鏈霉素殘留酶聯(lián)免疫檢測試劑盒

1、鏈霉素殘留酶聯(lián)免疫檢測試劑盒 本試劑盒采用競爭酶標免疫法定量測定蜂蜜、肉類及牛奶中的鏈霉素殘留。試劑盒中包括了所有檢測用的試劑。該試劑盒有96個試驗孔包括標準試驗，如果進行定量分析，必須有微孔板酶標儀。1概要 鏈霉素是一種被廣泛應用于動物養(yǎng)殖的抗生素。高濃度的鏈霉素會產(chǎn)生耳毒性及危害腎臟功能等嚴重的副作用。為了保護消費者的身體健康,歐盟和美國規(guī)定在動物性食品中的鏈霉素殘留量牛奶不得超過200ppb, 蜂蜜不得超過20ppb，肌肉與肝臟不得超過500ppb。過去鏈霉素殘留一般采用氣相色譜法測定。但此方法昂貴又費時，酶聯(lián)免疫檢測試劑盒則可通過快速簡便的樣品制備，檢測蜂蜜、牛奶及組織中的鏈霉素。2測

2、定原理 測定的基礎(chǔ)是抗原抗體反應。微孔板包被有抗鏈霉素的抗體。加入鏈霉素酶標記物，鏈霉素標準或樣品溶液。游離鏈霉素與鏈霉素酶標記物競爭鏈霉素抗體結(jié)合位點（競爭性酶免疫分析）。沒有結(jié)合的鏈霉素酶標記物在洗滌步驟中被除去將酶基質(zhì)（過氧化脲）和發(fā)色劑/四甲基聯(lián)苯胺）；加入到孔中并且孵育。結(jié)合的鏈霉素酶標記物將無色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍色的產(chǎn)物。加入反應終止液后便顏色由益轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。在450nrn處測量（選擇參比波長600nm）。吸光度值與樣品中的鏈霉素濃度成反比。3試劑盒提供的試劑每一個盒中的試劑足夠進行96個測量（包括標準測定孔），盒中的材料如下：1X 96孔板 (12X8孔) 包被有抗鏈霉素抗體6X鏈

3、霉素標準液,2ml/瓶1X過化物酶標記的鏈霉素濃縮液（藍色溶液）1X底物（7ml）含有過氧化脲（粉紅色溶液）1X顯色劑（7ml）四甲基聯(lián)苯胺1X反應終止液（8ml）1M硫酸1X PBS濃縮液 (15ml),，用于酶標記物稀釋1X PBST濃縮液 (40ml)，加800ml蒸餾水稀釋，用于洗板4需要的材料但盒中不提供4l 設(shè)備微孔板酶標儀（450nm）一均質(zhì)器一離心機一恒溫培養(yǎng)箱一振蕩器10ml玻璃離心管一刻度移液管一50l，100l，1000l微量加液器42 試劑一正己烷一PBS-吐溫緩沖液 (0.55 g NaH2PO4 x H2O + 2.85 g Na2HPO4 x 2 H2O + 9

4、g NaCl + 0.1 % 吐溫-80, 加 1000 ml 雙蒸水）一肝組織處理液I：0.36M亞鐵氰化鉀X 3H2O一肝組織處理液II：1.04 M硫酸鋅X 7H2O5操作者應該注意之事項一反應停止液為IM硫酸，避免接觸皮膚一不要使用過了有效日期的試劑，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度的降低不要交換使用不同批號的盒中試劑6儲存條件一保存試劑盒子28不要冷凍。一無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。一將不用的微孔板放進原鋁箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封。7試劑變質(zhì)的跡象發(fā)色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質(zhì)，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.6個單位（A450nm）時表示試劑可能變質(zhì)

5、。8樣品處理樣品應當保存在陰涼避光之處及冷藏保存1. 取1 g蜂蜜，放入離心管中，加入4.5ml雙蒸水。2. 上下振蕩使之完全溶解。（建議用80熱水溫浴試管，溶解更快更充分）3. （原料蜜3000 g離心5分鐘）取上清50l進行分析。1. 用均質(zhì)器均質(zhì)樣品。2. 稱5g均質(zhì)過的樣品加入20ml PBS 吐溫緩沖液強力混勻。3. 室溫4000 g離心10分鐘。(高脂肪樣品需離心后取上層液體5ml加入3ml正己烷,強烈振蕩5分鐘。 室溫4000g離心10分鐘，去除頂部的脂肪層)。4. 取出上層液體用PBS-吐溫緩沖液稀釋1:10 （例50l樣品液加450l緩沖液）。5. 取50l進行分析。8.4

