù)合物、培養(yǎng)體的支持材料等五大類。 植物組織培養(yǎng)學(xué) 水是植物原生質(zhì)體的組成成分，也是一切代謝過程的介質(zhì)和溶媒。它是生命活動(dòng)過程中不可缺少的物質(zhì)。配制培養(yǎng)基母液時(shí)要用蒸餾水，以保持母液及培養(yǎng)基成分的精確性，防止貯藏過程發(fā)霉變質(zhì)。大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)可用自來水。但在少量研究上盡量用蒸餾水，以防成分的變化引起不良效果。 植物組織培養(yǎng)學(xué)無機(jī)元素(inorganic element) 大量

19、元素大量元素，指濃度大于0.5mmolL的元素等。其作用是：(1)N 是蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分，是生命不可缺少的物質(zhì)。在制備培養(yǎng)基時(shí)以NO3N和NH4N兩種形式供應(yīng)。大多數(shù)培養(yǎng)基既含有N03N又含NH4N。NH4N對植物生長較為有利。供應(yīng)的物質(zhì)有KNO3、NH4NO3等。有時(shí)，也添加氨基酸來補(bǔ)充氮素。(2)P 是磷脂的主要成分。而磷脂又是原生質(zhì)、細(xì)胞核的重要組成部分。磷也是ATP、ADP等的組成成分。在植物組織培養(yǎng)過程中，向培養(yǎng)基內(nèi)添加磷，不僅增加養(yǎng)分、提供能量，而且也促進(jìn)對N的吸收，增加蛋白質(zhì)在植物體中的積累。常用的物質(zhì)有KH2P04或NaH2P04等。(

20、3)K 對碳水化合物合成、轉(zhuǎn)移、以及氮素代謝等有密切關(guān)系。K增加時(shí)，蛋白質(zhì)合成增加，維管束、纖維組織發(fā)達(dá)，對胚的分化有促進(jìn)作用。但濃度不易過大，一般為13mgL為好。制備培養(yǎng)基時(shí)，常以KCI、KN03等鹽類提供。(4)Mg、S和Ca、Mg 是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑；S是含S氨基酸和蛋白質(zhì)的組成成分。它們常以MgSO47H20提供。用量為13mgl較為適宜；Ca是構(gòu)成細(xì)胞壁的一種成分，Ca對細(xì)胞分裂、保護(hù)質(zhì)膜不受破壞有顯著作用，常以CaCl22H2O提供。 植物組織培養(yǎng)學(xué)微量元素 指小于0.5mmolL的元素，F(xiàn)e，B，Mn，Cu，Mo，Co等。 鐵是一些氧化酶、細(xì)胞色素氧化酶、過氧

21、化氫酶等的組成成分。同時(shí)，它又是葉綠素形成的必要條件。培養(yǎng)基中的鐵對胚的形成、芽的分化和幼苗轉(zhuǎn)綠有促進(jìn)作用。在制做培養(yǎng)基時(shí)不用Fe2SO4，和FeCl3(因其在pH值52以上，易形成Fe(OH)3的不溶性沉淀)，而用FeSO47H20和Na2EDTA結(jié)合成合物使用。B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等，也是植物組織培養(yǎng)中不可缺少的元素，缺少這些物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致生長、發(fā)育異常現(xiàn)象。 植物組織培養(yǎng)學(xué)有機(jī)化合物(organic compound) 培養(yǎng)基中若只含有大量元素與微量元素，常稱為基本培養(yǎng)基（basic medium)。為不同的培養(yǎng)目的往往要加入一些有機(jī)物以利于快速生長。常加入的有機(jī)成分主要有以下幾

22、類： 植物組織培養(yǎng)學(xué)碳水化合物 最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是較好的碳源，可支持許多組織很好的生長。麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在組織培養(yǎng)中也有應(yīng)用。蔗糖使用濃度在2%3%，常用3%，即配制一升培養(yǎng)基稱取30g蔗糖，有時(shí)可用2.5%，但在胚培養(yǎng)時(shí)采用4%-15%的高濃度，因蔗糖對胚狀體的發(fā)育起重要作用。 不同糖類對生長的影響不同。從各種糖對水稻根培養(yǎng)的影響來看，以葡萄糖效果最好，果糖和蔗糖相當(dāng)，麥芽糖差一些。不同植物不同組織的糖類需要量也不同，實(shí)驗(yàn)時(shí)要根據(jù)配方規(guī)定按量稱取，不能任意取量。高壓滅菌時(shí)，一部分糖會(huì)發(fā)生分解，制定配方時(shí)要給予考慮。在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，可用食用的綿白糖代替。 植物組織

