基因芯片在環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用

1、 基因芯片在環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用作者 指導(dǎo)老師 摘要：基因芯片技術(shù)是21世紀(jì)生物技術(shù)的重要發(fā)展，是生命科學(xué)與物理學(xué)、化學(xué)、微電子學(xué)以及計(jì)算機(jī)學(xué)等學(xué)科相互交叉的一門高新技術(shù)。該技術(shù)的突出特點(diǎn)在于其高度的并行性、多樣化、微型化、自動(dòng)化，基因芯片技術(shù)應(yīng)用于功能基因研究、雜交測(cè)序、藥物篩選診斷、基因表達(dá)、基因多態(tài)性和突變檢測(cè)等，除了在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、制藥學(xué)、司法和農(nóng)林業(yè)等領(lǐng)域上都有極為廣闊的應(yīng)用外，在環(huán)境保護(hù)上，一方面可以快速檢測(cè)污染微生物或有機(jī)化合物對(duì)環(huán)境、人體、動(dòng)植物的污染和危害，同時(shí)也能夠通過(guò)大規(guī)模的篩選尋找保護(hù)基因，制備防治危害的基因工程藥品、或能夠治理污染源的基因產(chǎn)品。關(guān)鍵詞：基因芯片；環(huán)境保護(hù)；

2、環(huán)境污染；微生物檢測(cè)Gene Chip Technology and its Application in Environment ProtectionAuthor Wang Han YuInstructor Cai Tian MingAbstract： Gene chip technology is one of the important development of biotechnology in the 21st century, and it is a high technology which the life scientific and physics, chemistry,

3、 microelectronics and computer science and other disciplines intersect at. The salient features of this technology is its high degree of parallelism, diversification, miniaturization, automation, Gene chip technology has been used in functional genomics research, hybridization sequencing, drug scree

4、ning, diagnosis, gene expression, gene polymorphism and mutation detection, etc. Apart from the external application on the field of biology, medicine, pharmaceutics, judicial and agroforestry, In environmental protection, On the one hand it can quickly detect the pollution and harm comes from micro

5、organisms or organic compounds of environment, human, animal and plant. But also to seek protection through large-scale genetic screening, and prepare genetic engineering drugs to hazard Prevention or gene product which can control pollution.Key words: Gene Chip；environment protection；environment po

6、llution ；microbial detection前言基因芯片, 又稱DNA 微探針陣列(microarray),是一種最重要的生物芯片的一條分支，是伴隨人類基因組計(jì)劃而產(chǎn)生的，該技術(shù)的突出特點(diǎn)在于其高度的并行性、多樣化、微型化、自動(dòng)化，被認(rèn)為是生命科學(xué)研究中繼基因克隆技術(shù)、基因自動(dòng)測(cè)序技術(shù)、PCR 技術(shù)后的又一次革命性的技術(shù)突破。是近年來(lái)不僅在分子生物學(xué)及醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)的重要進(jìn)展。它的工作原理與經(jīng)典的核酸分子雜交方法是一致的, 都是應(yīng)用已知核酸序列作為探針與互補(bǔ)的靶核苷酸序列雜交, 通過(guò)隨后的信號(hào)檢測(cè)進(jìn)行定性與定量分析。基因芯片在一微小的基片(硅片、玻片、塑料片等)表面集成了大量的分子識(shí)

7、別探針, 能夠一次分析大量的基因, 進(jìn)行大信息量的篩選與檢測(cè)。基因芯片可以快速有效地檢測(cè)污染源，檢測(cè)由微生物、有機(jī)物等引起的污染，對(duì)環(huán)境污染物進(jìn)行檢測(cè)與評(píng)價(jià)。同時(shí)能夠幫助研究人員通過(guò)大規(guī)模的篩選制備能夠治理污染源的基因產(chǎn)品或?qū)ふ业奖Ｗo(hù)基因并制備防止危害的基因工程產(chǎn)品。1基因芯片的原理和種類1.1 基因芯片的產(chǎn)生1985年,美國(guó)科學(xué)家率先提出人類基因組計(jì)劃，由此揭開人類生命科學(xué)史上的偉大工程，隨著人類基因組計(jì)劃實(shí)施，大量的動(dòng)植物、微生物基因組序列得以測(cè)定，基因序列數(shù)據(jù)以前所未有的速度增加，怎樣去面對(duì)如此眾多的基因并探討其在生命活動(dòng)中擔(dān)負(fù)的功能就成了生命科學(xué)者們共同的任務(wù)。有人就曾設(shè)想利用計(jì)算機(jī)半

8、導(dǎo)體技術(shù)生產(chǎn)基因芯片，以對(duì)人類基因大量的遺傳信息進(jìn)行分析和檢查,直到1994年,由于光電化學(xué)的進(jìn)展、光刻技術(shù)的誕生,Pease等人創(chuàng)造的光導(dǎo)原位合成(Light-direetedsymothesis)高密、微化的寡核昔酸陣列(ODTA)技術(shù)得以問(wèn)世，這才使設(shè)想逐步成為現(xiàn)實(shí)。基因芯片采用微加工和微電子技術(shù)，可在大小1cm的固相表面組裝固定若干、幾十、成千甚至上萬(wàn)個(gè)不同DNA探針，以形成生物分子高密、二維陣列的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)基因分子信息個(gè)別及大規(guī)模的分析和檢測(cè)。1.2 原理基因芯片的原理是基于核酸分子堿基之間(A一T/G一C)互補(bǔ)配對(duì)的原理，利用分子生物學(xué)、基因組學(xué)、信息技術(shù)、微

