醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

1、醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室第一次實(shí)驗(yàn)課內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求實(shí)驗(yàn)內(nèi)容2.實(shí)驗(yàn)室規(guī)則實(shí)驗(yàn)內(nèi)容3.細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察技術(shù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容4.染色標(biāo)本的制備革藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課是該專業(yè)課程的重要組成部分，指導(dǎo)學(xué)生上好實(shí)驗(yàn)課是教學(xué)過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)課的目的是：1. 使學(xué)生加深理解并鞏固理論知識(shí)，學(xué)習(xí)和掌握有關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)，為以后的醫(yī)學(xué)專業(yè)課學(xué)習(xí)打好基礎(chǔ)：2. 在實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)學(xué)生觀察、思考和分析問(wèn)題的能力，主動(dòng)參與實(shí)驗(yàn)的動(dòng)手能力及獨(dú)立工作的能力。訓(xùn)練學(xué)生嚴(yán)格的科學(xué)作風(fēng)、嚴(yán)肅白的科學(xué)態(tài)度和嚴(yán)密的工作方法。3. 培養(yǎng)學(xué)生在集體工作環(huán)境中互幫互讓，團(tuán)結(jié)協(xié)作，

2、共同完成好實(shí)驗(yàn)的精神品德。為了達(dá)到上述目的，提高實(shí)驗(yàn)課的教學(xué)效果，特提出以下要求：1. 實(shí)驗(yàn)課前做好預(yù)習(xí)，明確本次實(shí)驗(yàn)課的內(nèi)容及其原理、方法及注意事項(xiàng)；2. 實(shí)驗(yàn)中要仔細(xì)認(rèn)真，注意分工與協(xié)作，操作實(shí)驗(yàn)要按操作步驟進(jìn)行。學(xué)會(huì)正確操作手法、準(zhǔn)確記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。示教實(shí)驗(yàn)要注意觀察，并記錄好相關(guān)內(nèi)容；3. 詳細(xì)討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提倡同學(xué)之間互幫互學(xué)，并緊密聯(lián)系理論課內(nèi)容。要注意不論實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論符合與否，都有討論的價(jià)值，并分析其原因，有可能的話還應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)；4. 嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室規(guī)則，在微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課上，要樹(shù)立“有菌觀點(diǎn)”，嚴(yán)格掌握和不斷完善無(wú)菌 操作技術(shù)。實(shí)驗(yàn)室規(guī)則一、進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室須穿工作服、戴工作帽。除必要

3、的書(shū)籍文具外，其它個(gè)人物品一律不得帶入實(shí)驗(yàn) 室。二、在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，禁止飲食、吸煙及與學(xué)習(xí)無(wú)關(guān)的其它活動(dòng)，不得大聲喧嘩或嘻戲。三、未經(jīng)老師許可，不得擅自搬動(dòng)實(shí)驗(yàn)器材及示教物品，不準(zhǔn)隨意擺弄和旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)儀器上的開(kāi)關(guān) 及旋扭等。四、按照實(shí)驗(yàn)要求，在老師的指導(dǎo)下，主動(dòng)安排要進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，認(rèn)真進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，嚴(yán)格遵守?zé)o 菌操作規(guī)程，爭(zhēng)取順利地完成實(shí)驗(yàn)。五、實(shí)驗(yàn)中使用完畢的器材和試劑，必須放回規(guī)定的位置。廢棄物必須按規(guī)定進(jìn)行處理或歸放于 指定的容器內(nèi)，不能隨便亂丟亂放。六、實(shí)驗(yàn)中萬(wàn)一有菌液打翻、有菌材料污染桌面或衣物、割破手指等意外情況，應(yīng)及時(shí)報(bào)告老師 進(jìn)行處理，切勿自作主張不按規(guī)定處理。七、愛(ài)護(hù)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)一切設(shè)備

4、、掛圖、儀器。注意節(jié)約使用消耗材料及藥品試劑，注意用電安全及 節(jié)約水電。八、實(shí)驗(yàn)結(jié)束，要清理桌面，將實(shí)驗(yàn)器材放回原處。值日同學(xué)要搞好實(shí)驗(yàn)室的清潔衛(wèi)生，保持室 內(nèi)整齊，離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室前要關(guān)好門(mén)窗、水、電，并將手洗干凈。九、未經(jīng)許可，不得將實(shí)驗(yàn)室內(nèi)任何物品帶出實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)一 細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察技術(shù)將細(xì)菌培養(yǎng)物或含菌標(biāo)本材料制備的染色標(biāo)本片，置顯微鏡油鏡頭下，可以觀察到細(xì)菌的形 狀、大小、結(jié)構(gòu)、排列及染色特性等，了解這些特征有助于鑒別各種細(xì)菌。一、顯微鏡油鏡頭的使用與保護(hù)【使用原理】用油鏡觀察標(biāo)本、是在使用高倍鏡的基礎(chǔ)上，采用同玻璃折光率相似的油狀物（如香柏油、液 體石臘等），滴加在標(biāo)本與油鏡頭中間，以避免

5、光線散射，提高顯微鏡的清晰度和分辨能力。使觀察 物象更加清楚明了?！静僮鞣椒ā? .調(diào)試：打開(kāi)電源，先采用低倍鏡，使視野達(dá)到清晰光亮。2 .加油：雙手向上轉(zhuǎn)動(dòng)粗螺旋，使鏡筒上升，將標(biāo)本片固定于載物臺(tái)上，使染色面對(duì)準(zhǔn)集光器 央，加鏡油于標(biāo)本面，調(diào)換油鏡頭對(duì)準(zhǔn)標(biāo)本面。3 .調(diào)焦點(diǎn)：用左手向下輕轉(zhuǎn)粗螺旋，使鏡筒下降，同時(shí)眼睛從右側(cè)觀察下降程度，待鏡頭入油 后接觸上玻片，用眼觀目鏡，反轉(zhuǎn)粗螺旋，使鏡筒慢慢上升，待看到模糊物象時(shí)，改用細(xì)螺旋上下調(diào) 節(jié)，使物像達(dá)到完全清晰為宜（一般轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)節(jié)前后半圈）。4 .觀察：觀察時(shí)只使用細(xì)調(diào)。需改換視野時(shí)，右手操縱推進(jìn)器，左手轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)螺旋，做到配合自 如。并養(yǎng)成左眼觀