23、培養(yǎng)學(xué) 維生素(vitamin) 這類化合物在植物細(xì)胞里主要是以各種輔酶的形式參與多種代謝活動(dòng)，對生長、分化等有很好的促進(jìn)作用。雖然大多數(shù)的植物細(xì)胞在培養(yǎng)中都能合成所必需的維生素，但在數(shù)量上，還明顯不足，通常需加入一至數(shù)種維生素，以便獲得最良好的生長。主要有VBl(鹽酸硫胺素)、VB6(鹽酸吡哆醇)、Vpp(煙酸)、Vc（抗壞血酸）、有時(shí)還使用生物素、葉酸、VB12等。一般用量為0110mgL。有時(shí)用量較高。VB1對愈傷組織的產(chǎn)生和生活力有重要作用，VB6能促進(jìn)根的生長，Vpp與植物代謝和胚的發(fā)育有一定關(guān)系。Vc有防止組織變褐的作用。 植物組織培養(yǎng)學(xué) 肌醇 (myoinosltol)又叫環(huán)己六

24、醇，在糖類的相互轉(zhuǎn)化中起重要作用。通?？捎闪姿崞咸烟寝D(zhuǎn)化而成，還可進(jìn)一步生成果膠物質(zhì)，用于構(gòu)建細(xì)胞壁。肌醇與6分子磷酸殘基相結(jié)合形成植酸，植酸與鈣、鎂等陽離子結(jié)合成植酸鈣鎂，植酸可進(jìn)一步形成磷脂，參與細(xì)胞膜的構(gòu)建。使用濃度一般為lOOmgL，適當(dāng)使用肌醇，能促進(jìn)愈傷組織的生長以及胚狀體和芽的形成。對組織和細(xì)胞的繁殖、分化有促進(jìn)作用，對細(xì)胞壁的形成也有作用。 植物組織培養(yǎng)學(xué) 氨基酸(almino acide) 是很好的有機(jī)氮源，可直接被細(xì)胞吸收利用。培養(yǎng)基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。有時(shí)應(yīng)用水解乳蛋白或水解酪蛋白，它們是牛乳用酶法

25、等加工的水解產(chǎn)物，是含有約20種氨基酸的混合物，用量在10-1000mgL之間。由于它們營養(yǎng)豐富，極易引起污染。如在培養(yǎng)中無特別需要，以不用為宜。 植物組織培養(yǎng)學(xué)天然復(fù)合物 其成分比較復(fù)雜，大多含氨基酸、激素、酶等一些復(fù)雜化合物。它對細(xì)胞和組織的增殖與分化有明顯的促進(jìn)作用，但對器官的分化作用不明顯。它的成分大多不清楚，所以一般應(yīng)盡量避免使用。 植物組織培養(yǎng)學(xué) 1)椰乳 是椰子的液體胚乳。它是使用最多、效果最大的一種天然復(fù)合物。一般使用濃度在10%20%，與其果實(shí)成熟度及產(chǎn)地關(guān)系也很大。它在愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)中有促進(jìn)作用。在馬鈴薯莖尖分生組織和草莓微莖尖培養(yǎng)中起明顯的促進(jìn)作用，但莖尖組織的大小若

26、超過1nun時(shí)，椰乳就不發(fā)生作用。2)香蕉 用量為150-200mlL。用黃熟的小香蕉，加入培養(yǎng)基后變?yōu)樽仙?。對pH值的緩沖作用大。主要在蘭花的組織培養(yǎng)中應(yīng)用，對發(fā)育有促進(jìn)作用。3)馬鈴薯(potato) 去掉皮和芽后，加水煮30min，再經(jīng)過過濾，取其濾液使用。用量為150200gL。對pH值緩沖作用也大。添加后可得到健壯的植株。4)水解酪蛋白 為蛋白質(zhì)的水解物，主要成分為氨基酸，使用濃度為100200mgL。受酸和酶的作用易分解，使用時(shí)要注意。5)其他 酵母提取液(YE)(0.01%-0.05%)，主要成分為氨基酸和維生素類；麥芽提取液(0.01%0.5%)、蘋果和番茄的果汁、黃瓜的果實(shí)、