9、電子、精密機(jī)械和光電子等技術(shù)將一系表面構(gòu)成微點(diǎn)陣，然后將標(biāo)一記的樣品分子與微點(diǎn)陣上的DNA雜交,以實(shí)現(xiàn)對(duì)多到數(shù)萬(wàn)個(gè)分子之間的雜交反應(yīng),并根據(jù)雜交模式構(gòu)建目標(biāo)DNA的序列，從而達(dá)到高通量大規(guī)模地分析檢測(cè)樣品中多個(gè)基因的表達(dá)狀況或者特定基因(DNA)分子是否存在的目的。例如將由A、T、C、G4種核普酸任意組合形成的八聚體寡核昔酸探針(65536個(gè))和1個(gè)長(zhǎng)度為12個(gè)寡核昔酸堿基組成為AGCCTAGCTGAA的DNA單鏈進(jìn)行雜交反應(yīng),結(jié)果有5種探針可以和目標(biāo)DNA互補(bǔ)結(jié)合，它們分別是TCGGATCG、CGGATCGA、GGATCGAC、GATCGACT和ATCGACTT。將這些具有重疊序列的探針進(jìn)行

10、重排就可以構(gòu)建目標(biāo)DNA的互補(bǔ)序列。1.3 種類基因芯片的類型較為繁多，其分類方法較多：根據(jù)載體基質(zhì)不同分為:無(wú)機(jī)片基基因芯片，指其基質(zhì)基片是無(wú)機(jī)物，如:玻璃、硅片等，有機(jī)片基基因芯片，指其基質(zhì)基片是有機(jī)物，如:凝膠、尼龍膜等；依據(jù)探針合成的順序分為:原位合成基因芯片和預(yù)先合成后上樣的基因芯片，前者通過(guò)聚乙二醇或硅烷類化學(xué)試劑在不同位點(diǎn)合成不同的探針，后者比較簡(jiǎn)單，先制備好cDNA或寡核營(yíng)酸，然后在經(jīng)特殊處理的玻片、硅片或膜上點(diǎn)樣；按照基因芯片的用途可分為:基因表達(dá)芯片和DNA測(cè)序芯片，前者可以將克隆到的成千上萬(wàn)個(gè)基因特異的探針或cDNA片段固定在一塊DNA芯片上，對(duì)來(lái)源不同的個(gè)體(正常人或患

11、者)、組織、細(xì)胞周期、發(fā)育階段、分化階段、不同的病變、不同刺激(包括不同誘導(dǎo)和不同治療手段)下的細(xì)胞內(nèi)mRNA或反轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的cDNA進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)這些基因表達(dá)的個(gè)體特異性、病變特異性、刺激特異性進(jìn)行綜合分析和判斷，將某個(gè)或某幾個(gè)基因與疾病聯(lián)系起來(lái)，極快地確定這些基因的功能，且可進(jìn)一步研究基因與基因間相互作用關(guān)系，后者則是對(duì)大量的基因進(jìn)行序列分析。按基因芯片組裝的探針可分為:寡核昔酸和cDNA芯片，前者可用于基因組學(xué)及表達(dá)譜研究，后者僅用于表達(dá)譜研究。2 基因芯片技術(shù)2.1 DNA陣列的構(gòu)建和印制根據(jù)芯片種類的應(yīng)用目的的不同，芯片核酸陣列的構(gòu)建方式也不相同，首先是根據(jù)研究目的選用合適的寡核苷酸、

12、cDNA片段或特定的功能基因等，按統(tǒng)計(jì)方式事先構(gòu)建成點(diǎn)陣列，然后，將所需用的核酸片段就位合成于芯片上，或以大致相當(dāng)?shù)臐舛?，變性后采用手工或機(jī)械的方法，按一定的排列方式點(diǎn)樣在特定的固相支持物上，前者稱為原位合成，后者可有壓電打印和直接點(diǎn)樣兩種方法。2.2靶樣品的準(zhǔn)備靶樣品就是DNA樣品，主要來(lái)源是從生物細(xì)胞中提取mRNA后經(jīng)轉(zhuǎn)錄成cDNA通常采用常規(guī)的基因分離、反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增的標(biāo)記等，為了獲得雜交信號(hào)，在擴(kuò)增過(guò)中加同位素或化學(xué)熒光進(jìn)行標(biāo)記。同位素常用P33/S35，使用熒光標(biāo)記，沒(méi)有同位素的放射危險(xiǎn)性，通過(guò)激光共聚焦掃描儀器尋址測(cè)讀，具有很高的分辨能力、極高的靈敏度和定位功能，是目前廣泛用于芯片雜

13、交結(jié)果判讀的標(biāo)記方法，熒光標(biāo)記染料已開發(fā)出了數(shù)10種。2.3雜交和檢測(cè)雜交：芯片雜交過(guò)程與傳統(tǒng)的 Southern 印跡雜交等類似，屬于固液相正相雜交：探針?lè)肿庸潭ㄓ谛酒砻?，與液相的靶分子進(jìn)行反應(yīng)。但這種方式不僅使得檢測(cè)過(guò)程平行化，可以同時(shí)檢測(cè)成百上千的基因序列，而且由于集成的顯微化，使得雜交所需的探針及待測(cè)樣品均大為減少，雜交時(shí)間明顯縮短。檢測(cè)：對(duì)于熒光標(biāo)記芯片應(yīng)用熒光顯微鏡或激光共聚焦掃描儀等采集各雜交點(diǎn)熒光信號(hào)如位置和強(qiáng)度；同位素標(biāo)記多采用放射自顯影檢測(cè)雜交信號(hào)；最近發(fā)展的納米金標(biāo)記，通過(guò)銀放大后可直接在裸眼或普通光學(xué)顯微鏡下觀察。最終再用相關(guān)軟件進(jìn)行信號(hào)的分析處理，得出待測(cè)樣品的核酸