6、察，右眼繪圖的習(xí)慣?！居顽R頭的保護(hù)】油鏡頭使用完結(jié)后，必須用擦鏡紙滴加少量二甲苯將油擦洗干凈（二甲苯用量宜少，以免鏡片 間粘膠溶解）。下降集光器，半接物鏡轉(zhuǎn)成“八”字，再下降鏡筒，輕觸鏡臺(tái)表面，雙手平持顯微放 入鏡箱，避免直射日光，置于干燥處，以防受潮?！咀⒁馐马?xiàng)】1 .使用直筒顯微鏡觀察標(biāo)本時(shí)，必須兩眼同時(shí)睜開(kāi)，訓(xùn)練使用左眼觀察，右眼繪圖。如用油鏡 頭觀察，勿將鏡身歪斜，避免鏡油流出片面。2 .觀察染色標(biāo)本時(shí)，光線宜強(qiáng)，可上升集光器，開(kāi)大光圈。觀察不染色標(biāo)本時(shí)，光源宜弱，可 下降集光器，縮小光圈。3 .使用完畢，一定擦去鏡油。二、細(xì)菌不染色標(biāo)本不染色的細(xì)菌和標(biāo)本鏡檢，雖可觀察細(xì)菌在自然生活狀

7、態(tài)下的大小、形態(tài)、活動(dòng)等，但主要用 于觀察細(xì)菌的動(dòng)力。（一）懸滴法【材料】1 .細(xì)菌：枯草桿菌812小時(shí)肉湯培養(yǎng)物。2 .凹玻片，蓋玻片，凡士林等?！痉椒ā?. 取凹玻片一張，于凹窩周圍涂少許凡士林（見(jiàn)圖 1）。1 懸滴法2. 用接種環(huán)沾取枯草桿菌812小時(shí)培養(yǎng)物，置于蓋玻片中央。3. 反轉(zhuǎn)凹玻片，使凹窩對(duì)準(zhǔn)蓋玻片中央，蓋于其上，輕壓后，迅速翻轉(zhuǎn)玻片，使蓋破片面向上。4. 標(biāo)本片置于顯微鏡載物臺(tái)上，先用弱光線，低倍鏡找物象，再改換高倍鏡觀察，密切注意，勿壓破蓋玻片。5. 觀察：細(xì)菌在鏡下為灰色半透明體，并呈現(xiàn)真運(yùn)動(dòng)，如在明亮的海洋中，深入淺出游來(lái)動(dòng)去。（二）壓滴法用途同懸滴法。【材料】1. 細(xì)

8、菌：枯草桿菌812小時(shí)肉湯培養(yǎng)物。2. 載物玻片：蓋玻片等?！痉椒ā?. 取無(wú)油污物玻片1張。2. 用接種環(huán)沾取枯草桿菌812小時(shí)肉湯培養(yǎng)物置于載物玻片中央。3. 加蓋玻片于菌液表面，觀察方法同懸滴法。三、細(xì)菌染色標(biāo)本片的制備（操作）由于細(xì)菌個(gè)體微小，基本上無(wú)色透明，故將其用適當(dāng)染料染色觀察，方能顯示它的形態(tài)、大小、構(gòu)造及染色特性等，在細(xì)菌和鑒別上有重要意義。【材料】1. 葡萄球菌大腸桿菌1824小時(shí)普通瓊脂斜面培養(yǎng)物。2. 革蘭染色液。3. 生理鹽水，載物玻片，接種環(huán)等?！痉椒ā浚ㄒ唬┘?xì)菌涂片的制作1. 涂片：取清潔無(wú)油污載物玻片一張，接種環(huán)沾取生理鹽水12環(huán)置于玻片中央，再將接種環(huán)火焰滅菌

9、待冷后，沾取葡萄球菌或大腸桿菌菌苔少許，混于生理鹽水中，輕輕涂成均勻薄膜。2. 干燥：室溫自然干燥，也可將涂面向上，遠(yuǎn)離火焰上方微加溫干燥（切勿加熱過(guò)度，以防將標(biāo)本燒枯）。3. 固定：標(biāo)本干燥后，通過(guò)酒精燈火焰三次（約23秒鐘），以殺死細(xì)菌并使之固定于玻片上。4. 染色：可根據(jù)不同的染色要求，用相應(yīng)染色液進(jìn)行染色。（二）革蘭染色法：涂片的制備方法同前，革蘭染色方法可分為四步。1. 初染：于涂抹面上滴加結(jié)晶紫染液數(shù)滴，覆蓋整個(gè)涂面，室溫作用一分鐘。用自來(lái)水輕輕沖洗，甩干水分。2. 媒染：滴加魯戈碘液，室溫作用一分鐘，自來(lái)水沖洗，甩干水分。3. 脫色：將載物玻片浸于95%酒精缸中，上下提取，邊提邊

