農(nóng)桿菌介導(dǎo)的粳稻遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)化體系的建立

1、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的粳稻遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)化體系的建立1：研究的目的和意義秈稻是我國(guó)最大的栽培稻類型，栽培面積約占全國(guó)水稻面積的 741。秈稻離體培養(yǎng)的愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生比較困難，且品種特異性明顯，嚴(yán)重地影響了秈稻轉(zhuǎn)基因工作的開展。篩選適于遺傳轉(zhuǎn)化的秈稻受體品種，建立高效、規(guī)?；亩i稻遺傳轉(zhuǎn)化平臺(tái)，同時(shí)針對(duì)目前基因功能研究及生產(chǎn)上普遍應(yīng)用但較難轉(zhuǎn)化的秈稻基因型，有目的、有針對(duì)性的建立一套轉(zhuǎn)化效率高、重復(fù)性好、簡(jiǎn)單快捷的秈稻轉(zhuǎn)化體系，已成為當(dāng)前秈稻轉(zhuǎn)基因育種及基因功能研究的首要任務(wù)。我國(guó)地域遼闊，海岸線長(zhǎng)，既有大量的濱海鹽堿地，又有內(nèi)陸鹽堿地2，中國(guó)鹽堿土地約為2 000 萬hm2 ，其中江蘇濱海灘涂地約為

2、60 多萬hm2，其中只有少部分改良利用，絕大部分仍未脫鹽及不斷遭受鹽漬危害。在影響農(nóng)作物產(chǎn)量的各種因素中，干旱和鹽堿所造成的減產(chǎn)達(dá)40%3。HALI基因是釀酒酵母中的重要耐鹽因子，其表達(dá)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)離子濃度，盡管HALI基因本身不是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，但在鹽脅迫下能與ENAI基因協(xié)同作用促進(jìn)Na+外排，與其它轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)協(xié)同作用增加K+的吸收，保持細(xì)胞內(nèi)低的Na+/K+比，以減輕Na+毒害，因而在植物耐鹽基因工程上具有很大的潛力，利用HALI基因轉(zhuǎn)化粳稻在提高粳稻耐鹽特性上有重要的理論和實(shí)踐意義4?；蚬こ碳夹g(shù)的使用，一方面，可以將水稻基因中不具有的基因，如抗除草劑、抗病蟲、耐鹽堿、提高水稻品質(zhì)及產(chǎn)量的

3、基因?qū)胨局?，獲得單靠傳統(tǒng)育種方法無法實(shí)現(xiàn)的遺傳重組，豐富水稻種質(zhì)資源，提高育種效率5。另一方面，可以同時(shí)采用傳統(tǒng)育種方法，如回交、轉(zhuǎn)育等方法，來充分利用已獲得的轉(zhuǎn)基因材料，將目的基因?qū)腚y以轉(zhuǎn)化的水稻品種中。本研究通過對(duì)粳稻胚培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)的研究，建立了水稻離體再生技術(shù)體系，為粳稻遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定了基礎(chǔ)。通過對(duì)HALI基因農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化水稻的研究，初步建立了粳稻農(nóng)桿菌介導(dǎo)法基因轉(zhuǎn)化體系，加快了現(xiàn)代生物技術(shù)在育種中的應(yīng)用，提升了粳稻育種和研究水平。通過本研究，以期獲得轉(zhuǎn)HALI基因的轉(zhuǎn)化植株，創(chuàng)造新的耐鹽材料，提高粳稻的耐鹽性。2:國(guó)內(nèi)外研究的動(dòng)態(tài) 目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者普遍重視水稻農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技

4、術(shù)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法已達(dá)到了應(yīng)用的階段,逐步成為水稻轉(zhuǎn)化的主流技術(shù)，國(guó)內(nèi)外不少實(shí)驗(yàn)室己建立了較成熟的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系，這一方法將進(jìn)一步朝著高效規(guī)?；较虬l(fā)展6。2.1：水稻轉(zhuǎn)化受體的研究進(jìn)展基因轉(zhuǎn)化的成功在于建立良好的受體系統(tǒng)。作為轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)應(yīng)具備如下條件：（1)高效穩(wěn)定的再生能力；（2)能接受外源DNA整合，具有較好的遺傳穩(wěn)定性；(3)具有穩(wěn)定的外植體來源；（4)對(duì)選擇性抗生素敏感；（5)對(duì)農(nóng)桿菌侵染的敏感性。目前，用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)有以下幾種：原生質(zhì)體再生系統(tǒng)、愈傷組織載體系統(tǒng)、組織器官再生系統(tǒng)。2.2：水稻轉(zhuǎn)基因方法的研究進(jìn)展基因轉(zhuǎn)化的方法可分為兩類：一類是直接的