14、信息。2.4數(shù)據(jù)收集和分析將經(jīng)熒光或激光共聚焦掃描得到的圖像輸入計(jì)算機(jī)，按不同的研究目的，用專門軟件對(duì)雜交產(chǎn)生的印跡進(jìn)行數(shù)據(jù)的自動(dòng)化處理和定量分析。其基本步驟為樣品斑點(diǎn)的確定、圖像背景的識(shí)別和扣除，所得的數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)化后，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到基因的表達(dá)圖譜。3基因芯片在環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用3.1微生物群落研究中的應(yīng)用31.1探究群落中微生物的意義微生物在生態(tài)系統(tǒng)的功能和持續(xù)中起著極其重要的作用，了解微生物群落的結(jié)構(gòu)和組成以及它們對(duì)環(huán)境干擾的反應(yīng)和適應(yīng)性，對(duì)于維持和恢復(fù)生態(tài)系統(tǒng)理想的生態(tài)功能是很重要的環(huán)境微生物群落研究包括環(huán)境樣品的微生物分布、種類、功能、動(dòng)力學(xué)變化及氣候、環(huán)境污染等環(huán)境因素改變對(duì)其微生

15、物生態(tài)的影響等。3.1.2基因芯片技術(shù)用于環(huán)境微生物研究具有更多優(yōu)勢(shì)與傳統(tǒng)的核酸檢測(cè)技術(shù)相比，基因芯片技術(shù)用于環(huán)境微生物研究具有更多優(yōu)勢(shì)：首先，DNA或寡核苷酸為基礎(chǔ)的基因芯片技術(shù)是研究功能基因組學(xué)的有力工具，它允許研究者全面地研究不同條件下活細(xì)胞的生理學(xué)。第二，基因芯片技術(shù)不需要知道保守序列，不同種群的同一功能組的所有多態(tài)性基因序列可以構(gòu)建在芯片上，并且以此作為探針來(lái)檢測(cè)它們?cè)诃h(huán)境樣品中的的相應(yīng)分布。第三，不需要枯燥費(fèi)時(shí)的配對(duì)雜交。第四，基因芯片需要的樣品量少，適宜于環(huán)境微生物檢測(cè)。第五，基因芯片具有定量特性?；蛐酒诃h(huán)境微生物研究中的應(yīng)用處于起步階段，但是，芯片技術(shù)在環(huán)境微生物研究中的應(yīng)

16、用將加速?gòu)?fù)雜環(huán)境微生物系統(tǒng)的生態(tài)、生理、結(jié)構(gòu)和功能的了解。3.1.3常用基因芯片的種類（1）系統(tǒng)寡核苷酸芯片 系統(tǒng)寡核苷酸芯片建立在系統(tǒng)標(biāo)記基因如rRNA 基礎(chǔ)之上。rRNA 是研究細(xì)菌進(jìn)化和親源關(guān)系的重要指標(biāo)， 是細(xì)菌系統(tǒng)分類學(xué)最有用和常用的分子鐘。16S rRNA是最常用的作為細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析的系統(tǒng)進(jìn)化標(biāo)記分子。它由多個(gè)高度保守的區(qū)段和可變區(qū)段組成，保守性序列基本保守， 反映生物物種的親緣關(guān)系，因此可以利用恒定區(qū)序列設(shè)計(jì)引物將16S rRNA 片段擴(kuò)增出來(lái)； 高變性則揭示生物物種的特征核酸序列， 其序列因不同細(xì)菌而異， 因此可利用可變區(qū)序列的差異來(lái)設(shè)計(jì)不同菌屬、菌種的探針。系統(tǒng)寡核苷酸芯片

17、是目前應(yīng)用最廣的一種基因芯片， 利用該技術(shù)已經(jīng)成功對(duì)堆肥、土壤、活性污泥、鈾污染含水土層等環(huán)境樣品進(jìn)行了微生物檢測(cè)、菌群動(dòng)力學(xué)、多樣性和結(jié)構(gòu)分析。(2)功能基因芯片功能基因芯片通常建立在催化生化反應(yīng)的關(guān)鍵功能基因之上， 這些基因包括了那些與研究對(duì)象有確定關(guān)系的基因， 或至少是與研究對(duì)象的關(guān)系有待考證的基因。作為 FGA 候選基因應(yīng)該具有的特點(diǎn)：(1)該基因是參與生化過(guò)程的關(guān)鍵酶或蛋白質(zhì)編碼基因； (2)進(jìn)化保守但在不同微生物之間具有足夠的變異， 從而可以對(duì)不同菌株設(shè)計(jì)探針； (3)不同的基因在數(shù)據(jù)庫(kù)的序列信息量是不同的， 應(yīng)該選擇在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中具有翔實(shí)序列信息的有關(guān)基因。根據(jù) FGA 的目的及