6、.肝臟樣品1如8.2-4稀釋后，移出4ml上清液至玻璃試管。2加II 溶液，再加入0.8ml雙蒸水，混勻幾秒鐘。3室溫4000g離心10分鐘。4同8.22高脂肪肉類樣品方法去除脂肪（去除上層2ml液體）。5取水相，用PBS-吐溫緩沖液1:8稀釋（例100l樣品液+700l吐溫緩沖液）。6取50 l 分析測定。1. 用PBS-吐溫緩沖液稀釋牛奶 1:20 (例. 50 l 牛奶 + 950 l 緩沖液)。2. 取50l上清液進行分析。 9酶標免疫分析程序（室溫2025條件下操作）9l測定之前注意事項1使用之前將所有試劑回升至重溫 2025。2使用之后立即將所有試劑放回28。3在使用中不要讓微孔干

7、燥。4在ELA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，仔細按照推薦的洗板順序操作是ELA測定程序中的要點。5在所有恒溫孵育過程應避免光線照射，用蓋子蓋住微孔板。 92 酶標記物與微孔板條a) 鏈霉素酶標記物為濃縮液。由于稀釋的酶標記物穩(wěn)定性不好，所以只稀釋實際需用量的酶標記物1：15稀釋（1l酶標液加14l PBS緩沖液）。在吸取濃縮液之前，要仔細地振搖，剩余的仍放置2-8保存。b) 微孔板條取出需用數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板用膠帶封好，放進原袋中重新密封，2-8保存。93 標準液提供的鏈霉素標準液濃度為0, 0.67, 2.0, 6.0, , ppb (ng/ml)94 測定程

8、序（室溫20-25條件下操作）a) 將足夠標準和樣品所用數(shù)量的孔條插入微孔架，標準和樣品做兩個平行實驗，記錄下標準和樣品的位置。倒出孔中的抗體液，用PBST洗滌三次。每次洗板應加入洗液后等2分鐘再倒掉。加入50l的標準液或處理好的樣品到各自的微孔中。加入100l稀釋的酶標記物到微孔底部，25-30孵育30分鐘。倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打（每行拍打3次）以保證完全除去孔中的液體，用250l PBST充入孔中，再次倒掉微孔中液體，再重復操作兩次。每次洗板應加入洗液后等2分鐘再倒掉。反應底物與顯色試劑以1:1混合后加入100l到微孔中，充分混合并在25-30暗處孵育30分鐘。加入50

9、l反應停止液到微孔中，混合好在450nm 處測量吸光度值，必須在加入停止液后10分鐘內(nèi)讀取光度值。10結(jié)果所獲得的標準和樣品吸光度值的平均值除以第一個標準（0標準）的吸光度值再乘以100，因此0標準等于100%并且以百分比的形式給出吸光度值。標準的吸光度值（或樣品）- 100 = %吸光度值0標準的吸光度值計算標準的值并繪成為一個對應鏈霉素濃度（ng/g或ng/ml）為半對數(shù)坐標系統(tǒng)曲線圖，校正曲線在-ng/g(ppb)范圍內(nèi)應當成為線性。相對應每一個樣品的濃度（ng/g或ng/ml）可以從校正曲線上讀出。請注意為了獲得樣品中的鏈霉素的實際濃度（ng/g）從校正的線上讀出的濃度位必須乘以相對應的稀釋系數(shù)當樣品處理過程是按指示進行的，稀釋系數(shù)如下；蜂蜜 5牛奶20肉類、組織 50 11靈敏度鏈霉素試劑盒的平均檢測下限約為0.5ppb。12特異性鏈霉素試劑盒的特異性通過對相應的物質(zhì)進行交叉反應性分析而得到。鏈霉素 100%與慶大霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、青霉素、四環(huán)素