10、看，見(jiàn)涂面無(wú)色素下流為止（約30秒 鐘）。自來(lái)水沖洗，甩干水分。4. 復(fù)染：加稀釋復(fù)紅染液染30秒鐘，自來(lái)水沖洗，吸水紙吸干玻片水分。5. 加油鏡檢：染色片待干后，于油鏡下，調(diào)強(qiáng)光視野觀察，呈紫色的為革蘭陽(yáng)性菌，呈紅色的為革蘭陰性菌。（三）美蘭染色法【方法】將涂片固定滴加美蘭染液于玻片上，染12分鐘，水洗、待干、鏡檢。【結(jié)果】此法為單染色法，菌體和細(xì)胞均染成藍(lán)色。常用于腦膜炎球菌及白喉?xiàng)U菌等細(xì)菌染色。四、細(xì)菌基本形態(tài)和特殊結(jié)構(gòu)觀察（一）基本形態(tài)（示教）1 .球形：葡萄球菌革蘭染色標(biāo)本片一一菌體正因形，染成蘭紫色，呈現(xiàn)葡萄用狀排列。G+球菌。2 .桿形：大腸桿菌革蘭染色標(biāo)本片一一菌體短桿狀，染成

11、紅色，呈分散排列。G-桿菌。3 .球形：霍亂弧菌革蘭染色標(biāo)本片一一菌體弧形，染成紅色，呈分散排列。G-弧菌。（二）特殊結(jié)構(gòu)示教1. 鞭毛：傷寒桿菌鞭毛染色片桿桿菌體較粗大桿狀，染成蘭灰色，單個(gè)或成堆存在，周圍可見(jiàn)到波浪狀彎曲、較長(zhǎng)、呈蘭灰色的鞭毛。2. 莢膜：肺炎雙球菌莢膜染色片桿桿視野背景為紅色，其中可見(jiàn)到染色呈深紅色，矛頭狀菌體，縱向成雙排列，菌體周圍有未染上顏色的空白區(qū)，即莢膜。3. 芽胞：破傷風(fēng)梭菌芽胞染色片桿桿菌體為細(xì)長(zhǎng)桿狀，頂端有染成紅色、并大于菌體的球狀物即芽胞，呈“鼓槌狀”，其他散亂分布的紅色球體，為菌體脫落的成熟芽胞。附錄革蘭（Gram）染液的配制1. 結(jié)晶紫染液將 1 份結(jié)

12、晶紫酒精飽和液與4份 1%草酸銨水溶液混合即成（14克結(jié)晶紫加95%酒精100毫升即為酒精飽和溶液）。2. 魯戈（Lugol）碘液碘 1克 碘化鉀2克蒸餾水300毫升3. 稀釋復(fù)紅液1份鹼性復(fù)紅飽和液（鹼性復(fù)紅3.2克溶于95%酒精100毫升中。即為鹼性復(fù)紅飽和溶液）加9份 5%石炭酸水溶液，先配成石炭酸復(fù)紅染液（抗酸染色用），取1份石炭酸復(fù)紅染液加9份蒸餾水即為稀釋復(fù)紅染液。第二次實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1； 細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)（操作）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容2； 細(xì)菌的生化反應(yīng)檢測(cè)（示教）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容3：播放錄象桿細(xì)菌感染的檢查方法和防治原則實(shí)驗(yàn)二 細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)給細(xì)菌提供適宜的條件，細(xì)菌即可以生長(zhǎng)繁殖，形成具有一定特征的培養(yǎng)物

13、，學(xué)習(xí)細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)可以純化細(xì)菌，了解細(xì)菌的生長(zhǎng)特征，并能進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)菌生化反應(yīng)、變異性，制備細(xì)菌抗原，深入進(jìn)行分子生物學(xué)工作等。了解細(xì)菌的培養(yǎng)特征也有助于鑒別細(xì)菌。細(xì)菌培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基是用人工方法將適合細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的各種營(yíng)養(yǎng)物配制而成的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，以供細(xì)菌培養(yǎng)使用。一般培養(yǎng)基的主要成份為蛋白質(zhì)、糖類、鹽類、水分等。另外還有一些營(yíng)養(yǎng)要求較高的細(xì)菌，還必須加入血液或血清、雞蛋、維生素等其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。有時(shí)為了鑒別或抑制某些細(xì)菌，則可加入各種專用基質(zhì)（如某種糖類、氨基酸等），指示劑，染料等。由于對(duì)培養(yǎng)基的使用目的不同，故在培養(yǎng)基的選擇上有所不同。按其物理性質(zhì)可分為液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基。

14、按其成分和用途可分為普通培養(yǎng)基，鑒別培養(yǎng)基，選擇培養(yǎng)基和專用培養(yǎng)基等。培養(yǎng)基需加入小試管、中試管、三角 瓶、平皿等內(nèi)使用。培養(yǎng)基的種類很多，但一般制備原則有三條：1. 足夠和適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)成份。籍以滿足細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的要求，獲得典型細(xì)菌培養(yǎng)物，達(dá)到研究細(xì)菌 的形態(tài)，生化反應(yīng)，抗原結(jié)構(gòu)及致病力等方面的目的。2. 合適的酸儉度。培養(yǎng)基的酸儉度直接影響細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。一般細(xì)菌最合適PH為7.27.6。測(cè)定的方法常用普通比色法或精密PH試紙來(lái)測(cè)定（見(jiàn)附錄）。3. 絕對(duì)無(wú)菌。培養(yǎng)基務(wù)必進(jìn)行除菌處理，由于培養(yǎng)基所含成份不同，除菌的方法也不同。如普通培養(yǎng)基常用高壓蒸氣滅菌法。一、常用培養(yǎng)基的制備（一）普通肉湯培養(yǎng)