18、其雜交靶標(biāo)的種類， FGA 分為功能分類基因芯片和基因表達(dá)芯片。 前者的目的主要是研究菌群是否具有這些特定反應(yīng)過(guò)程及其功能的分布、變化、多樣性， 其雜交靶標(biāo)是菌群DNA的PCR 產(chǎn)物。而后者用于研究這些特定功能基因的生理活性及其基因表達(dá)情況， 需提取環(huán)境樣品的mRNA， 其雜交靶標(biāo)是菌群cDNA 的PCR 產(chǎn)物。（3）群落基因組芯片(CGA)群落基因組芯片(CGA)是一種將可培養(yǎng)微生物的全基因組DNA 作為探針的技術(shù)， 它的特異性高，可以鑒定到種甚至菌株水平； 敏感性強(qiáng)， 只需0.2 ng的待分析基因組DNA 就可檢測(cè)。CGA 在微生物檢測(cè)、鑒定、量化、不同環(huán)境樣品的微生物菌群相關(guān)性或不同微生

19、物基因組的相關(guān)性分析等方面將有著廣泛的前景。（4）宏基因組芯片(MGA)未培養(yǎng)微生物組成了地球上生物多樣性的主體，據(jù)估計(jì)， 自然環(huán)境中超過(guò)99%的微生物不能用傳統(tǒng)的方法進(jìn)行純培養(yǎng)， 因此， 人們開始通過(guò)免培養(yǎng)的技術(shù)即宏基因組或直接從環(huán)境樣品中抽提克隆微生物的混合DNA 來(lái)研究環(huán)境樣品中微生物基因組的功能和序列分析。目前， 利用該技術(shù)已進(jìn)行了酸礦外排液和Sargasso Sea 的微生物群落、活性污泥和土壤細(xì)菌PHB 代謝遺傳學(xué)等的研究。該技術(shù)可以分析環(huán)境樣品微生物結(jié)構(gòu)和功能；可以通過(guò)不同環(huán)境樣品宏基因組芯片的比較分析獲得某環(huán)境樣品菌群的代表DNA 探針。3.1.4研究方法（1）基因指紋圖譜法：

20、 指紋圖譜法是指用各種技術(shù)來(lái)評(píng)估PCR產(chǎn)物在凝膠上的譜帶類型，有下述的許多方法可以用于區(qū)分群落間的差異，但當(dāng)它們用于像多樣性指數(shù)等更精度的分析時(shí)，必須首先確定每一譜帶類型只代表一個(gè)種。酶解技術(shù)，如擴(kuò)增rDNA限制性片段分析、限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析等方法，每一個(gè)種都有多個(gè)譜帶類型，使它們難以單獨(dú)用于群落多樣性分析，而更適合于在基因測(cè)序之前對(duì)克隆文庫(kù)及分離物進(jìn)行篩選。其缺點(diǎn)是，由于僅有末端片段長(zhǎng)度被分析，獲得的信息較少，不足以分析非常復(fù)雜的微生物群落，如土壤微生物群落，因?yàn)槎喾N微生物的酶切末端片段長(zhǎng)度可能相同，造成對(duì)物種豐度的估計(jì)過(guò)低。(2) 分子雜交法直接將PCR產(chǎn)物或

21、樣品DNA/RNA與已有的探針雜交來(lái)檢測(cè)微生物群落的多樣性能夠用于識(shí)別種間或種內(nèi)差異性，其特點(diǎn)是不需要對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，因此可以避免PCR過(guò)程中產(chǎn)生的誤差；但是同樣因?yàn)槲磳?duì)目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增，目標(biāo)基因濃度較低，容易給檢測(cè)帶來(lái)困難；且有時(shí)目標(biāo)類群的目標(biāo)基因序列并非完全同一，而是有亞類群之間的差異，結(jié)果所設(shè)計(jì)的探針DNA序列與某些亞類群的目標(biāo)基因互補(bǔ)性較差，從而導(dǎo)致對(duì)該類群的估計(jì)過(guò)低；此外，它只能用來(lái)檢測(cè)事先估計(jì)到其存在、己知其目標(biāo)基因序列、并為之設(shè)計(jì)好引物的類群。 (3) 定量PCR分析法通過(guò)定量PCR可以直接測(cè)定目標(biāo)基因在微生物群落中的拷貝數(shù)或相對(duì)量，目前有稀釋PCR(Limiting

22、Dilution PeR)、動(dòng)力學(xué)PCR(Kinetic PCR)!競(jìng)爭(zhēng)性PCR(Competitive PCR)和適時(shí)熒光定量PCR。稀釋法定量PCR盡管簡(jiǎn)單，但它卻不能提供準(zhǔn)確的定量測(cè)定數(shù)據(jù)，因?yàn)樵赑CR的指數(shù)擴(kuò)增階段，微小的變異將顯著改變PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。是迄今為止定量最準(zhǔn)確、重現(xiàn)性最好的定量方法，己廣泛用于基因表達(dá)!轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效檢測(cè)、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。 (4) 基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析法該方法是應(yīng)用DNA測(cè)序技術(shù)直接將目標(biāo)基因進(jìn)行序列測(cè)定，并與基因文庫(kù)中己有的序列進(jìn)行比較分析來(lái)確定微生物群落多樣性及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。該方法能提供各個(gè)克隆分類地位的可靠信息，但需要很長(zhǎng)的試驗(yàn)周期、大