27、未熟玉米的胚乳等。遇熱較穩(wěn)定，大多在培養(yǎng)困難時(shí)使用，有時(shí)有效。 植物組織培養(yǎng)學(xué)植物生長調(diào)節(jié)物(hormone) 植物激素是植物新陳代謝中產(chǎn)生的天然化合物，它能以極微小的量影響到植物的細(xì)胞分化、分裂、發(fā)育，影響到植物的形態(tài)建成、開花、結(jié)實(shí)、成熟、脫落、衰老和休眠以及萌發(fā)等許許多多的生理生化活動(dòng)，在培養(yǎng)基的各成分中，植物生長調(diào)節(jié)物是培養(yǎng)基的關(guān)鍵物質(zhì)，對植物組織培養(yǎng)起著決定性作用。 植物組織培養(yǎng)學(xué)生長素類(auxin) 在組織培養(yǎng)中，生長素主要被用于誘導(dǎo)愈傷組織形成，誘導(dǎo)根的分化和促進(jìn)細(xì)胞分裂、伸長生長。在促進(jìn)生長方面，根對生長素最敏感。在極低的濃度下，(10-510-8rngL)就可促進(jìn)生長，其次

28、是莖和芽。天然的生長素?zé)岱€(wěn)定性差，高溫高壓或受光條件易被破壞。在植物體內(nèi)也易受到體內(nèi)酶的分解。組織培養(yǎng)中常用人工合成的生長素類物質(zhì)。IAA(indo acetic acid吲哚乙酸)是天然存在的生長素，亦可人工合成，其活力較低，是生長素中活力最弱的激素，對器官形成的副作用小、，高溫高壓易被破壞，也易被細(xì)胞中的1AA分解酶降解，受光也易分解。NAA(naphthalene acetic acid萘乙酸)在組織培養(yǎng)中的起動(dòng)能力要比IAA高出3-4倍，且由于可大批量人工合成，耐高溫高壓，不易被分解破壞，所以應(yīng)用較普遍。NAA和IBA廣泛用于生根，并與細(xì)胞分裂素互作促進(jìn)芽的增殖和生長。IBA(indo

29、lebutyri acid吲哚丁酸)是促進(jìn)發(fā)根能力較強(qiáng)的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。2，4D(2，4二氯苯氧乙酸)起動(dòng)能力比IAA高10倍，特別在促進(jìn)愈傷組織的形成上活力最高，但它強(qiáng)烈抑制芽的形成，影響器官的發(fā)育。適宜的用量范圍較狹窄，過量常有毒效應(yīng)。植物組織培養(yǎng)學(xué)細(xì)胞分裂素類 ( cytokinin ) 這類激素是腺嘌吟的衍生物，包括6BA(6芐基氨基嘌呤)、Kt (kinetin 激動(dòng)素)、Zt (zeatin 玉米素)等。其中Zt活性最強(qiáng)，但非常昂貴，常用的是6BA。 在培養(yǎng)基中添加細(xì)胞分裂素有三個(gè)作用：誘導(dǎo)芽的分化促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)生長。促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大。抑制根的分化。因此，細(xì)胞分裂素多用于誘導(dǎo)不定芽的

30、分化和莖、苗的增殖，而在生根培養(yǎng)時(shí)使用較少或用量較低。植物組織培養(yǎng)學(xué) GA ( gibberellic acid赤霉素) 有20多種，生理活性及作用的種類、部位、效應(yīng)等各有不同、培養(yǎng)基中添加的是GA3，主要用于促進(jìn)幼苗莖的伸長生長，促進(jìn)不定胚發(fā)育成小植株；赤霉素和生長素協(xié)同作用，對形成層的分化有影響，當(dāng)生長素赤霉素比值高時(shí)有利于木質(zhì)部分化，比值低時(shí)有利于韌皮部分化；此外，赤霉素還用于打破休眠，促進(jìn)種子、塊莖、鱗莖等提前萌發(fā)。一般在器官形成后，添加赤霉素可促進(jìn)器官或胚狀體的生長。 植物組織培養(yǎng)學(xué)激素配比模式 生長素與細(xì)胞分裂素的比例決定著發(fā)育的方向，是愈傷組織、長根還是長芽。如為了促進(jìn)芽器官的分