15、基【材料】1 . 新鮮牛肉或牛肉膏，蛋白胨，氯化鈉，瓊脂，蒸餾水。2 .酚紅指標(biāo)劑，比色架及標(biāo)準(zhǔn)比色管或精密 PH試紙。3. 漏斗，量筒，三角燒瓶，試管等?！痉椒ā?. 稱取去脂去腱絞碎的鮮牛肉500克，浸于1000毫升蒸餾水中，冰箱過(guò)夜，次日煮沸30分鐘，紗布過(guò)濾，蒸餾水補(bǔ)足其量，（也可用牛肉膏3克加蒸餾水1000毫升加熱溶化），即為肉浸液。2. 取肉浸液1000毫，氯化鈉5克，蛋白胨10克混合加熱溶化。3. 調(diào)整PH為7.6,用濾紙過(guò)濾分裝于中試管或三角燒瓶?jī)?nèi)，塞緊棉塞?！居猛尽抗┗A(chǔ)培養(yǎng)基用，營(yíng)養(yǎng)比肉膏湯好，一般營(yíng)養(yǎng)要求不高的菌均可生長(zhǎng)。（二）普通瓊脂培養(yǎng)基瓊脂是石花菜等海藻類提取的膠體

16、物質(zhì)，其化學(xué)成份主要是多糖。當(dāng)溫度達(dá)到98以上可溶解于水，45以下則凝固。瓊脂對(duì)細(xì)菌一般無(wú)營(yíng)養(yǎng)作用（除自然界中極少數(shù)菌可利用瓊脂之外），純屬賦形劑。便于人們制做斜面、平板、高層等不同類型的固體培養(yǎng)基?！静牧吓c方法】普通肉湯培養(yǎng)基100毫升，加入瓊脂23克，加熱溶化，用蒸儲(chǔ)水補(bǔ)足失去水分，調(diào)整PH為7.6后分裝中試管、平皿等器皿，高壓蒸氣15磅滅菌20分鐘，可制成普通瓊脂斜面和普通瓊脂平板?！居猛尽抗┮话慵?xì)菌培養(yǎng)用，并可作無(wú)糖基培養(yǎng)基。（三）半固體培養(yǎng)基【材料與方法】取普通肉湯培養(yǎng)基100毫升，加入瓊脂0.5。.沈，加熱溶化。調(diào)整PH為7.6,分裝于小試管內(nèi)，每 管15毫升，高壓蒸氣磅滅菌20分

17、鐘，待冷后放入4 c冰箱備用。【用途】保存一般菌種用，并可觀察細(xì)菌的動(dòng)力及生化反應(yīng)。（四）血液瓊脂培養(yǎng)基【材料與方法】將高壓滅菌后普通瓊脂培養(yǎng)基。冷至 45 C50 c時(shí)以無(wú)菌手續(xù)操作加入5%10%血液（人或動(dòng)物脫 纖維無(wú)菌血液）?？芍瞥裳桨搴脱泵妗！居猛尽抗I(yíng)養(yǎng)要求較高的細(xì)菌分離培養(yǎng)用，亦可觀察細(xì)菌的溶血特征。二、細(xì)菌接種技術(shù)及生長(zhǎng)表現(xiàn)由于細(xì)菌感染而致病的各種標(biāo)本及帶菌者所需檢查的各種標(biāo)本，往往并非單一的細(xì)菌，而混有其 它非致病菌（人體正常菌群）。因此當(dāng)對(duì)此標(biāo)本須作出細(xì)菌鑒定時(shí)，就必須從標(biāo)本中分離出致病菌， 稱為細(xì)菌分離培養(yǎng)技術(shù)。另外，對(duì)已得到可疑病菌進(jìn)行細(xì)菌鑒定及菌種保存等培養(yǎng)，稱為純

18、培養(yǎng)接種技術(shù)。（一）平板劃線接種法（又稱分離培養(yǎng)法）平板分離劃線的方法較多，其中以分區(qū)劃線法與曲線劃線法較為常用。其目的都要使細(xì)菌呈現(xiàn)單 個(gè)菌落生長(zhǎng)，便于同雜菌菌落鑒別。現(xiàn)只介紹分區(qū)劃線法?！静牧稀? .細(xì)菌：大腸桿菌、葡萄球菌1824小時(shí)普通瓊脂斜面培養(yǎng)物。2 .培養(yǎng)基：普通瓊脂平板。3 .酒精燈，接種環(huán)等?！痉椒ā? .右手持接種環(huán)，經(jīng)火焰滅菌，待涼后，挑取大腸桿菌（或葡萄球菌）培養(yǎng)物少許。2 .左手斜持瓊脂平板，皿蓋留在桌上，于火焰近處將菌涂于瓊脂平板上端，來(lái)回劃線，涂成薄膜（約占平板總表面積的1/10）,劃線時(shí)接種環(huán)與平板表面成 3040o角，輕輕接觸，以腕力在平板表面 行輕快地滑移動(dòng)

19、作，接種環(huán)不應(yīng)劃破培養(yǎng)基表面。3 .燒灼接種環(huán)，殺滅環(huán)上殘留細(xì)菌，待冷（是否冷卻，可先在培養(yǎng)基邊緣處試觸，若瓊脂溶化， 表示未涼，稍等再試），從薄膜處取菌作連續(xù)平行劃線（見(jiàn)圖 3）,約占平板表面1/5左右，再次燒灼 接種環(huán)，等三次平行劃線以同樣方法作第四次，第五次劃線，將平板表面劃完。底面向上，用端孳明4.劃線完畢,別等，置37c孵育培養(yǎng)24小時(shí)后觀察2果（見(jiàn)圖4）。,嘉|明典瀛驗(yàn)號(hào)碼，接種者班級(jí)，姓名，組（二）純培養(yǎng)細(xì)菌接種法1.斜面培養(yǎng)基接種法：用于培養(yǎng)，保存菌種及其它實(shí)驗(yàn)用【材料】（ 1）大腸桿菌，葡萄球菌1824小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。（ 2）普通瓊脂斜面培養(yǎng)基。（ 3）接種環(huán)，接種針，酒