23、量的試驗(yàn)材料，實(shí)際工作中對(duì)所有的克隆進(jìn)行測(cè)序難以實(shí)現(xiàn)，通常需要與RFLP法或T-RFLP法結(jié)合，或者只隨機(jī)挑選部分克隆進(jìn)行測(cè)序；而且根據(jù)克隆的拷貝數(shù)估計(jì)種群豐度將導(dǎo)入隨機(jī)誤差。3.1.5基因芯片在環(huán)境微生物研究中的挑戰(zhàn)理論上，基因芯片技術(shù)提供了為復(fù)雜的微生物群落進(jìn)行全面的和定量研究所必須的優(yōu)點(diǎn)，然而，與純培養(yǎng)的研究比較，基因芯片在對(duì)環(huán)境核酸樣品的分析面臨幾個(gè)重要的技術(shù)挑戰(zhàn)。首先，基因芯片雜交的內(nèi)在變化是一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題，目前，很難用同一種方法在不同的實(shí)驗(yàn)室和甚至同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室的不同實(shí)驗(yàn)間進(jìn)行數(shù)據(jù)比較；第二，當(dāng)有些環(huán)境樣品提取的DNA或RNA量不夠時(shí)，基因芯片雜交的靈敏度仍然不夠，不清楚是否基因芯片雜

24、交的靈敏度足夠檢測(cè)環(huán)境樣品中所有類型的微生物；第三，基因芯片研究環(huán)境樣品產(chǎn)生的數(shù)據(jù)數(shù)量可能很大，但是快速的處理和發(fā)掘分析雜交數(shù)據(jù)仍然處于初級(jí)階段；第四，整個(gè)群落的基因數(shù)量可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出目前基因芯片的容量；第五，盡管確定微生物群落性狀的基因芯片一旦構(gòu)建成功，該芯片可以提供一種快速方法，但是制備適合于基因芯片分析的高質(zhì)量的樣品成為了研究的瓶頸；最后，基因芯片僅僅是研究的工具，它們應(yīng)該結(jié)合到解決生態(tài)或環(huán)境的問(wèn)題和假說(shuō)中去，只有這樣，分析微生物群落基因芯片的力量才能夠得到肯定。3.2環(huán)境毒理學(xué)研究中的應(yīng)用3.2.1 病毒檢測(cè)基因芯片的應(yīng)用目前病毒感染的診斷以經(jīng)典血清學(xué)方法、現(xiàn)代免疫學(xué)技術(shù)和分子生物學(xué)方法

25、為主，但在對(duì)那些遺傳變異頻繁的病毒感染進(jìn)行診斷時(shí)，這些方法的程序復(fù)雜、工作周期長(zhǎng)，不利于快速診斷。PCR技術(shù)應(yīng)用以來(lái)，為病毒感染的診斷提供了高靈敏度的檢測(cè)工具，但同時(shí)非特異產(chǎn)物的增多也容易導(dǎo)致臨床診斷錯(cuò)誤。在PCR基礎(chǔ)上，利用核酸雜交特異性高的特點(diǎn)，基因芯片能通過(guò)平行分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物快速、準(zhǔn)確地鑒別多種病原體，用于高通量、大規(guī)模的病毒檢測(cè)和分型。3.2.2 細(xì)菌檢測(cè)基因芯片的應(yīng)用應(yīng)用基因芯片診斷病原菌的原理，在于細(xì)菌的16S rRNA基因的高度保守性。rRNA基因包括313kb長(zhǎng)的23S、116kb長(zhǎng)的16S和僅0112kb長(zhǎng)的5S三個(gè)基因。其中16S rRNA基因的長(zhǎng)度最合適，是目前最常被

26、選用作為細(xì)菌鑒定和分類的基因。目前，幾乎所有已知細(xì)菌16S rRNA基因的堿基序列均被測(cè)定并存入基因庫(kù)，由于RNA易于降解，多采用檢測(cè)16S rRNA對(duì)應(yīng)染色體上的16S rDNA序列。細(xì)菌檢測(cè)基因芯片中 16S rDNA 靶基因的選用國(guó)內(nèi)外多有利用16S rRNA靶基因制備的細(xì)菌檢測(cè)基因芯片的報(bào)道，如美國(guó)學(xué)者Warsen在2004年根據(jù)細(xì)菌16S rDNA設(shè)計(jì)寡核苷酸探針構(gòu)建基因芯片，對(duì)18種細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)，其中包括嗜水氣單胞菌、愛德華氏菌、葡萄球菌、鏈球菌等15種魚類常見病原菌，結(jié)果能100%特異性地檢測(cè)出這些病原菌。細(xì)菌檢測(cè)基因芯片技術(shù)作為一種高新技術(shù)，例如：已經(jīng)在水產(chǎn)中微生物的鑒定、水產(chǎn)

27、動(dòng)物疾病的快速診斷等方面有廣闊的應(yīng)用前景。概括起來(lái)它的優(yōu)越性主要有：（1）以各類致病基因的特異片段為檢測(cè)樣品，可同時(shí)檢測(cè)多種疾病，提高檢測(cè)效率；（2）整個(gè)過(guò)程無(wú)需機(jī)體免疫反應(yīng)，少量檢測(cè)樣品就可做出早期診斷；（3）能夠測(cè)定病原體的耐藥性問(wèn)題，有利于對(duì)癥下藥；（4）該技術(shù)由DNA 雜交技術(shù)和 PCR 擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合，有極高的靈敏度、特異性和可靠性；（5）自動(dòng)化程度較高，有利于大規(guī)模推廣應(yīng)用。3.2.3基因芯片技術(shù)在食品致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用基因芯片技術(shù)作為一種新的技術(shù)平臺(tái)，已廣泛地應(yīng)用于食品研究領(lǐng)域。隨著該技術(shù)的不斷完善，其將在食品研究和食品安全中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。就基因芯片技術(shù)檢測(cè)食品中常見致病