31、化，應(yīng)除去或降低生長素的濃度，或者調(diào)整培養(yǎng)基中生長素與細(xì)胞分裂素的比例。 高 有利于根的形成和愈傷組織 的形成生長素/細(xì)胞分裂素 適中 有利于根芽的分化 低 有利于芽的形成 生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用甚微，一般用mgL表示濃度。在組織培養(yǎng)中生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用濃度，因植物的種類、部位、時(shí)期、內(nèi)源激素等的不同而異，一般生長素濃度的使用為0.05-5mgL，細(xì)胞分裂素0.0510mgL。 植物組織培養(yǎng)學(xué)Growth medium is optimised for regeneration of plantletsNo sucrose (0%)Sucrose reduced to 1%Sucrose incr

32、eased to 5%The explant is completely covered with green shoots, and roots are developing on the lower surface Very few shoots have developed on the explant. No roots and no callus.Shoots developed on edges of upper surface, and some root development has occuredShoots have developed over the surface

33、of the explant, along with roots from the lower surface. The result is comparable with the control mediumtissue culture in the African Violet 植物組織培養(yǎng)學(xué)No BAP BAP reduced to 0.1 mg. l-1 No NAAPoor shoot development and no roots. Extensive callus generationPoor shoot development and no rootsNAA reduced

34、to 0.1 mg. l-1 More balanced development of roots and shoots. However, undifferentiated callus is developing at the edges of the explantProfuse development of roots and a reduced number of shoots. Undifferentiated callus is developing at the edges of the explant植物組織培養(yǎng)學(xué)NAA increased to 5.0 mg. l-1Pro

35、fuse development of roots over the explant upper and lower surface, and few shoots. Some callusNo MS saltsNo sign of regeneration from explant at all. MS salts reduced to 0.47 g. l-1 Some root growth but reduced development of shootsMS salts increased to 9.52 g. l-1 Shoots developed on upper surface

36、 of explant. No roots or callus.植物組織培養(yǎng)學(xué)培養(yǎng)材料的支持物 瓊脂(agar) 在固體培養(yǎng)時(shí)瓊脂是最好的固化劑。瓊脂是一種由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何營養(yǎng)。瓊脂能溶解在熱水中，成為溶膠，冷卻至40C即凝固為固體狀凝膠。通常所說的“煮化”培養(yǎng)基，就是使瓊脂溶解于90以上的熱水。瓊脂的用量在610gL之間，若濃度太高，培養(yǎng)基就會(huì)變得很硬，營養(yǎng)物質(zhì)難以擴(kuò)散到培養(yǎng)的組織中去。若濃度過低，凝固性不好。新買來的瓊脂最好先試一下它的凝固力。一般瓊脂以顏色淺、透明度好、潔凈的為上品。瓊脂的凝固能力除與原料、廠家的加工方式有關(guān)外，還與高壓滅菌時(shí)的溫度、時(shí)間、

37、pH值等因素有關(guān)，長時(shí)間的高溫會(huì)使凝固能力下降，過酸過堿加之高溫會(huì)使瓊脂發(fā)生水解，喪失凝固能力。時(shí)間過久，瓊脂變褐，也會(huì)逐漸喪失凝固能力。 加入瓊脂的固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基相比優(yōu)點(diǎn)在于操作簡便，通氣問題易于解決，便于經(jīng)常觀察研究等，但它也有不少缺點(diǎn)，如培養(yǎng)物與培養(yǎng)基的接觸(即吸收)面積小，各種養(yǎng)分在瓊脂中擴(kuò)散較慢，影響?zhàn)B分的充分利用，同時(shí)培養(yǎng)物排出的一些代謝廢物，聚集在吸收表面，對組織產(chǎn)生毒害作用。市售的各種瓊脂幾乎都含有雜質(zhì)，特別是Ca、Mg及其他微量元素。因此在研究植物組織或細(xì)胞的營養(yǎng)問題時(shí)，則應(yīng)避免使用瓊脂?？稍谝后w培養(yǎng)基表面安放一個(gè)無菌濾紙制成的濾紙橋，然后在濾紙橋上進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)。

