石蠟切片免疫組化步驟

1、石蠟切片免疫組化步驟1. 石蠟切片放置在60恒溫箱中烘烤120分鐘。2.脫蠟和水化：二甲苯(20min)二甲苯(20min)無(wú)水乙醇(10min)95%乙醇(10min)90乙醇(10min)80%(10min)4.抗原修復(fù)：檸檬酸鈉緩沖液95度，10分鐘. (枸櫞酸三鈉3g枸櫞酸0.4g然后加水到950毫升左右，然后用NaOH或HCI調(diào)pH值6.0，最后定容在1000ml)5. PBS浸洗2次各5min6.加3%H2O2孵育5min(室溫或37度，避光)。肝組織過(guò)氧化物酶含量高。需增加濃度或增長(zhǎng)時(shí)間。蒸餾水洗2minx3次8.pbs-曲拉通通透（pv法不需要）9.與二抗種屬一致的血清封閉非特

2、異位點(diǎn)。（pv法不需要）9.滴加一抗4過(guò)夜10.PBS浸洗3次各5min11.滴加二抗室溫或37孵育30min12.PBS洗3次各5min15.DAB顯色520min，自來(lái)水充分涮洗16.蘇木素復(fù)染23min，自來(lái)水充分涮洗17.氨水反藍(lán)，過(guò)藍(lán)可用鹽酸酒精分化2s，自來(lái)水充分涮洗. 用稀氨水返藍(lán)，自來(lái)水里加幾滴稀氨水，就行了，返藍(lán)時(shí)間5分鐘左右，就很好看了;淡氨水有人用50ml自來(lái)水三四滴的氫氧化銨；18.脫水、透明80%(5min)90%(5min)95%(5min)100%(5min) 100%(5min)二甲苯(10min)二甲苯(10min)19.封片：中性樹脂，加蓋玻片(組織部位切勿

3、殘留小氣泡)，自然晾干二、操作流程1、脫蠟和水化脫蠟前，應(yīng)將組織芯片放在60恒溫箱中烘烤2h以上， 然后按以下流程進(jìn)行：二甲苯（1h）、二甲苯（30min）、100%酒精（30min）、95%酒精（15min）、70%酒精（15min）、50%酒精（15min）、蒸餾水（15min）2、3%H2O2，室溫封閉510分鐘，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。3、甩去H2O2，蒸餾水洗2min×3次。4、抗原熱修復(fù)：將切片置于裝有抗原修復(fù)液的玻璃容器中（耐高溫），進(jìn)入微波爐內(nèi)，容器內(nèi)液體溫度達(dá)到95100后斷電，連續(xù)三次。5、PBS沖洗5min×3次。6、5%BSA封閉液20min，甩

4、去。7、用0.1mol/L PBS稀釋一抗100倍，滴加后4過(guò)夜。8、 PBS沖洗2min×3次，滴加二抗37 20min，PBS沖洗2min×3次，滴加SABC 37 20min，PBS沖洗5min×4次，顯色劑顯色。9、自來(lái)水沖洗，封片，觀察。注意：如果需要做雙標(biāo)記法，則在操作完步驟8后，重復(fù)步驟38即可. 評(píng)分法。通過(guò)在光學(xué)顯微鏡下對(duì)組織切片分別按染色程度（03分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色）、陽(yáng)性范圍進(jìn)行評(píng)分（14分為025%、2650%、5175%、76100%），最終可以分?jǐn)?shù)相加，再進(jìn)行比較。1. 1、方法操縱不難，最大的易處是出現(xiàn)非常后果時(shí)怎樣

5、處理?這就需要把握免疫組化實(shí)行道理，每步曉得為何這樣做，這樣你才敢斗膽地變革先前的不合錯(cuò)誤的方法步驟。如抗體孵育條件次要是抗體濃度、溫度、時(shí)間，這三者通常為互相成反比的(相對(duì))，此中濃度是最重要的先決條件，溫度決定反應(yīng)的速率、時(shí)間決定反應(yīng)的量。就拿溫度來(lái)講，可以有4度、室溫、37度，我保舉4度最好，反應(yīng)最暖和，背景較淺；而37度反應(yīng)速度較快，時(shí)間較短；室溫我不太倡導(dǎo)，除非你每次都把情況溫度掌握在必然的范疇，不然，盡可能選擇前兩者。2、免疫組化最大的上風(fēng)是定位和定性。比擬于其他蛋白檢測(cè)方法，免疫組化具有定性靈活度高、定位較直接正確，是定位檢測(cè)分析尾選方法。特別對(duì)于有些因子的轉(zhuǎn)位研究十分有效。3、