28、菌的基本原理、檢測(cè)過(guò)程、存在的問(wèn)題、研究進(jìn)展作一介紹?；蛐酒幕驹硎菍⒏鞣N基因寡核苷酸點(diǎn)樣于芯片表面，微生物樣品DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后制備熒光標(biāo)記探針，然后再與芯片上寡核苷酸點(diǎn)雜交，最后通過(guò)掃描儀定量和分析熒光分布模式來(lái)確定檢測(cè)樣品是否存在某些特定微生物。常規(guī)檢測(cè)方法主要有傳統(tǒng)生化培養(yǎng)檢測(cè)法、探針雜交、PCR法。傳統(tǒng)方法是采用細(xì)菌培養(yǎng)、生化鑒定與血清分型，由于操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)而被廣泛采用，但檢測(cè)時(shí)限長(zhǎng)(一般要1-2周)，效率低、靈敏度不高。常規(guī)檢測(cè)方法檢測(cè)食品中的致病菌已經(jīng)不能滿足快速檢測(cè)的要求，難以適應(yīng)飛速發(fā)展的現(xiàn)代食品生產(chǎn)和流通領(lǐng)域，因此為了確保食品的安全性，開發(fā)快速檢測(cè)致病菌的方法，準(zhǔn)

29、確地檢測(cè)食品中的致病菌具有十分重要的意義。該技術(shù)具有傳統(tǒng)的檢測(cè)方法不可比擬的優(yōu)越性：1基因芯片可以對(duì)食品中的致病菌實(shí)行高通量和并行檢測(cè)，一次實(shí)驗(yàn)即可得出全部檢測(cè)結(jié)果；2操作簡(jiǎn)便快速，整個(gè)檢測(cè)在幾小時(shí)內(nèi)即可得出檢測(cè)結(jié)果；3特異性強(qiáng)，敏感性高。隨著基因芯片檢測(cè)食品中致病菌技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，將廣泛應(yīng)用于出入境、食品安全指標(biāo)、突發(fā)事件等致病菌的檢測(cè)，食品安全必將得到進(jìn)一步保障，并且將對(duì)整個(gè)食品領(lǐng)域產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。3.2.4水產(chǎn)動(dòng)物病原檢測(cè)基因芯片的應(yīng)用隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖的迅速發(fā)展，水生動(dòng)物病害迅速蔓延。水產(chǎn)上的細(xì)菌病害一直是現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)飛速發(fā)展的障礙，而將基因芯片技術(shù)應(yīng)用于水產(chǎn)病害中，構(gòu)建細(xì)菌檢測(cè)基因

30、芯片，是發(fā)展的趨勢(shì)也是應(yīng)用的實(shí)際。與此同時(shí)，不同靶基因的選用也使得細(xì)菌檢測(cè)基因芯片技術(shù)不斷完善。目前，分子生物學(xué)的核酸探針、斑點(diǎn)雜交和PCR技術(shù)已普遍在海水養(yǎng)殖動(dòng)物疾病檢測(cè)中開發(fā)，并通過(guò)不同的組合應(yīng)用，得到了更高的靈敏度或準(zhǔn)確率，如Dot-ELISA、免疫酶標(biāo)記檢測(cè)核酸雜交、PCR-核酸探針雜交和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)使人們能在極廣范圍內(nèi)對(duì)病原核酸進(jìn)行精確定量；此外，對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物病原的感染機(jī)理及病毒生態(tài)學(xué)研究都有極大的推動(dòng)作用。近年來(lái)，海水養(yǎng)殖動(dòng)物的診斷技術(shù)已向著同時(shí)檢測(cè)多種病原方向發(fā)展，例如同時(shí)檢測(cè)WSSV和IHHNV的PCR技術(shù)、同時(shí)檢測(cè)TSV、WSSV、IHHNV的(RT)PCR技術(shù)等，這些技

31、術(shù)的發(fā)展使人們看到了提高檢測(cè)通量所帶來(lái)的誘人效率?；蛐酒夹g(shù)以其無(wú)可比擬的高通量和快速準(zhǔn)確的檢測(cè)能力必將會(huì)在水生動(dòng)物病害診斷中呈現(xiàn)迅速發(fā)展的趨勢(shì)。3.4.5環(huán)境毒理學(xué)研究中的應(yīng)用前景伴隨著經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，世界各地的快速工業(yè)化和城市化使得人類賴以生存的水環(huán)境體系面臨著前所未有的挑戰(zhàn)，特別是改革開放30多年來(lái)，我國(guó)工農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，大量工業(yè)和城市生活污水排放進(jìn)入江、河、湖、海，對(duì)水環(huán)境保護(hù)的呼聲不斷增高，客觀上需要大量更具有科學(xué)性的、信息內(nèi)容更加精確豐富的生態(tài)毒理學(xué)知識(shí)來(lái)指導(dǎo)和規(guī)范人類的活動(dòng).基因組學(xué)等革新生物技術(shù)的開展帶來(lái)了巨大的基因組學(xué)信息量，不斷有新物種的全基因組信息被揭示出來(lái)，這為基