20、精燈等?！痉椒ā浚?1）取一支斜面培養(yǎng)基及一支純菌種管，并排傾斜放在左手四指中拇指壓住并以手掌支住兩試管底部。右手將白金環(huán)于火焰上滅菌、冷卻。并拔起兩試管的棉塞。（勿放置桌上，如棉塞太緊時(shí)應(yīng)預(yù)先松動(dòng)）。（ 2）試管口部于火焰上往返通過(guò)23次滅菌，將滅菌白金環(huán)伸入有菌試管中，取少量細(xì)菌（一般應(yīng)從斜面底部沾?。缓笮⌒囊浦翜?zhǔn)備接種的試管中。（ 3）接種方法是自管底向上連續(xù)平劃線，若以保存菌為目的時(shí)可自管底上劃一粗直線即可。（ 4）取出接種環(huán)，將試管上部再經(jīng)火焰滅菌，塞好棉塞，接種環(huán)滅菌后放回原處。（ 5）若自平皿培養(yǎng)物中取菌時(shí)，只應(yīng)沾取一個(gè)單個(gè)菌落。（ 6）接種菌應(yīng)作好標(biāo)記，標(biāo)明菌種名稱，日期等

21、，置37溫箱中培養(yǎng)，次日觀察結(jié)果。2. 液體培養(yǎng)基接種法：用于增菌及鑒定細(xì)菌生長(zhǎng)特點(diǎn)，如表面生長(zhǎng)，沉淀生長(zhǎng)，均勻混濁生長(zhǎng)等?！静牧吓c方法】操作技術(shù)基本與上法相同，只是接種時(shí)應(yīng)將沾菌之接種環(huán)沿接近液體表面之管內(nèi)壁輕輕摩擦（勿用力振蕩）使細(xì)菌混入培養(yǎng)基內(nèi)，置37溫箱中培養(yǎng)，次日觀察結(jié)果。3. 半固體培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)法用于保存菌種及間接觀察細(xì)菌之動(dòng)力（無(wú)動(dòng)力之細(xì)菌僅沿穿刺線生長(zhǎng)，清晰可見(jiàn)；有動(dòng)力的細(xì)菌使培養(yǎng)基呈現(xiàn)混濁樣，穿刺線甚至難以看出）。用無(wú)菌操作技術(shù)，滅菌穿刺針沾取細(xì)菌后，垂直刺入半固體培養(yǎng)基中央直達(dá)近管底處，再沿原穿刺線抽出即可，置37溫箱培養(yǎng)，次日觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 2； 實(shí)驗(yàn)三細(xì)菌的生化反

22、應(yīng)檢測(cè)（示教）不同細(xì)菌由于所含的酶系統(tǒng)不完全相同，因而對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解能力及代謝產(chǎn)物亦不一致，據(jù)此，可用以鑒別細(xì)菌的種類。一、單糖發(fā)酵試驗(yàn)【原理】單糖發(fā)酵是將葡萄糖，乳糖或麥芽糖等分別加入蛋白胨水培養(yǎng)基內(nèi)，使其最終濃度為0.751。并加入一定量酚紅指示劑及小倒管，制成單糖發(fā)酵管，接種細(xì)菌經(jīng)37培養(yǎng)1824小時(shí)，若能分解糖產(chǎn)酸則酚紅指示劑由紅變黃，若能分解甲酸有C02和H2等氣體形成，小倒管內(nèi)則聚集有氣泡；不分解，則指示劑不變色。【材料】1菌種：大腸桿菌，傷寒桿菌1824小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。2培養(yǎng)基：葡萄糖發(fā)酵管，乳糖發(fā)酵管等。【方法】1將傷寒桿菌，大腸桿菌按照液體接種方法分別接種于葡萄糖及乳糖

23、發(fā)酵管內(nèi)。2 .置37c孵箱培養(yǎng)1824小時(shí)。3 .觀察結(jié)果：由于一些細(xì)菌能分解某種糖類產(chǎn)酸，所以培養(yǎng)基中PH下降到7.0以下，在酚紅指示劑的顯示下，培養(yǎng)基顏色由紅變黃。產(chǎn)酸者以“+”表示，如果同時(shí)產(chǎn)生氣體，則培養(yǎng)基中小倒管內(nèi)有氣泡出現(xiàn)，此乃產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，以“”表示，不分解，則指示劑不變色，用“ -”表示?！窘Y(jié)果】傷寒桿菌葡錮糖+乳糖-二、V-P（Voges-Proskauer跟驗(yàn)【原理】有些細(xì)菌如產(chǎn)氣桿菌，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸脫竣，生成乙酰甲基甲醇，在堿性環(huán)境中 被氧化為二乙酰，再與培養(yǎng)基內(nèi)月瓜基結(jié)合，生成紅色化合物，V P試驗(yàn)陽(yáng)性?！静牧稀? .菌種：大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌1824小時(shí)瓊

24、脂斜面培養(yǎng)物。2 .培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白陳水培養(yǎng)基。3 .試劑：V-P試劑40 %氫氧化鉀水溶液（內(nèi)含0.3%肌酸）和6% a-奈酚酒精溶液。 【方法】1 .分別接種大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌于兩支葡萄糖蛋白陳水中。2 .置37c培養(yǎng)48小時(shí)后，取出分別加入 KOHIml和a -奈酚溶液1ml ,搖勻，靜置試管架上515分 鐘。3 .觀察結(jié)果：培養(yǎng)液變?yōu)榧t色為陽(yáng)性，不變色為陰性?！窘Y(jié)果】大腸桿菌：-;產(chǎn)氣桿菌：+三、甲基紅（M、R）試驗(yàn)【原理】某些細(xì)菌如大腸桿菌等分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，繼而分解為甲酸、乙酸、乳酸等，使培養(yǎng)基PH值降至4.5以下，加入甲基紅指示劑呈紅色，此為陽(yáng)性反應(yīng)；若產(chǎn)酸量少或產(chǎn)生的酸進(jìn)