6、免疫組化結(jié)果定量分析的條件是高質(zhì)量的染色切片。免疫組化結(jié)果也能定量分析，但必須是背景染色淺而特異性染色較深的情況下，分析最為準(zhǔn)確，這種原則可能也是我們平常審稿時(shí)鑒定研究結(jié)果的必備條件。4、免疫組化實(shí)驗(yàn)一定要設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)比通常為用必定表達(dá)這種抗原的切片來(lái)做；陰性對(duì)照一般是用PBS或非一抗替換一抗來(lái)進(jìn)行反應(yīng)，其他步驟均一致。前者是解除方法和實(shí)驗(yàn)體系有無(wú)問(wèn)題；后者是掃除有無(wú)一抗外的非特異性染色。5、免疫組化的應(yīng)用普遍，是當(dāng)前實(shí)驗(yàn)研究的最重要方法之一?，F(xiàn)在發(fā)SCI論文時(shí)，顯著覺得僅靠量化的數(shù)據(jù)來(lái)發(fā)文章很難，加一些形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)或圖片，老外十分接待，多是怕你學(xué)術(shù)造假吧。固然也不能做假陽(yáng)性或

7、假陰性結(jié)果。6、免疫組化技術(shù)掌握與否的審定尺度是同統(tǒng)統(tǒng)片或不同切片中不同抗原均從摸索濃度或條件而做出良好的染色切片。我在日常平凡帶教中就發(fā)現(xiàn)很多研究生把我已經(jīng)摸索很成生的反應(yīng)條件、濃度、方法步驟，反復(fù)使用于同一性子的切片和同一種抗體，做出來(lái)后就感覺本人已經(jīng)把握了免疫組化方法，調(diào)換一種抗體后，竟然連二抗的種屬來(lái)源都拿錯(cuò)了。失利常常促進(jìn)你去思測(cè)驗(yàn)驗(yàn)原理和過(guò)程，樂(lè)成有時(shí)也加速你自負(fù)。1、觀點(diǎn)戰(zhàn)經(jīng)常使用辦法先容1、界說(shuō)用標(biāo)記的特異性抗體對(duì)組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中某些化學(xué)成分的漫衍和含量進(jìn)行組織和細(xì)胞原位定性、定位或定量研究，這種技術(shù)稱為免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry)技術(shù)或免疫細(xì)胞

8、化學(xué)(immunocytochemistry)技術(shù)。2、原理按照抗原抗體反應(yīng)和化學(xué)顯色道理，組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的抗本來(lái)和一抗結(jié)合，再操縱一抗與標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟生物素、熒光素等的二抗進(jìn)行反應(yīng)，前者再用符號(hào)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AKP)等的抗生物素(如鏈霉親和素等)結(jié)合，最后通過(guò)呈色反應(yīng)或熒光來(lái)顯現(xiàn)細(xì)胞或組織中化學(xué)身分，在光學(xué)顯微鏡或熒鮮明微鏡下可清楚瞥見細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)品，從而可以在細(xì)胞爬片或組織切片上原位肯定某些化學(xué)成分的散布和含量。3、分類1)按標(biāo)記物質(zhì)的種類，如熒光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶)、鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫熒光法、放射免

9、疫法、免疫酶標(biāo)法和免疫金銀法等。2)按染色步驟可分為直接法(又稱一步法)和間接法(二步、三步或多步法)。與直接法相比，間接法的靈敏度提高了許多。3)按結(jié)合方式可分為抗原-抗體結(jié)合，如過(guò)氧化物酶-抗過(guò)氧化物酶(PAP)法；親和毗連，如蛋白素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(ABC)法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶保持(SP)法等，個(gè)中SP法是比較常用的方法；聚合物鏈接，如即用型二步法，此方法尤其適合于內(nèi)源性生物素含量高的組織抗原檢測(cè)。4、現(xiàn)在幾種常用免疫組化方法簡(jiǎn)樸引見1)免疫熒光方法是最早成立的免疫組織化學(xué)技術(shù)。它哄騙抗原抗體特異性結(jié)合的原理，先將已知抗體標(biāo)上熒光素，以此作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的

10、相應(yīng)抗原，在熒光顯微鏡下考察。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激起光的照耀后即會(huì)收回一定波長(zhǎng)的熒光，從而可肯定組織中某種抗原的定位，進(jìn)而還可進(jìn)行定量分析。由于免疫熒光技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡(jiǎn)潔，所以在臨床病理診斷、查驗(yàn)中利用較廣。2)免疫酶標(biāo)方法免疫酶標(biāo)方法是繼免疫熒光后，于60年月成長(zhǎng)起來(lái)的技術(shù)?；鶃?lái)源根基理是先以酶標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞作用，然后到場(chǎng)酶的底物，天生有色的不溶性產(chǎn)品或具有一定電子密度的顆粒，通過(guò)光鏡或電鏡，對(duì)細(xì)胞輪廓和細(xì)胞內(nèi)的各類抗原成分進(jìn)行定位研究。免疫酶標(biāo)技術(shù)是今朝最常用的技術(shù)。本方法與免疫熒光技術(shù)相比的主要長(zhǎng)處是：定位精確，比照度好，染色標(biāo)本可持久留存，合適于光、電鏡