32、因組學(xué)研究方法和技術(shù)引入到生態(tài)毒理學(xué)方面風(fēng)險(xiǎn)因素的評(píng)估創(chuàng)造了最佳的時(shí)機(jī).基于此開展以DNA芯片研究生態(tài)毒理學(xué)的方法，對(duì)比傳統(tǒng)的毒理學(xué)評(píng)價(jià)方法，不僅可以減少大量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量和實(shí)驗(yàn)時(shí)間，可以獲得更多關(guān)于毒物作用機(jī)制的分子生物學(xué)信息，可以減少不確定的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)推導(dǎo)結(jié)論，由一些眾所周知的生物擴(kuò)展到整個(gè)生態(tài)中。3.3環(huán)境生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用3.3.1在生物多樣性研究中的潛在應(yīng)用生物多樣性及其保護(hù)是生態(tài)學(xué)的一個(gè)關(guān)節(jié)問(wèn)題，也是一個(gè)有關(guān)國(guó)計(jì)民生的問(wèn)題。盡管，傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)為確立生物多樣性提供了有效的工具，然而，一般來(lái)說(shuō)，這些方法都比較費(fèi)時(shí)費(fèi)工。含有對(duì)不同微生物具有特異性的標(biāo)識(shí)基因的基因芯片將為微生物的鑒定

33、和生物多樣性的研究提供有力、快速、及時(shí)的方法。3.3.2 生態(tài)環(huán)境中檢測(cè)的應(yīng)用利用基因芯片眾所周知的微型化、集成化、自動(dòng)化特點(diǎn)，將這種基因芯片技術(shù)引入到對(duì)海洋青鳉魚的生態(tài)毒理學(xué)專用型cDNA芯片的構(gòu)建上來(lái)，從而將海洋環(huán)境壓力危害性和基因表達(dá)特征聯(lián)系起來(lái)，通過(guò)基因表達(dá)分析確定毒理因素的危害性，此研究結(jié)果不僅有助于對(duì)海洋環(huán)境毒理因素相關(guān)的分子生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行了解，也為開發(fā)出創(chuàng)新型的海洋生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)技術(shù)奠定了良好的基礎(chǔ)。楊樹潰瘍病病原種類多樣，寄主廣泛。無(wú)性型多樣，種間形態(tài)特征有重疊；有性型不常發(fā)現(xiàn)，且病原的檢測(cè)常受到地理、寄主、分類知識(shí)的限制，由此需要發(fā)展非依賴分離培養(yǎng)方法的病原鑒定和林間診斷技術(shù)。

34、通過(guò)對(duì)多種核酸模板和具遺傳標(biāo)記功能的多個(gè)靶標(biāo)核酸序列（基因）的擴(kuò)增、測(cè)序和比對(duì)，多重 PCR 擴(kuò)增技術(shù)及基因芯片檢測(cè)技術(shù)可以直接用于環(huán)境樣本的分析。多重 PCR 同時(shí)平行通量擴(kuò)增多個(gè)模板或位點(diǎn)，芯片具有同時(shí)平行通量檢測(cè)多種病原菌的潛力，二者的聯(lián)合可完成快速高通量并行的檢測(cè)多個(gè)物種。將多重 PCR-基因芯片技術(shù)應(yīng)用到樹木潰瘍病病原的鑒定中，以期將檢測(cè)性芯片推廣應(yīng)用到樹木潰瘍病生態(tài)監(jiān)測(cè)中。3.4用于環(huán)境污染檢測(cè)和防治3.4.1 污染源的檢測(cè)基因芯片可以快速大規(guī)模的檢測(cè)污染源，同時(shí)幫助尋找保護(hù)基因及能夠治理污染源的基因產(chǎn)品。如美國(guó)國(guó)立環(huán)境衛(wèi)生研究院的 Barrett 等構(gòu)建的名為 ToxChip 的

35、 DNA芯片，它可以同時(shí)檢測(cè)有害化學(xué)物質(zhì)對(duì)幾千個(gè)不同基因表達(dá)的影響，被認(rèn)為是毒理研究有力的工具。Stin等設(shè)計(jì)構(gòu)建了一種基于 16s DNA 區(qū)間的針對(duì)致病性弧菌的檢測(cè)芯片，通過(guò)對(duì) Chesapeake 港灣的水中各類弧菌的檢測(cè)、鑒定，甚至定量，從而非常方便地實(shí)現(xiàn)對(duì)水質(zhì)的變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)及季節(jié)變化規(guī)律預(yù)測(cè)。因此有環(huán)境學(xué)專家指出基因芯片技術(shù)以及基于芯片技術(shù)構(gòu)建的集樣本采集、加工處理、純化、檢測(cè)為一體的微縮實(shí)驗(yàn)室必將成為今后水源及相關(guān)環(huán)境檢測(cè)的主要工具。著著沿海經(jīng)濟(jì)建設(shè)速度的逐步加快和海洋開發(fā)活動(dòng)的日益頻繁，海洋環(huán)境污染問(wèn)題日漸凸顯，近岸海域常常出現(xiàn)水質(zhì)清潔度不達(dá)標(biāo)，水體嚴(yán)重富營(yíng)養(yǎng)化，營(yíng)養(yǎng)鹽失衡等海洋