25、一步轉(zhuǎn)化為醇、 醛、氣體和水等，則培養(yǎng)基的酸堿度仍在 PH 6.2以上，加入甲基紅指示劑呈現(xiàn)黃色，為陰性反應(yīng)?！静牧稀? .菌種：大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌1824小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。2 .培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白陳水培養(yǎng)基。3 .試劑：甲基紅試劑?！痉椒ā? .分別將大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌接種于兩支葡萄糖蛋白陳水培養(yǎng)基中。2 .置37c培養(yǎng)23天取出，分別滴加甲基紅試劑23滴，混勻，觀察結(jié)果?！窘Y(jié)果】大腸桿菌：+,產(chǎn)氣桿菌：-。四、枸檬酸鹽利用試驗(yàn)【原理】枸櫞酸鹽培養(yǎng)基系一綜合性培養(yǎng)基，其中枸櫞酸鈉為唯一碳源，磷酸二氫銨為唯一氮源。一般細(xì)菌能利用磷酸二氫銨作為氮源，但不一定能分解枸櫞酸鹽取得碳源。因此，根據(jù)可

26、否利用枸櫞酸鹽來(lái)鑒別細(xì)菌，如產(chǎn)氣桿菌可利用枸櫞鹽作為碳源，細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖，形成菌苔，分解枸櫞酸鹽生成堿性碳酸鹽，使培養(yǎng)基PH上升到7.0以上，由綠色變?yōu)樯钐m色，為枸檬酸鹽利用試驗(yàn)陽(yáng)性；而大腸桿菌則不能分解枸櫞酸鹽，得不到碳源，不能生長(zhǎng)，無(wú)菌苔形成，培養(yǎng)基顏色不發(fā)生變化，為枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)陰性?！静牧稀?. 菌種：大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌1824小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。2. 培養(yǎng)基：枸櫞酸鹽斜面。枸檬酸鹽斜面?！痉椒ā?. 分別將大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌接種于兩支枸櫞酸鹽斜面培養(yǎng)基。2. 置 37恒溫培養(yǎng)24小時(shí)后觀察結(jié)果?！窘Y(jié)果】產(chǎn)氣桿菌：+（有菌苔生長(zhǎng)，培養(yǎng)基變色）大腸桿菌：-（無(wú)菌苔生長(zhǎng)，培養(yǎng)基不變色）五、

27、靛基質(zhì)（Indol ）試驗(yàn)【原理】某些細(xì)菌如大腸桿菌，變形桿菌等具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水培養(yǎng)基中的色氨酸，產(chǎn)生靛基質(zhì)（無(wú)色吲哚），再與歐立希試劑（對(duì)二甲基氨基苯甲醛）反應(yīng)，形成紅色化合物玫瑰吲哚，即為 陽(yáng)性反應(yīng)。【材料】1. 菌種：大腸桿菌，傷寒桿菌1824小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。2. 培養(yǎng)基：蛋白胨水培養(yǎng)基。3. 試劑，歐立希（Ehrlich）試劑（對(duì)二甲基氨基苯甲醛）【方法】1. 分別將大腸桿菌，傷寒桿菌接種于兩支蛋白胨水培養(yǎng)基中。2.置37c培養(yǎng)23天后，每管沿管壁各加歐立希試劑 0.51ml于培養(yǎng)液面上，待1-2分鐘后觀察結(jié) 果：在交界面出現(xiàn)玫瑰紅色環(huán)即為吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性，無(wú)紅色環(huán)即為陰性

28、。【結(jié)果】大腸桿菌：+ ；傷寒桿菌：- 。六、硫化氫（H2S）產(chǎn)生試驗(yàn)【原理】某些細(xì)菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸），生成硫化氫。硫化氫遇到培養(yǎng)基中的鉛鹽（醋酸鉛）或鐵鹽（硫酸亞鐵），則形成黑褐色硫化鉛或硫化亞鐵沉淀物。培養(yǎng)基內(nèi)含有還原劑硫代硫酸鈉，使形成的硫化氫不再氧化?！静牧稀?. 菌種：大腸桿菌，傷塞桿菌1824小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。2. 培養(yǎng)基：醋酸鉛培養(yǎng)基。【方法】1. 分別以半固體穿刺接種法將大腸桿菌，傷寒桿菌穿刺接種地兩支醋酸鉛培養(yǎng)基內(nèi)。2. 置 37培養(yǎng)48-72小時(shí)（2-3天）。3. 觀察結(jié)果：取出后對(duì)光觀察 ，若沿 穿刺線有黑 褐色沉 淀物，即表示該菌能產(chǎn)生

29、硫化氫（H2S）,否則反之。【結(jié)果】大腸桿菌：-（無(wú)黑色沉淀線生成）傷寒桿菌：+（有黑色沉淀線生成）七、尿素分解試驗(yàn)【原理】某些細(xì)菌如變形桿菌，具有尿素分解酶，能分解尿素而產(chǎn)生氨，氨溶于水變成氫氧化銨，使培養(yǎng)基變堿而呈紅色即為陽(yáng)性?！静牧稀?. 菌種：變形桿菌，傷寒桿菌18-24小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。2. 培養(yǎng)基：尿素培養(yǎng)基。【方法】1. 分別以斜面接種法將變形桿菌，傷寒桿菌接種于兩支尿素斜面培養(yǎng)基上。2. 置 37培養(yǎng)18-24小時(shí)。3. 取出觀察結(jié)果，培養(yǎng)基變?yōu)榧t色，即尿素分解試驗(yàn)陽(yáng)性，若不變色，即為尿素分解試驗(yàn)陰性?！窘Y(jié)果】變形桿菌：+ ；傷寒桿菌：- 。八、氧化酶試驗(yàn)【原理】某些細(xì)菌如奈