11、研究等。免疫酶標(biāo)方法的開展十分敏捷，已經(jīng)衍生出了多種標(biāo)記方法，且隨著方法的精益求精和立異，其特異性和敏捷度都在不息提高，使用也愈來(lái)愈便當(dāng)。今朝在病理診斷中廣為使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法檢測(cè)系統(tǒng)等。3)免疫膠體金技術(shù)免疫膠體金技術(shù)是以膠體金這樣一種特別的金屬顆粒作為標(biāo)記物。膠體金是指金的水溶膠，它能疾速而不變地吸附蛋白，對(duì)蛋白的生物學(xué)活性則沒(méi)有顯著的影響。是以，用膠體金標(biāo)記一抗、二抗或其他能特異性結(jié)合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作為探針，就能對(duì)組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)行定性、定位，甚至定量研究。由于膠體金有不同巨細(xì)的顆粒，且膠體金的電子密度高，所以避免疫膠體金技術(shù)分外得當(dāng)于

12、免疫電鏡的單標(biāo)記或多標(biāo)記定位研究。由于膠體金本身呈濃至深白色，因此也適合進(jìn)行光鏡窺察。如運(yùn)用銀加強(qiáng)的免疫金銀法例更便于光鏡視察。5、被檢測(cè)的物資組織或細(xì)胞中但凡能作為抗原或半抗原，如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等都可用相應(yīng)的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)。6、特性1)特異性強(qiáng)。免疫學(xué)的根本原理決定抗原與抗體之間的結(jié)合具有高度特異性，因此，免疫組化從理論上講也是組織細(xì)胞中抗原的特定顯示，如角蛋白(keratin)顯示上皮成分，LCA顯示淋巴細(xì)胞成分。只有當(dāng)組織細(xì)胞中存在交叉抗原時(shí)，才會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)。2)敏感性高。在利用免疫組化的肇端階段，由于手藝上的限定，只有直接法、直接法

13、等敏感性不高的手藝，當(dāng)時(shí)的抗體只能稀釋幾倍、幾十倍；而今因?yàn)锳BC法或SP三步法的出現(xiàn)，使抗體稀釋上千倍、上萬(wàn)倍乃至上億倍仍可在組織細(xì)胞中與抗原結(jié)合，這樣高敏感性的抗體抗原反應(yīng)，使免疫組化方法愈來(lái)愈便利地運(yùn)用于通例病理診斷事情。3)定位正確、形狀與功用相結(jié)合。該技能通過(guò)抗原抗體反應(yīng)及呈色反應(yīng)，可在組織和細(xì)胞中進(jìn)行抗原的精確定位，因此可同時(shí)對(duì)差別抗原在統(tǒng)一組織或細(xì)胞中進(jìn)行定位調(diào)查，這樣就能夠進(jìn)行形態(tài)與功效相結(jié)合的研究，對(duì)病理學(xué)范疇展開深切研究是非常成心義的。7、從蛋白程度檢測(cè)角度，免疫組化技術(shù)與Western blotting、ELISA的異同1)Western blotting：蛋白質(zhì)免疫印跡

14、，也是操縱抗體抗原反應(yīng)原理，結(jié)合化學(xué)發(fā)光等技術(shù)來(lái)檢查組織或細(xì)胞樣品內(nèi)蛋白含量的檢測(cè)方法。與免疫組化技術(shù)相比，定量可能越發(fā)準(zhǔn)確；當(dāng)然Western blotting也可定性和定位(通過(guò)提取膜蛋白或核蛋白、胞漿蛋白離別檢測(cè)其中抗原含量，進(jìn)而間接反應(yīng)它們的定位)，但敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于免疫組化技術(shù)。2)ELISA：酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)，也是使用抗體-抗原-抗原結(jié)合反應(yīng)原理來(lái)檢查體液或組織勻漿中蛋白含量的檢測(cè)。與免疫組化技術(shù)相比，定量最正確，是排泄性蛋白檢測(cè)首選方法之一。實(shí)驗(yàn)流程簡(jiǎn)介1、SP三步法1)石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。2)0.3%或3%H2O2去離子水(無(wú)色液體)孵育10-30分鐘，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶

15、活性。3)蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘4)候選步調(diào)：采取抗原建復(fù)：微波(發(fā)起30分鐘內(nèi)4次中水)、高壓、酶修復(fù)要領(lǐng)。天然熱卻，再用3分鐘×3次.5)血清封閉：室溫15-30分鐘，盡量與二抗來(lái)歷分歧。傾往，勿洗。6)滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，37孵育23小時(shí)或4過(guò)夜(最好復(fù)溫)。PBS沖洗，3分鐘×5次。7)滴加生物素標(biāo)志的二抗，室溫或37孵育30分鐘-1h。8)PBS沖洗，3分鐘×5次。9)滴加SP(鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶)，室溫或37孵育30分鐘-1h。10)PBS沖洗，3分鐘×5次。11)顯色劑顯色(DAB等)。12)自來(lái)水充裕沖洗。13)可進(jìn)止復(fù)染，