5、基因轉(zhuǎn)化，即將裸露的DNA直接轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞或原生質(zhì)體，由此獲得轉(zhuǎn)基因植株的方法。包括基因槍法、原生質(zhì)體法、電激法、PEG法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、花粉管通道法等，其中基因槍法是目前較為常用的方法。另一類是由載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，即利用另一種生物來實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)入和整合，主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和病毒介導(dǎo)兩種轉(zhuǎn)化方法，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法操作簡(jiǎn)便、成本低、轉(zhuǎn)化率高，廣泛用于水稻轉(zhuǎn)基因研究。PEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化是利用高濃度PEG極強(qiáng)的親水性，使DNA大分子沉淀，促進(jìn)水稻原生質(zhì)體和外緣DNA彼此靠攏聚合，因而使水稻原生質(zhì)體直接攝取外緣DNA的方法。人們利用此法已獲得了水稻轉(zhuǎn)基因植株7。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的秈稻遺傳轉(zhuǎn)化研究始于1

6、992年，Chan 等8首次嘗試以秈稻Taichung Native1的幼根為受體材料，得到轉(zhuǎn)化的愈傷組織，經(jīng)Southern 分析和酶活檢測(cè)證明嵌合基因已經(jīng)整合到愈傷組織中，但未獲得再生植株。1994 年，Hiei等9采用“雙超元”載體和向侵染液中添加乙酰丁香酮等改進(jìn)措施建立了粳稻的高頻農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系，帶動(dòng)了秈稻遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的研究。在此基礎(chǔ)上，相繼在Pusa Basmati I、IR 系列品種、孟加拉秈稻種質(zhì)及中國(guó)不同區(qū)域秈稻品種等基因型上獲得成功10。隨后，研究重點(diǎn)從基因型依賴性弱、易轉(zhuǎn)化類型的秈稻品種11轉(zhuǎn)向基因型依賴性強(qiáng)、頑拗型秈稻品種轉(zhuǎn)化體系的建立和優(yōu)化。Hiei 和Komari12

7、將侵染后由一個(gè)幼胚來源的愈傷組織分割成多個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化個(gè)體，大大提高了轉(zhuǎn)化率，并提出了一套適合純秈型IR24、IR64、IR72 的轉(zhuǎn)化程序。之后，他們又根據(jù)同工酶多態(tài)性將秈稻品種分為偏秈型，秈型，和純秈型，提出基于成熟胚和幼胚為起始材料的適宜不同秈稻類型的一套轉(zhuǎn)化技術(shù)流程13，但是，利用這套流程成功的報(bào)道并不多。2.3：抗鹽基因工程研究與進(jìn)展隨著現(xiàn)代生物技術(shù)尤其是轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，耐鹽轉(zhuǎn)基因研究取得了很大的發(fā)展。轉(zhuǎn)基因技術(shù)能夠打破物種間生殖隔離，創(chuàng)造新的資源，加快育種進(jìn)程，為植物育種提供了新的思路和方法，受到研究者們的特別青睞4。鹽脅迫可以誘導(dǎo)許多植物基因的表達(dá)14，根據(jù)這些基因產(chǎn)物的作用，可

8、以分為兩大類15。一類基因的產(chǎn)物為效應(yīng)分子，包括:滲透保護(hù)劑(如甜菜堿、甘露醇、海藻糖及脯氨酸等)的合成酶;維持離子平衡的蛋白質(zhì)(如Na+倪十反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等);參與氧化脅迫保護(hù)、清除活性氧的酶(如超氧化物歧化酶、谷膚甘膚過氧化物酶、谷膚甘膚還原酶和促分裂原活化蛋白激酶等);直接保護(hù)細(xì)胞免受鹽脅迫傷害的功能蛋白(如胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白、伴侶蛋白和水通道蛋白等)。另一類基因的產(chǎn)物為調(diào)控分子，包括調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，如DREB轉(zhuǎn)錄因了、MYB轉(zhuǎn)錄因了、MYC轉(zhuǎn)錄因了及bzIP轉(zhuǎn)錄因子等，以及感受和傳導(dǎo)脅迫信號(hào)的505途徑、鈣神經(jīng)元(CaN)途徑、蛋白激酶等。2.4：關(guān)于HAL1基因HALI基因最