30、瑟菌和綠膿桿菌，具有氧化酶（靛基酚氧化酶），能將氧化酶試劑（鹽酸二甲基對(duì)苯二胺或四甲基對(duì)苯二胺）氧化成紅色的醌類化合物，即為氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性。【材料】1. 菌種：淋球菌或腦膜炎球菌，白色葡萄球菌18-24小時(shí)巧克力斜面培養(yǎng)物。2. 培養(yǎng)基：巧克力平板。3. 試劑： 0.5-1%鹽酸對(duì)二甲基苯胺（或鹽酸二甲基對(duì)苯二胺或鹽酸對(duì)氨基二甲苯胺）水溶液?！痉椒ā?. 將腦膜炎球菌或淋球菌，白色葡萄球菌分別接種于巧克力平板；2. 置 37培養(yǎng)24小時(shí)后取出；3. 滴加新鮮配制的0.5-1%鹽酸對(duì)二甲基苯胺水溶液于固體培養(yǎng)基上；4. 觀察結(jié)果：加試劑后，若菌落出現(xiàn)紅色-深紅色-紫黑色變化均為陽(yáng)性；反之陰性?！?/p>

31、結(jié)果】腦膜炎球菌和淋球菌：+ ；白色葡萄球菌：- ?！咀⒁馐马?xiàng)】1. 此項(xiàng)試驗(yàn)應(yīng)避免含鐵物質(zhì)，因遇鐵會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性。2. 試劑在空氣中易氧化，故應(yīng)新鮮配制。冰箱保存使用不超過(guò)兩周。3. 若要分離培養(yǎng)腦膜炎球菌，應(yīng)在菌落變成紫黑色之前立即轉(zhuǎn)種。否則細(xì)菌容易死亡。附錄1. V-P試驗(yàn)劑的配制甲液：a -蔡酚 6g 95%西精 100ml乙液： KOH 40g 肌酸 0.3g 蒸餾水100ml2甲基紅試劑的配制甲基紅 0.04g 95%酒精60ml 蒸餾水 40ml先使甲基紅溶解于酒精中，再加入蒸餾水，混合，搖勻即成。3.歐立希（Ehrlich）試劑的配制對(duì)位二甲基氨基苯甲醛4g95%酒精380ml濃

32、硫酸或濃鹽酸80ml三種成分混合即成，瓶口要嚴(yán)密，以免揮發(fā)。4蛋白胨水培養(yǎng)基的制備成分：蛋白胨10g 氯化鈉 5g 蒸餾水 1000ml制法：（ 1）先用少量蒸餾水將蛋白胨和氯化鈉相混合溶解,再加足蒸餾水量。（2）調(diào)節(jié)pH至7.6、用濾紙過(guò)濾。（3）分裝中試管，每管約3-4ml,加塞滅菌后備用。用途：供吲哚試驗(yàn)用5單糖發(fā)酵管的制備成分：蛋白胨水培養(yǎng)基100ml0.2%酚紅1ml所需糖（葡萄糖或乳糖）0.75-1g制法：（1）將上述成分溶化，混勻分裝于內(nèi)含有倒置小玻璃管的小試管中，每管約 2ml,加塞,（ 2）小倒管排氣，滅菌（8-10磅，20-30分鐘），貯存?zhèn)溆谩Ｓ猛荆汗﹩翁前l(fā)酵試驗(yàn)用。附注

33、：0.2%酚紅配制法酚紅（phenol red） 0.2g1/10N苛性鈉（NaOH） 8ml蒸餾水92ml將酚紅入研缽徐徐加入苛性鈉研磨，再補(bǔ)足蒸餾水即成。若需長(zhǎng)時(shí)間保存，可高壓滅菌后貯存?zhèn)?葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)物成分：蛋白胨5g 葡萄糖 5g制法：（ 1）將上述成分溶解于蒸餾水中。（2）調(diào)節(jié)pH至7.6,用濾紙過(guò)濾除渣。（3）分裝中試管，每管約3-4ml,滅菌后備用。用途：供甲基紅及V-P試驗(yàn)用。7枸櫞酸鹽斜面培養(yǎng)基的制備成分：磷酸二氫銨0.1g 磷酸氫二鉀0.1g硫酸鎂0.02g枸櫞酸鈉0.23g氯化鈉0.5g瓊脂 2g蒸餾水 100ml 0.5%溴麝香草酚藍(lán)酒精溶液2ml制法：（ 1）先

34、將上述各種鹽類溶解于蒸餾水中，使其完全溶解。（2）矯正pH至6.8,然后加入瓊脂和指標(biāo)劑。（ 3）搖勻，脫脂棉過(guò)濾，分裝中試管，每管約3-5ml。（ 4）滅菌后置成斜面?zhèn)溆茫ɡ浜鬄榫G色）用途：供枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)用。8醋酸鉛培養(yǎng)基的制備成分：2%肉湯瓊脂200ml 硫代硫酸鈉0.05g醋酸鉛 10g 蒸餾水 100ml制法：（1）先將10g醋酸鉛加入100ml蒸儲(chǔ)水中融化，間歇滅菌或低壓菌后備用（10%醋酸鉛溶液）。（2）力口熱溶化2%肉湯瓊脂200ml,加入硫代硫酸鈉0.05g,混合后高壓滅菌。（ 3）從高壓滅菌鍋取出，待冷卻至45左右時(shí)。無(wú)菌操作加入無(wú)菌的10%醋酸鉛溶液1毫升，搖勻。（4）