16、脫水，通明。14)選擇適當(dāng)?shù)姆馄瑒┓馄?、即用型二步法1)脫蠟、水化組織切片。2)根據(jù)所應(yīng)用的一抗的非凡要求，對(duì)組織切片進(jìn)行預(yù)處置。3)0.3%或3%H2O2去離子水孵育5分鐘-30分鐘，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS或TBS沖洗。4)滴加一抗，室溫或37孵育3060分鐘，或4留宿，PBS或TBS浸洗3分鐘×5次。5)滴加enhangcer加強(qiáng)劑，37度30min，PBS或TBS浸洗3分鐘×5次。6)滴加通用型IgG抗體-Fab段-HRP多聚體，室溫/37孵育30分鐘-1h，PBS/TBS沖洗，3分鐘×5次。7)應(yīng)用DAB溶液顯色。8)蒸餾水沖洗、復(fù)染、脫水、透

17、明、封片。3、免疫熒光技術(shù)(略)樞紐環(huán)節(jié)分解(較前有所更新)1、酶免疫組化的環(huán)節(jié)環(huán)節(jié)1)標(biāo)本固定：固定的目的是防止標(biāo)本從玻片上脫落；除去防礙抗原-抗體結(jié)合的類脂，使抗原抗體結(jié)合物易于取得杰出的染色結(jié)果；固定的標(biāo)本易于保存。固定劑的選擇一般用4%多聚甲醛，但睪丸組織、眼可能要選用Bouin's液或mDF液效果較好。2)脫水、石蠟包埋和制片：脫水用梯度乙醇(由低到高)充分脫水、對(duì)組織要完全浸蠟、切片時(shí)刀片要干凈和厲害。否則，容易裂片和脫片等。3)脫蠟和水化：這是為了前面的抗體等試劑可以或許充實(shí)與組織中抗原等結(jié)合反映。脫蠟可以先60度20min，然后當(dāng)即二甲苯1-3別離10min(這個(gè)時(shí)間是

18、由二甲苯新穎水平和室溫等綜開決議的)，但當(dāng)天造好的切片一般先60度3-4h。水化用梯度乙醇(由高到低)。若脫蠟和shui化不全易出現(xiàn)局灶性回響反映和浸洗不齊，而產(chǎn)生非特異性后臺(tái)著色。4)抗原修復(fù)：因?yàn)榻M織中部門抗原在甲醛或多散甲醛牢固進(jìn)程中，發(fā)作了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉感化，從而落空抗原性；通過(guò)抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決意族從頭表露，進(jìn)步抗原檢測(cè)率。常用的修復(fù)方法從強(qiáng)到弱一般分為三種，高壓修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)。修復(fù)液也分為多少種(詳細(xì)的可以查閱相干材料，年夜量的：中性的、高pH的等)。我們實(shí)行室一般用微波修復(fù)中火6min*4次，效果不錯(cuò)。留意微波修復(fù)后天然冷卻30min閣下(只要你感覺修

19、復(fù)液的溫度達(dá)室溫便可)。5)細(xì)胞通透：目標(biāo)是使抗體可以或許充分地進(jìn)入胞內(nèi)進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。一般用Triton X-100、蛋白酶k等通透液。如Triton X-100可以消融細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜、細(xì)胞器膜上的脂質(zhì)而使抗體及大分子構(gòu)造的物質(zhì)進(jìn)入胞漿和胞核內(nèi)，故在細(xì)胞免疫組化時(shí)尤為保舉使用，這樣抗體就可以順?biāo)爝M(jìn)入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。在免疫組織化學(xué)(10um厚切片)和免疫細(xì)胞化學(xué)中一般用Triton X-100作為細(xì)胞通透劑，在膜上打孔。同時(shí)也是一種去污劑，一般在PBS中插足后終濃度是0.05%即可，而前者末濃度是0.5%-1%。石蠟切片4um左左可以欠亨透，因?yàn)榧?xì)胞曾經(jīng)被切開了。6)滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和

20、生物素：在傳統(tǒng)的ABC法和SP法中，免疫組化反應(yīng)結(jié)果容易支到內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素的干擾，必須用過(guò)氧化氫和卵白素等進(jìn)行滅活。滅活內(nèi)源性POD一般3%過(guò)氧化氫滅活時(shí)間短點(diǎn)，可以10min左右，而0.3%過(guò)氧化氫則可以適當(dāng)延長(zhǎng)封閉時(shí)間，一般1030min；用甲醇配置過(guò)氧化氫比雙蒸水或PBS可能好在回護(hù)抗原和固定組織作用，過(guò)氧化氫孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易引起脫片；現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后4度避光保存。不過(guò)，目下當(dāng)今已有"第二代即用型免疫組化試劑盒"避免內(nèi)源性生物素的干擾，引薦使用。7)血清封閉：組織切片上有盈余的位點(diǎn)可以與一抗非特異性結(jié)合，造成后絕結(jié)果的假陽(yáng)性；封閉血清一般是和二抗同一來(lái)歷的，血