9、早是從釀酒酵母中克隆獲得的與耐鹽相關(guān)的基因?？寺『笮蛄蟹治霰砻?其開放讀碼框全長(zhǎng)879bp，編碼一個(gè)294個(gè)氨基酸的多肽。HAL1基因是通過調(diào)節(jié)陽離子轉(zhuǎn)移系統(tǒng)而使得植物獲得耐鹽性的，過量表達(dá)該基因的酵母轉(zhuǎn)化后可耐高達(dá)150mo/L的NaCI脅迫，而剔除該基因則大大降低酵母的耐鹽性; HALI基因提高酵母的耐鹽性是增加細(xì)胞內(nèi)K+含量，降低細(xì)胞內(nèi)Na+含量，從而調(diào)節(jié)酵母細(xì)胞的K+/Na+比率16。我國(guó)學(xué)者將酵母的HALI基因轉(zhuǎn)入擬南芥中，比較轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株表型無區(qū)別，測(cè)定K+、Na+濃度發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫下含有更少的Na+17。張荃18等通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，獲得HALI基因轉(zhuǎn)化番茄，可使轉(zhuǎn)

10、基因植株的耐鹽性提高。Ruslss等的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了轉(zhuǎn)化HALI基因可以減輕高鹽對(duì)番茄的危害。李淑娟189等研究表明，轉(zhuǎn)基因煙草在生根培養(yǎng)基中的耐鹽能力最高達(dá)到 1.5%NaCI，而對(duì)照植株在生根培養(yǎng)基中的耐鹽能力僅為0.8%NaCI，轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性有了明顯提高。2.5：存在的問題2.5.1：大部分水稻轉(zhuǎn)基因研究處于探索階段雖然國(guó)內(nèi)外轉(zhuǎn)基因植物的研究與產(chǎn)業(yè)化已取得突破性進(jìn)展，但是由于受到技術(shù)發(fā)展的限制，目前植物基因產(chǎn)品應(yīng)用范圍還不是很寬闊。缺乏基因的高效發(fā)掘技術(shù)，實(shí)用分子標(biāo)記較少19。許多重要目標(biāo)性狀基因尚需緊密標(biāo)記，還缺乏品質(zhì)、產(chǎn)量、抗性等協(xié)調(diào)改良的高效育種技術(shù)。加快植物基因工程與植物細(xì)胞

11、工程的整合，并進(jìn)一步完善技術(shù)體系，是我們面臨的新的挑戰(zhàn)20。不但可利用的基因較少，大部分研究處于研究探索性階段，而且可直接利用生產(chǎn)的品種很少，抗逆、品質(zhì)改良、生長(zhǎng)發(fā)育、提高產(chǎn)量等基因工程還有待基礎(chǔ)研究的新突破。2.5.2：轉(zhuǎn)基因水稻安全性的問題轉(zhuǎn)基因水稻具有極大的發(fā)展前景，將可能為我國(guó)的糧食安全保障提供新的機(jī)遇。但是，其商品化、產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵在于生物安全評(píng)估，即其安全性成為公眾關(guān)心的焦點(diǎn)。可能存在的不安全性風(fēng)險(xiǎn)主要有轉(zhuǎn)基因漂移、抗蟲轉(zhuǎn)基因作物對(duì)非靶標(biāo)生物的傷害及對(duì)土壤生物群落的影響、轉(zhuǎn)基因自身雜草化和轉(zhuǎn)基因作物是否有害于消費(fèi)者的健康等21。如何防止轉(zhuǎn)基因作物帶來的潛在風(fēng)險(xiǎn)已成為轉(zhuǎn)基因研究的重要課

12、題，當(dāng)前提高轉(zhuǎn)基因作物生物安全性的主要策略有:標(biāo)記基因的有效去除、外源基因的組織特異性表達(dá)和誘導(dǎo)性表達(dá)、轉(zhuǎn)基因漂移的防止、各種對(duì)人類低毒而對(duì)害蟲高毒性抗蟲基因的開發(fā)等22。3：主要研究?jī)?nèi)容：3.1：篩選劑Kan和Cb的濃度:對(duì)水稻的抗性愈傷的影響。3.2：農(nóng)桿菌不同培養(yǎng)方式對(duì)水稻轉(zhuǎn)化效率的影響。3.3：農(nóng)桿菌的不同濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響。3.4：農(nóng)桿菌的侵染方法對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響。3.5：共培養(yǎng)天數(shù)對(duì)水稻愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的影響。3.6：脫菌后的干燥處理對(duì)水稻愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的影響。4：材料和方法：材料：以水稻成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織作為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的受體材料。試供材料為西南科技大學(xué)植物分子育種實(shí)驗(yàn)室提供