35、分裝小試管，每管約2ml,直立待冷凝后備用。用途：供硫代氫生成試驗(yàn)用。說(shuō)明：醋酸鉛與硫代硫酸鈉不宜久然。9尿素培養(yǎng)基的制備成分： 蛋白胨 1g 氯化鈉 5g葡萄糖 1g 蒸餾水 900ml瓊脂 1520g 0.1%酚紅12ml20%尿素水溶液（無(wú)菌）100ml制法：（1）除尿素、瓊脂和酚紅外，其余成分溶于水中，加熱溶化，矯正pH至6.86.9。（ 2）加入瓊脂和酚紅，810磅 10分鐘滅菌。（ 3）冷卻至60后加入無(wú)菌尿素溶液，搖勻。（4）分裝中試管（無(wú)菌），每管34ml,置成斜面?zhèn)溆?。用途：供尿素分解試?yàn)用。說(shuō)明：（1）尿素不耐熱，也不能久存，只能用濾器除菌。（2）無(wú)菌尿素溶液制備：稱取尿素

36、 20g,混合于100ml蒸儲(chǔ)水中，充分搖勻，用 G6濾菌 器過(guò)濾除菌，以達(dá)到無(wú)菌的目的。10巧克力色瓊脂平板的制備成分：肉湯瓊脂100ml 無(wú)菌脫纖維羊或兔血10ml。制法：（ 1）將肉湯瓊脂加熱溶化，趁熱加入脫纖維血，搖勻。（ 2）傾注平板，待冷卻成巧克力色，備用。用途：用于培養(yǎng)腦膜炎雙球菌或淋球菌。說(shuō)明：加血一定要趁熱加。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容3： 播放錄象 細(xì)菌感染的檢查方法和防治原則第三次實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)四 細(xì)菌分布及外界因素對(duì)細(xì)菌影響的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容： 1課堂上全部操作；2次日預(yù)約看結(jié)果一、自然沉降法檢查空氣中的細(xì)菌【材料】普通瓊脂平板。【方法】取普通瓊脂平板一個(gè)，打開(kāi)皿蓋，讓培養(yǎng)基直接暴露于空氣中，置于

37、實(shí)驗(yàn)臺(tái)上或需要測(cè)定的地方 1530分鐘。蓋上皿蓋，用記號(hào)筆或蠟筆注明放置地點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)日期和實(shí)驗(yàn)者班級(jí)、姓名等，放入37溫箱培養(yǎng)1824小時(shí)，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況和數(shù)量。并分析其意義。二、傾注法檢查水中的細(xì)菌【材料與方法】1 .用無(wú)菌吸管吸取勝0.5ml水樣加入肉湯培養(yǎng)基中。2 . 另取一支未接種的肉湯管做對(duì)照，與上管一起置于37溫箱培養(yǎng)1824小時(shí)，觀察結(jié)果?！窘Y(jié)果】對(duì)照管應(yīng)透明清亮，試驗(yàn)管變混濁，說(shuō)明水樣中有活菌存在。并可通過(guò)比濁法估計(jì)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖后的數(shù)量。三、人體體表及各種物品表面的細(xì)菌檢查 拭子法和涂抹法【材料】普通瓊脂平板?！痉椒ā咳∑胀ō傊桨逡粋€(gè)，在平板底面用記號(hào)筆或蠟筆將平板分成若干

38、等份，于每份培養(yǎng)基表面分別用手指、衣物、書(shū)本、筆等輕輕涂抹（不要擦破培養(yǎng)基）。也可用無(wú)菌生理鹽水擦洗衣物等，用無(wú)菌棉拭子涂于培養(yǎng)基表面，蓋上皿蓋,分別標(biāo)記清楚。置37溫箱培養(yǎng)1824小時(shí)觀察結(jié)果。觀察各種物品中細(xì)菌的數(shù)量及類別，并分析其意義。【注意事項(xiàng)】本實(shí)驗(yàn)檢出的除細(xì)菌外，尚可能有真菌、放線菌等，請(qǐng)注意加以區(qū)別。四、人咽喉部位的細(xì)菌檢查【材料】血液瓊脂平板?！痉椒ā?. 咳碟法取血液瓊脂平板一個(gè)，打開(kāi)皿蓋，將培養(yǎng)基面置于口腔前約10厘米處，用力咳嗽數(shù)次（讓飛沫落在培養(yǎng)基表面），然后蓋上皿蓋，注明被檢查者姓名、實(shí)驗(yàn)日期等。置37培養(yǎng)1824小時(shí)觀察結(jié)果。觀察細(xì)菌的數(shù)量、種類等，注意是否有溶血環(huán)，并分析其意義。2. 試子法用無(wú)菌棉簽涂取扁桃腺兩旁的分泌物，在血瓊脂平板表面涂布成線，然后改用接種環(huán)，作分區(qū)劃線接種，置37培養(yǎng)1824小時(shí)觀察結(jié)果。觀察細(xì)菌的數(shù)量、種類等。注意是否有溶血環(huán)，并分析其意義。五、化學(xué)因素對(duì)細(xì)菌的影響（化學(xué)消毒劑的殺菌試驗(yàn)）【材料】1 .菌種：葡萄球菌1824小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。2 .培養(yǎng)基：普通瓊脂平板。3 .化學(xué)消毒劑：5%石炭酸、2%碘酒、70%酒精、0.1%升汞。4 .其他：直徑0.6cm無(wú)菌圓形濾紙片、小銀子、接種環(huán)等?！痉?/p>