21、清中動(dòng)物本身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合；也能夠用小牛血清、BSA、羊血清等，但不克不及與一抗來(lái)源一致。一般室溫10-30min。但也要防止封閉過(guò)分8)一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間：一抗孵育條件在免疫組化反應(yīng)中最重要，包羅孵育時(shí)間、溫度和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果最佳；孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37度1-2h，而4度過(guò)夜和從冰箱拿出后37度復(fù)溫45min。具體條件還要摸索。二抗孵育條件：二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時(shí)間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度。但在免疫組化中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間先定

22、下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間。建議一抗反應(yīng)在4度最佳，反應(yīng)溫文，但時(shí)間最好超過(guò)1624h。9)抗體稀釋液：其實(shí)許多實(shí)驗(yàn)室抗體稀釋液就用一般PBS即可，但專用的抗體稀釋液中除PBS成分外，還加了疊氮化鈉防腐劑、BSA穩(wěn)定劑等組份，反抗體的多次收受接管行使較好。正因?yàn)檫@種原因，我一向用國(guó)產(chǎn)的公用抗體稀釋液，一段時(shí)間在更換新抗體稀釋液時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)了陰性結(jié)果(提醒可能一抗沒(méi)有結(jié)合)，最后從抗體濃度和孵育時(shí)間、封閉時(shí)間等原因排除后，發(fā)現(xiàn)是新抗體稀釋液的PH值偏酸，而使抗原抗體反應(yīng)不佳，終而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。10)切片清洗(浸洗、沖洗和漂洗)：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，以是適本地

23、增強(qiáng)清洗(延長(zhǎng)時(shí)間和增屢次數(shù))尤其重要，我一般在一抗孵育前的洗濯是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。留意：?jiǎn)为?dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。溫順沖洗，防止切片的脫落。我喜好用浸洗方法；沖洗的時(shí)間要充足，才氣完全洗來(lái)結(jié)合的物資。PBS的PH和離子強(qiáng)度的運(yùn)用和要供。這方面我有慘重教導(dǎo)，其時(shí)我買的抗體稀釋液偏酸，成績(jī)配景一片黃(未見特異性染色)，建議PH在7.4-7.6濃度是0.01M。(中性及弱鹼性條件(PH7-8)有益于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于剖析；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利于合成)11)DAB顯色：背景的深淺和特異性染色的深淺都可以由DA

24、B孵育條件決定。DAB顯色時(shí)間不是固定的，首要由顯微鏡下節(jié)制顯色時(shí)間，到出現(xiàn)特異性染色較強(qiáng)而本底著色較淺時(shí)即可沖洗；DAB顯色時(shí)間很短(如幾秒或幾十秒)就出現(xiàn)很深的棕褐色，這極可能說(shuō)明你的抗體濃度太高或抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，需要下調(diào)抗體濃度或縮短你的抗體孵育時(shí)間；另外，若很短時(shí)間就出現(xiàn)背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長(zhǎng)封閉時(shí)間；DAB顯色時(shí)間很長(zhǎng)(如跨越十幾分鐘)才出現(xiàn)陽(yáng)性染色，一方面可能說(shuō)明你的抗體濃度太低或孵育時(shí)間太短(最好一抗4度過(guò)夜)；另一方面就是封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。12)復(fù)染：目的是形成細(xì)胞輪廓，從而更好地對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位，常常用蘇木素復(fù)染(胞核染料)。注意蘇木素復(fù)染時(shí)

25、間要看當(dāng)時(shí)的室溫、溶液的新舊、目標(biāo)抗原的定位等情況，一般數(shù)秒-數(shù)分鐘，胞漿蛋白可以適事先間長(zhǎng)一點(diǎn)，而胞核蛋白則要短。不過(guò)這個(gè)如果染色不睬想可以彌補(bǔ)的。方法是：染色深則分化時(shí)間稍長(zhǎng)些即可；染色淺則再置于蘇木素中染色即可。鹽酸酒精是分化，氨水是返蘭。作用不同。片子復(fù)染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒精中數(shù)秒(一定動(dòng)作要快)后拿出流水振洗，在放入氨水中返蘭即可。13)封片：為了歷久保存，我們一般用中性樹膠等封片，避免產(chǎn)生機(jī)泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對(duì)面的誰(shuí)人拐角，接近封片液近真?zhèn)€拐角先降低，直至接觸到液體時(shí)為止；當(dāng)發(fā)現(xiàn)液體接觸面在接續(xù)彌散時(shí)，則可以遲緩