13、的具有良好的培養(yǎng)效果的材料。質(zhì)粒和菌株：向相關(guān)的公司購(gòu)買攜帶HALI基因的植物表達(dá)載體質(zhì)粒為PROKll,選擇標(biāo)記基因?yàn)樾旅顾亓姿徂D(zhuǎn)移酶(NPTll)基因和含目的基因的根癌農(nóng)桿菌工程菌株LBA4404/HALI，向相關(guān)的引物設(shè)計(jì)公司購(gòu)買引物，比如引物系列為：5引物： 5-GGTCTAGAATGGATTTCAAAGATTTAGGATTGCATG-3； BamH13引物: 5-CGGGATCCTTTTTCAACTATTCTGTGTTGATTG-3 KpnI培養(yǎng)基：成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6+2,4-D 2mg/L+6-BA 0.5mg/L+水解酪蛋白0.5g/L+ 蔗糖30g/L+脯氨酸2.8g

14、/L+瓊脂粉 6g/L pH=5.8預(yù)培養(yǎng)基:l/2N6max+l/2N6min+2,4-D 2mg/L+水解酪蛋白0.5g/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉7g/L(pH5.8); 高壓滅菌后,加入100mmol/L乙酞丁香酮.共培養(yǎng)基:1/2N6max+l/2N6min+2,4-D 2mg/L+6-BA 0.5mg/L+水解酪蛋白0.5g/L+蔗糖20g/L+葡萄糖10g/L+瓊脂粉6g/L(pH=5.2);高壓滅菌后,加入100mmol/L乙酞丁香酮.第一次篩選培養(yǎng)基：N6十2,4-D 1mg/L+水解酪蛋白0.5/L+脯氨酸2.8g/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L(pH5.8);高壓滅菌

15、后,加入Kan 150mg/L+Cb 300mg/L+Cef 300mg/L;第二次篩選培養(yǎng)基:N6+2,4-D lmg/L+水解酪蛋白0.5g/L+脯氨酸2.8g/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+(pH5.8);高壓滅菌后,加入Kan 250mg/L+ Cb 300mg/L+Cef 300mg/L;分化培養(yǎng)基:Ms+KT2.0mg/L+NAA lmg/L+IAA 0.5mg/L+水解酪蛋白0.5g/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L(pH5.8):生根培養(yǎng)基:l/2MSmax+l/2MSmin+蔗糖20g/L+多效唑4mg/L+瓊脂粉6g/L(pH5.8)：LB固體培養(yǎng)基:蛋白胨10g/

16、L+酵母提取物5g/L+NaCI 10g/L+瓊脂粉15g/L(PH7.0);LB液體培養(yǎng)基: 蛋白胨10g/L+酵母提取物5g/L+NaCI 10g/L(pH7.0);5：農(nóng)桿菌介導(dǎo)法HALI轉(zhuǎn)化粳稻受體體系的建立5.1：篩選劑Kan和Cb的敏感性實(shí)驗(yàn)(1):水稻愈傷組織篩選過程中Kan篩選濃度的確定取繼代1次,結(jié)構(gòu)致密，顆粒狀愈傷組織,預(yù)培養(yǎng)3d后,接種于轉(zhuǎn)入含Kan分別為0、50、100、150、250、300、400mg/L的篩選培養(yǎng)基上,25條件下暗培養(yǎng),30d后觀察并統(tǒng)計(jì)愈傷組織成活及生長(zhǎng)情況,從而確定Kan的篩選濃度。表1：Kan的篩選濃度統(tǒng)計(jì)表Kan濃度mg/L愈傷接種數(shù)愈傷組