38、 其他 有玻璃纖維、濾紙橋、海綿、脫脂棉、卡拉膠等，總的要求是排出的有害物質(zhì)對培養(yǎng)材料沒有影響或影響較小。 植物組織培養(yǎng)學(xué)抗生物質(zhì)(antibiotic) 抗生物質(zhì)有青霉素、鏈霉素、慶大霉素等，用量在520mg/L之間。 添加抗生物質(zhì)可防止菌類污染，減少培養(yǎng)中材料的損失，尤其是快速繁殖中，常因污染而丟棄成百上千瓶的培養(yǎng)物，采用適當(dāng)?shù)目股乇憧晒?jié)約人力、物力和時(shí)間。尤其對大量通氣長期培養(yǎng)，效果更好。對于剛感染的組織材料，可向培養(yǎng)基中注入5%10%的抗菌素。抗生素各有其抑菌譜，要加以選擇試用，也可兩種抗生素混用。但是應(yīng)當(dāng)注意抗生素對植物組織的生長也有抑制作用，可能某些植物適宜用青霉素，而另一些植物

39、卻不大適應(yīng)。值得提醒的是，在工作中不能以為有了抗菌素，而放松滅菌措施。此外，在停止抗生素使用后，往往污染率顯著上升，這可能是原來受抑制的菌類又滋生起來造成。植物組織培養(yǎng)學(xué)活性炭(active carbon) 活性炭為木炭粉碎經(jīng)加工形成的粉沫結(jié)構(gòu)，它結(jié)構(gòu)疏松，孔隙大，吸水力強(qiáng)，有很強(qiáng)的吸附作用，它的顆粒大小決定著吸附能力、粒度越小，吸附能力越大。溫度低吸附力強(qiáng)，溫度高吸附力減弱，甚至解吸附。通常使用濃度為0.5l0gL。它可以吸附非極性物質(zhì)和色素等大分子物質(zhì)，包括瓊脂中所含的雜質(zhì)，培養(yǎng)物分泌的酚、醌類物質(zhì)以及蔗糖在高壓消毒時(shí)產(chǎn)生的5羥甲基糖醛及激素等。 植物組織培養(yǎng)學(xué)活性炭的應(yīng)用莖尖初代培養(yǎng)，加

40、入適量活性炭，可以吸附外植體產(chǎn)生的致死性褐化物，其效力優(yōu)于Vc和半胱氨酸；在新梢增殖階段，活性炭可明顯促進(jìn)新梢的形成和伸長，但其作用有一個(gè)閾值，一般為0.1%0.2%，不能超過0.2%?；钚蕴吭谏鶗r(shí)有明顯的促進(jìn)作用，其機(jī)理一般認(rèn)為與活性炭減弱光照有關(guān)，可能是由于根頂端產(chǎn)生促進(jìn)根生長的IAA，但I(xiàn)AA易受可見光的光氧化而破壞，因此活性炭的主要作用就在于通過減弱光照保護(hù)了IAA，從而間接促進(jìn)了根的生長，由于根的生長加快，吸收能力增強(qiáng)，反過來又促進(jìn)莖、葉的生長。此外，在培養(yǎng)基中加入0.3%活性炭，還可降低玻璃苗的產(chǎn)生頻率，對防止產(chǎn)生玻璃苗有良好作用。活性炭在胚胎培養(yǎng)中也有一定作用，如在葡萄胚珠培養(yǎng)

41、時(shí)向培養(yǎng)基加入0.1%的活性炭，可減少組織變褐和培養(yǎng)基變色，產(chǎn)生較少的愈傷組織。 但是，活性炭具有副作用，研究表示，每毫克的活性炭能吸附l00ng左右的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，這說明只需要極少量的活性炭就可以完全吸附培養(yǎng)基中的調(diào)節(jié)物質(zhì)。大量的活性炭加入會(huì)削弱瓊脂的凝固能力，因此要多加一些瓊脂。很細(xì)的活性炭也易沉淀，通常在瓊脂凝固之前，要輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶?？傊欠N隨意抓一撮活性炭放人培養(yǎng)基，會(huì)帶來不良的后果。因此，在使用時(shí)要有其量的意識，使活性炭發(fā)揮其積極作用。 植物組織培養(yǎng)學(xué)植物組織培養(yǎng)學(xué)植物組織培養(yǎng)學(xué)Callus culture- creation of genetic variants via somaclonal variation and/or in vitro selection- elimination of pathogens esp. viruses- gene transfer (eg via Agrobacterium, microprojectiles植物組織培養(yǎng)學(xué)2. Meristem culture- clonal p