26、降低另一拐角，這樣一般不會(huì)產(chǎn)生氣泡。2、免疫熒光方法中的重要環(huán)節(jié)1)冰凍切片制備：建議用新陳組織，否則組織細(xì)胞內(nèi)部布局粉碎，易使抗原彌散。選用潔凈尖利的刀片、組織必定要冷凍適度等，防止裂片和脫片寬重。2)組織切片固定：切好片風(fēng)干后立刻用冰丙酮等固定液進(jìn)行固定5-10min，尤其要較長(zhǎng)時(shí)間保存的白片，一定要實(shí)時(shí)固定和適當(dāng)保存。3)血清封閉：為防止內(nèi)源性非特異性蛋白抗原的結(jié)合，需要在一抗孵育前先用血清(與二抗起原同等)封閉，削弱背景著色。血清封閉的時(shí)間是可以調(diào)整的，一般10-30min。4)一抗孵育條件：在免疫組化反應(yīng)中最重要，包孕孵育時(shí)間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，個(gè)中4

27、度效果最佳；孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有閉，一般37度1-2h，而4度過(guò)夜和從冰箱拿出后37度復(fù)溫45min。具體條件還要試探。5)二抗孵育條件：二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時(shí)間需要摸索，而濃度一般有工作液，如果稀釋液還要摸索濃度，切紀(jì)要避光反應(yīng)。但在免疫熒光中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間。最后，熒光素標(biāo)記的二抗跟著生存時(shí)間的延長(zhǎng)，可能后有大量的游離熒光素殘留，需要注重配制時(shí)小包裝和并進(jìn)行適當(dāng)?shù)碾x古道熱腸。6)復(fù)染：目標(biāo)是形成細(xì)胞表面，從而更好地對(duì)方針蛋白進(jìn)行定位。一般常用DAPI復(fù)染。7)封片：為了恒久保存，我們一般用緩沖苦油等封片，此外

28、還有專門的抗熒光萃滅封片液。避免產(chǎn)活力泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一腳拿劈面的阿誰(shuí)拐角，靠近封片液遠(yuǎn)真?zhèn)€拐角先降低，直至接觸到液體時(shí)為止；當(dāng)發(fā)現(xiàn)液體打仗面在不休彌散時(shí)，則可以遲緩降低另一拐角，這樣一般不會(huì)產(chǎn)氣憤泡。8)切片清洗：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗(延長(zhǎng)時(shí)間和增加次數(shù))尤為重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。注意(1)單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。(2)溫柔沖洗，防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式；(3)沖洗的時(shí)間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。(4)PB

29、S的PH和離子強(qiáng)度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓(xùn)，當(dāng)時(shí)我買的抗體稀釋液偏酸，結(jié)果背景一片黃(未見特異性染色)，建議PH在7.4-7.6濃度是0.01M。(中性及弱鹼性條件(PH7-8)有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利于分解)9)攝影：有條件的話最好當(dāng)即拍照，若不能實(shí)時(shí)照相，也要封好片和用指甲油封固，連結(jié)避光和干度。使用熒光顯微鏡注意嚴(yán)酷依照熒光顯微鏡出廠說(shuō)明書要求進(jìn)行操作，不要隨便改動(dòng)法式；應(yīng)在暗室中進(jìn)行查抄；防止紫外線對(duì)眼睛的侵害，在調(diào)整光源時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡；搜檢時(shí)間每次以12h為好，凌駕90min，超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐步

30、降落，熒光削弱；標(biāo)本受紫外線映照35min后，熒光也明明減弱或退色；激起光長(zhǎng)時(shí)間的照耀，會(huì)發(fā)生熒光的衰加和淬滅現(xiàn)象；所以最多不得超過(guò)23h；熒鮮明微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集合搜檢，以節(jié)流時(shí)間，庇護(hù)光源。天熱時(shí)，應(yīng)加風(fēng)扇散熱降溫，新?lián)Q燈膽應(yīng)從最先就記實(shí)使用時(shí)間。燈燃燒后欲再啟用時(shí)，須待燈光充分冷卻后才能點(diǎn)燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次撲滅光源。封閉汞燈最少在開啟15-30分鐘后；標(biāo)本染色后立即觀測(cè)，因時(shí)間暫了熒光會(huì)逐步減弱。若將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中4保存，可延緩熒光減弱時(shí)間，防止封裱劑蒸發(fā)；使用的玻片等載體，都必須厚度勻稱，無(wú)顯明的自覺熒光，如果使用油鏡，還必須包管鏡油為無(wú)熒光鏡油；電源最好裝穩(wěn)壓器，否