17、織成活數(shù)愈傷組織成活率/%010050100100100150100250100300100400100(2) . Cb對(duì)水稻愈傷組織的敏感性試驗(yàn)取繼代1次的結(jié)構(gòu)致密、顆粒狀愈傷組織,預(yù)培養(yǎng)3d后,接種于轉(zhuǎn)入含Cb分別為0、200、400、600、800、1000mg/L的篩選培養(yǎng)基上,25條件下暗培養(yǎng),30d后觀察并統(tǒng)計(jì)愈傷組織成活及生長(zhǎng)情況,研究Cb對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的影響。表2：Cb對(duì)水稻愈傷組織的敏感性試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)表Cb的濃度mg/L接種愈傷數(shù)愈傷組織成活數(shù)愈傷組織成活率/%010020010040010060010080010010001005.2：農(nóng)桿菌不同培養(yǎng)方式和不同的濃度對(duì)水稻轉(zhuǎn)化效

18、率的影響農(nóng)桿菌活化是農(nóng)桿菌侵染外植體，實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。無論是 MS培養(yǎng)基，LB 固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)液還是 YEB 固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)液：培養(yǎng)農(nóng)桿菌對(duì)轉(zhuǎn)化效率應(yīng)該有不同的影響?？赡苁怯捎谶@四種培養(yǎng)條件都可以滿足農(nóng)桿菌營(yíng)養(yǎng)需要使農(nóng)桿菌處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，此外，農(nóng)桿菌的濃度和侵染方法也可能對(duì)轉(zhuǎn)化效率有很大的影響。表3：農(nóng)桿菌不同培養(yǎng)方式對(duì)水稻轉(zhuǎn)化效率的影響品種農(nóng)桿菌培養(yǎng)方式抗性愈傷組織形態(tài)抗性愈傷率/%品種1 品種2表4：農(nóng)桿菌的不同濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響品種農(nóng)桿菌濃度抗性愈傷組織形態(tài)抗性愈傷率/%品種10.30.61.0品種20.30.61.0表5：農(nóng)桿菌的侵染方法對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響品種侵染方

19、法抗性愈傷組織形態(tài)抗性愈傷率/%品種1靜置 30 min靜置10 min 后振蕩20 min搖床上振蕩 30 min靜置20 min 后負(fù)壓處理 10 min品種2靜置 30 min靜置10 min 后振蕩20 min搖床上振蕩 30 min靜置20 min 后負(fù)壓處理 10 min6：HALI基因轉(zhuǎn)化粳稻6.1：受體材料預(yù)處理取繼代1次, 結(jié)構(gòu)致密、色澤鮮亮的淡黃色顆粒狀愈傷組織, 預(yù)培養(yǎng)基中培養(yǎng)5d 后作為帶有目的基因農(nóng)桿菌侵染的受體。6.2：供體菌株的培養(yǎng) 從含有目的基因Prokll/HALI的根癌農(nóng)桿菌工程菌株LBA44O4儲(chǔ)液(25%甘油,:70e保存)中蘸取少量菌液，于LB固體培養(yǎng)

20、基(含Rif50mg/L、Kan75mg/L)上劃線培養(yǎng),28暗培養(yǎng)至長(zhǎng)出直徑約lmm大小的單菌落(約48h)。 從平板上挑取單菌落接種于40mL附加75mg/L Kan和50mg/L Rif的LB液體培養(yǎng)基中, 28, 220rppm恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.6-0.8(約36h)。 以1%-2%的比例將搖好的菌液轉(zhuǎn)接于40ml新鮮且無抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，28，220rppm恒溫?fù)u床上繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.6-0.8時(shí)即可。6.3：侵染在超凈工作臺(tái)上，經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)入無菌燒杯中，倒入已培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌液，并不斷搖動(dòng)，使外植體與農(nóng)桿菌充分接觸，浸泡時(shí)間為25mi

21、n；將愈傷組織取出后，用無菌濾紙吸干。6.4：共培養(yǎng)經(jīng)無菌濾紙吸干后的愈傷組織接入覆蓋有一層無菌濾紙的共培養(yǎng)基中,于22暗培養(yǎng)"共培養(yǎng)時(shí)間分別為1,2,3,4,5d。共培養(yǎng)天數(shù)對(duì)水稻愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的影響共培養(yǎng)天數(shù)接種愈傷數(shù)污染數(shù)污染率/%獲得抗性愈傷數(shù)抗性愈傷獲得率/%123456.5：脫菌處理共培養(yǎng)結(jié)束后,需及時(shí)有效地殺死外植體表面和深層潛伏的農(nóng)桿菌，否則農(nóng)桿菌的過度繁殖將會(huì)抑制或殺死愈傷組織，不能篩選出抗性愈傷組織。步驟為滅菌蒸餾水沖洗4-5次后，0.1%的升汞中滅菌2min,無菌蒸餾水沖洗2次，無菌蒸餾水浸泡30min后，再用無菌蒸餾水沖洗2次。6.6：干燥處理經(jīng)脫菌處理的愈