36、生態(tài)的不健康狀態(tài)，因而進(jìn)行海洋生態(tài)毒理學(xué)的深入研究，探索出快速、準(zhǔn)確的污染檢測(cè)方法，將為海洋環(huán)境保護(hù)提供高水平的基礎(chǔ)支持，成為“持續(xù)發(fā)展”戰(zhàn)略的一種重要技術(shù)支撐。3.4.2 基因芯片污染防治上的應(yīng)用隨著現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展和污水排放、采礦冶煉、農(nóng)藥和化肥的大量施用等原因，以及土壤對(duì)污染物的累積富集作用，土壤污染日趨復(fù)雜化。土壤 Cd污染狀況不容樂(lè)觀。而且其進(jìn)入食物鏈后對(duì)人類的健康將產(chǎn)生嚴(yán)重的危害。隨著我國(guó)農(nóng)業(yè)栽培耕作方式趨于規(guī)?；图s化發(fā)展，除草劑的使用量日漸增大。我國(guó)是世界上水稻的生產(chǎn)大國(guó)，因此作為磺酰脲類除草劑中對(duì)水稻特異性較強(qiáng)的芐嘧磺隆在我國(guó)的使用量十分巨大。利用基因芯片技術(shù)，在 mR

37、NA 轉(zhuǎn)錄水平上研究 Cd、芐嘧磺隆（BSM）及其復(fù)合污染對(duì)水稻的基因應(yīng)答機(jī)制，能增加水稻對(duì)重金屬和有機(jī)污染物的耐受性。4存在問(wèn)題及展望一種技術(shù)總是從模糊走向精湛，進(jìn)而變得更為先進(jìn)，基因芯片技術(shù)就是如此。它在較短的時(shí)間里發(fā)展的速度，是其他技術(shù)都不可比擬的。基因芯片發(fā)展方向包括以下幾個(gè)方面: 第一， 現(xiàn)在cDNA 芯片需要大量的RNA ( l0ug 總RNA 或5OOng 的mRNA) ， 因此必需改進(jìn)RNA 的擴(kuò)增方法以分析更小量的RNA， 最終進(jìn)行單細(xì)胞表達(dá)分析； 第二，需發(fā)明新的更敏感的信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)； 第三， 芯片制備、樣品處理、雜交、檢測(cè)以及數(shù)據(jù)分析的標(biāo)準(zhǔn)化， 提高基因芯片的準(zhǔn)確性和可靠

38、性。盡管基因芯片技術(shù)還存在很多問(wèn)題， 但由于其具有并行化和高通量的特點(diǎn)， 它的應(yīng)用前景仍十分廣闊。我國(guó)基因芯片研究也緊跟國(guó)際前沿，力爭(zhēng)在此高新技術(shù)領(lǐng)域里有一席之地，它將對(duì)我國(guó)生命科學(xué)研究，醫(yī)學(xué)診斷，新藥篩選具有革命性的推動(dòng)作用，也將對(duì)我國(guó)人口素質(zhì)、農(nóng)業(yè)發(fā)展、環(huán)境保護(hù)等作出具大的貢獻(xiàn)，同時(shí)帶動(dòng)我國(guó)科學(xué)整體進(jìn)步，為各相關(guān)高科技產(chǎn)業(yè)創(chuàng)造機(jī)會(huì)?；蛐酒瑢⒊蔀?1世紀(jì)最令人注 目的高新技術(shù)領(lǐng)域之一，將使人類早日進(jìn)入生物信息時(shí)代。結(jié)論：基因芯片技術(shù)是2O世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)由分子生物學(xué)、物理學(xué)、微電子學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)等多學(xué)科交叉而形成的高新技術(shù)。基因芯片是一種最重要的生物芯片，它的工作原理與經(jīng)典的核酸

39、分子雜交方法是一致的， 都是應(yīng)用已知核酸序列作為探針與互補(bǔ)的靶核苷酸序列雜交， 通過(guò)隨后的信號(hào)檢測(cè)進(jìn)行定性與定量分析，經(jīng)過(guò)幾十年來(lái)的錘煉，技術(shù)不斷精湛起來(lái)，不僅在其他領(lǐng)域如生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、制藥學(xué)、司法，農(nóng)林業(yè)等領(lǐng)域上有廣泛的應(yīng)用，而且在環(huán)境保護(hù)學(xué)也是有極為廣闊的應(yīng)用。參考文獻(xiàn)：1 李 晨，黃 倢. 細(xì)菌檢測(cè)基因芯片的簡(jiǎn)述及其在水產(chǎn)上的應(yīng)用. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)J 2010,26(4):41-44.2 路 超，姜慧敏，張建峰等. 鎘和芐嘧磺隆復(fù)合污染脅迫對(duì)水稻的基因應(yīng)答機(jī)理的基因芯片分析J.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2013,32(3):426-431.3 張于光,李迪強(qiáng), 肖啟明等. 基因芯片及其在環(huán)境微生物研究中的應(yīng)用J.微生物學(xué)報(bào)，2004年6月，44卷3期.4 鐘 毅, 張 旭, 梁玉婷等. 基于基因芯片技術(shù)的石油污染土壤微生物群落結(jié)構(gòu)J. 清華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2010年, 第50卷 ,第9期.5 張于光,李迪強(qiáng),肖啟明等.基因芯片及其在環(huán)境微生物研究中的應(yīng)用J.微生物學(xué)報(bào),2004,44(3):406一410.