31、則電壓不穩(wěn)不但會(huì)降低汞燈的壽命，也會(huì)影響鏡檢的效果。3、免疫組化和免疫熒光成果闡明：見第一場(chǎng)實(shí)驗(yàn)講座。案例一DAB染色后切片著色一片黃/背景深背景：奧運(yùn)會(huì)時(shí)代我們課題組研究生都在實(shí)驗(yàn)室做實(shí)驗(yàn)，許多從北京采辦的試劑買不到，對(duì)我們的許多實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了很大的影響。我以前一向用中杉金橋的SP三步法染色試劑盒，效果不錯(cuò)，在奧運(yùn)會(huì)時(shí)期我籌辦做同批實(shí)驗(yàn)分不同批次酶免疫組化實(shí)驗(yàn)，第一批組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果很好，抗體濃度感受比較符合(Santa Cruz公司1：200)，等做第二批時(shí)發(fā)現(xiàn)封閉血清不夠了，為了保證實(shí)驗(yàn)順?biāo)爝M(jìn)行，我又從禍州邁新頂了一個(gè)SP試劑盒，同時(shí)抗體稀釋液也不夠了，我又從新從專士德公司買了一小瓶10ml。從

32、第二批實(shí)驗(yàn)開端，組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果不斷顯示強(qiáng)背景著色，特異性染色很難分辨。問(wèn)題及其解答：產(chǎn)生組織切片非特異性染色的原因有哪些?如何解決?1、抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過(guò)縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來(lái)控制。這是最重要的一條。2、一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。3、內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高(含血細(xì)胞多的組織)，需要通過(guò)延長(zhǎng)滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來(lái)降低背景染色；4、非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過(guò)延長(zhǎng)二抗來(lái)源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來(lái)加強(qiáng)封閉效果；5、DAB孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或濃度太高；6、PBS沖洗不充分，殘留抗

33、體結(jié)果加強(qiáng)著色，在一抗/二抗/SP孵育后的浸洗尤為重要；7、標(biāo)本染色過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。我的實(shí)踐解決方案：以上的剖析可能對(duì)付初學(xué)者仍是不簡(jiǎn)單的，上面我就把我的清掃嘗試的具體過(guò)程與各人進(jìn)行分享、交換和會(huì)商。1、起首清除抗體孵育條件。一般來(lái)講，著色效果的黑白與抗體的孵育條件是稀弗成分的，由于用SP法已做出來(lái)過(guò)一次且效果不錯(cuò)，因而對(duì)于一樣組織的同一抗原進(jìn)行分析，這種因素可以先清掃。2、其次，DAB孵育時(shí)候是不是太少?做出去那一次我是孵育8min，厥后也是8-10min，我零丁做了一次嘗試來(lái)解除該身分。成果孵育2、5min時(shí)先泛起布景，而特異性染色較淺，故那沒(méi)有契合常理，普通先

34、出現(xiàn)特同性染色，然后跟著工夫的耽誤，會(huì)呈現(xiàn)非特同性后臺(tái)著色。3、最后，血清封閉的問(wèn)題?從前我一般孵育15-30min，所以我單獨(dú)做了一次實(shí)驗(yàn)用血清封閉室溫1h，其它條件同做出來(lái)的那一次，結(jié)果也一樣背景著色很深。4、此外，我在改良的同時(shí)，也對(duì)PBS清洗不竭地延長(zhǎng)時(shí)間和增加次數(shù)，乃至完全參照試劑盒仿單來(lái)進(jìn)行操作(我之前一般一抗4度過(guò)夜且室溫復(fù)溫45min、二抗37度30min、SP反應(yīng)37度30min)，和過(guò)氧化氫滅活加強(qiáng)等等均未起到效果。我沉著地分析了一下整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程，與第一次做出來(lái)比擬，只有兩個(gè)處所做了竄改：因血清不敷而改換了不同廠家試劑盒、因抗體稀釋液用完而從頭買了抗體稀釋液。5、我用PBS

35、替換一抗稀釋液(我之前借收受接管抗體，自我以為抗體稀釋液中含防腐劑和蛋白不變劑)，別的步調(diào)和組織切片完整與第一次做出來(lái)的一致(包羅血清也是老試劑盒內(nèi)殘剩的一點(diǎn))，古跡出現(xiàn)了：成效很好。-由于抗原抗體反應(yīng)除溫度、抗原/抗體濃度中，然后就是PH值，因而我測(cè)了新抗體稀釋液、老抗體稀釋液和PBS的PH值，了局是前者偏酸性(6、0)，然后二者均在7、5閣下。6、看來(lái)重要禍端是抗體稀釋液的PH值出問(wèn)題了，因而我又用PBS替換抗體稀釋液和新試劑盒內(nèi)的試劑對(duì)組織切片做了免疫組化，效果照舊沒(méi)有做出來(lái)：背景很深。這實(shí)把我搞慘了。莫非另有什么緣故原由嗎?通過(guò)細(xì)心分析：一抗必然是結(jié)合上去了(老SP試劑盒結(jié)果很好)，題