22、傷組織，設(shè)在超凈工作臺(tái)上吹干至愈傷組織略有皺縮(吹干2h左右)和直接接種于篩選培養(yǎng)基中，觀察干燥處理對(duì)轉(zhuǎn)化愈傷組織培養(yǎng)的影響。脫菌后的干燥處理對(duì)水稻愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的影響7：轉(zhuǎn)化植株的獲得與篩選轉(zhuǎn)化后的愈傷組織接種于含Kan l50mg/L、Cb300mg/L、Cef300mg/L的篩選培養(yǎng)基中,25暗培養(yǎng)30d左右,轉(zhuǎn)入含Kan250mg/L、Cb300mg/L、Cef300mg/L的篩選培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)30d左右。經(jīng)過篩選后的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中，于25，3000lx光照培養(yǎng)，待分化的綠苗長(zhǎng)至4-5cm高時(shí)，轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根培養(yǎng)，獲取完整的Kan抗性植株。8：技術(shù)路線查文

23、獻(xiàn)，篩選資源，確定材料質(zhì)粒和菌株目的基因培養(yǎng)基的設(shè)置成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)基 共培養(yǎng)基:第一次篩選培養(yǎng)基第二次篩選培養(yǎng)基:分化培養(yǎng)基:生根培養(yǎng)基: 引物設(shè)計(jì)HAL1體系的建立Kan濃度篩選Cb對(duì)愈傷的敏感性培養(yǎng)方式對(duì)轉(zhuǎn)化的影響農(nóng)桿菌濃度對(duì)轉(zhuǎn)化的影響侵染方法對(duì)轉(zhuǎn)化的影響HAL1基因的轉(zhuǎn)化受體材料預(yù)處理供體菌株的培養(yǎng) 侵染 共培養(yǎng) 脫菌處理 干燥處理共培養(yǎng)天數(shù)對(duì)水稻愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化脫菌后的干燥處理對(duì)水稻愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化植株的獲得與篩選參考文獻(xiàn)；1. 萬建民.中國(guó)水稻遺傳育種與品種系譜（1986-2005）M.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2010.2. 李繼開, 水稻抗鹽育種前途光明J,鹽堿

24、地利用1992, 3: 10-123. 祁棟靈, 郭桂珍, 李明哲, 曹桂蘭, 張俊國(guó), 周慶蘭, 張三元, 徐錫哲, 韓龍植,水稻耐鹽堿性生理和遺傳研究進(jìn)展J,植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2007,8（4）：486-493.4. 孫建昌，寧夏粳稻離體再生體系的建立及HAL1基因遺傳轉(zhuǎn)化的研究D，陜西，西北農(nóng)林科技大學(xué).5. 付亞萍，劉文真，胡國(guó)成，斯華敏，孫宗修.關(guān)于轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用于水稻育種研究的思考.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007(12):2659-2666.6. 唐海娟，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)基因研究D，南京，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，3-22.7. Tada Y Sakamoto M et al Effieient

25、 transformation of rice cells and Prodution of transgenie rice Plants In IRR I Rice genetics Proceedings of the second international rice genetics symposium.Manila IRR I，1990，575-583.8. Chan M T，Lee T M，Chang H HTransformation of indica rice( Oryza sativa L)mediated by Agrobacterium tumefaciensJPlan

26、t Cell Physiol. 1992，33( 5) : 577-5839. Hiei Y，Ohta S，Komari T，et al Efficient transformation of rice( Oryza sativa L) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNAJPlant J1994，6: 271-28210. Hoque M E，Mansfield J W，Bennett M H Agrobacteriummediated transformation of

27、indica genotypes: an assessment of factors affecting the transformation efficiencyJPlant Cell TissOrgan Cult2005，82: 45-5511. Khanna H K，Raina S KElite indica transgenic rice plants expressing modified Cry1Ac endotoxin of Bacillus thuringiensis show enhanced resistance to yellow stem borer ( Scirpop

28、hagaincertulas)JTransgenic Res2002，11: 411-42312. Hiei Y，Komari TImproved protocols for transformation of indica rice mediated by Agrobacterium tumefaciensJPlant Cell Tiss Organ Cult2006，85: 271 -28313. Hiei Y，Komari TAgrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seedJ N