36、目是二抗沒(méi)有結(jié)合上去也差池(因?yàn)樽詈蟊尘昂苌睿@闡明二抗可能也結(jié)合上去了)，DAB孵育時(shí)間此刻只用1、5min也是背景深而特異性染色淺，那我又思疑封閉血清了。7、我做了兩張切片：一張用老試劑盒內(nèi)還剩下一點(diǎn)的血清而另一張用新試劑盒內(nèi)的封閉血清，別的試劑(二抗、SP)均用新試劑盒供給的，結(jié)果是前一張效果很好，爾后一張能夠看到特異性染色，但背景太深，拍照效果欠安。-看來(lái)封閉血清也是功會(huì)罪魁之一。結(jié)果分析表現(xiàn)：抗體稀釋液的PH值偏低和封閉血清的shi效導(dǎo)致了我的免疫組化結(jié)果的不佳，看大師在今后的組化實(shí)驗(yàn)中也要注意這兩個(gè)不太惹人注意的要害問(wèn)題。-凄慘的教訓(xùn)，值得引覺得鑒。案例二DAB染色后切片著色呈陽(yáng)性

37、后果背景：實(shí)在免疫組化在DAB染色后一般有四種情形：陽(yáng)性染色效果很好、陰性染色、非特異性染色很深、陰陽(yáng)臉(染色不平均)。而陰性染色是很多初學(xué)者常常碰到的頭痛問(wèn)題。我身旁有個(gè)研討生同窗在我們真驗(yàn)室初度涉入免疫組化，傳聞步驟不難，跟我背面做了幾回以后，就本身起頭做了，持續(xù)做了三次，結(jié)果均是陰性染色。很失望，不知是什么緣由招致的。問(wèn)題及其解問(wèn)：免疫組化染色呈陰性結(jié)果的原因有哪些?1、抗體濃度和質(zhì)量問(wèn)題和抗體來(lái)源選擇毛病。不知抗體是入口的照樣國(guó)產(chǎn)的工作液，怎樣這么高稀釋度也沒(méi)能做出陽(yáng)性結(jié)果?另外，不是抗體濃度越高就越易出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，抗原抗體反應(yīng)有前帶和后帶效應(yīng)，必需探索最佳濃度。2、抗原修復(fù)不全，對(duì)甲

38、醛固定的組織必需用充分抗原修復(fù)來(lái)翻開抗原表位，以利于與抗體結(jié)合；建議微波修復(fù)用高火4次*6min嘗嘗。有人做過(guò)實(shí)驗(yàn)，這是最佳的時(shí)間和次數(shù)。若不可，還可高壓修復(fù)。3、組織切片自己這種抗原含量低；4、血清封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。5、DAB孵育時(shí)間過(guò)短。6、細(xì)胞通透不全，抗體已能充實(shí)進(jìn)進(jìn)胞內(nèi)介入反應(yīng)。7、入手下手做免疫組化，我建議你一定要首先做個(gè)陽(yáng)性對(duì)照片，排除抗體等外的方法問(wèn)題。我的現(xiàn)實(shí)辦理計(jì)劃：1、起首，破除組織切片內(nèi)的抗原有沒(méi)有喪失及其含量幾多。免疫組化中兩個(gè)最緊張的身分是抗原和抗體。(1)抗原有沒(méi)有丟得首要看組織切片的奇怪水平，一般切片室溫保留超越3-6個(gè)月，可能切片內(nèi)的抗原丟掉很嚴(yán)峻(有文獻(xiàn)撐持)，

39、此時(shí)可以通太重新用白臘塊切片來(lái)進(jìn)一步考證(蠟塊需要高溫留存)。(2)白臘切片在建造歷程中大概果醛基對(duì)立原決定族的封閉，這需要通過(guò)抗原修復(fù)來(lái)充裕露出，從而刪加抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，提高陽(yáng)性率，我一般用6min*4次中火微波抗原修復(fù)，用枸櫞酸鈉緩沖液。(3)組織切片中自己抗原含量的幾?這方面我有經(jīng)驗(yàn)的，我做胎鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞判定，用1：200一抗效果很好；但我用1：200一抗孵育成年睪丸間質(zhì)細(xì)胞檢測(cè)，幾近呈陰性，后來(lái)證明是由于二者抗原含量相差甚近，則一抗也要適當(dāng)進(jìn)步濃度。2、其次，檢查抗體有無(wú)選擇錯(cuò)誤和抗體孵育條件能否不適。(1)一抗選擇單克隆抗體易出現(xiàn)陰性結(jié)果，因?yàn)殪`敏度低但特異性好；一抗的speci

40、es reactivity中無(wú)檢測(cè)組織的種屬，這是比較常見的錯(cuò)誤；一抗選擇rat，而二抗是抗mouse/rabbit等均有可能出現(xiàn)陰性結(jié)果。(2)抗體孵育時(shí)間過(guò)短，容易導(dǎo)致陰性結(jié)果。一般一抗我建議4度孵育過(guò)夜和37度復(fù)溫45min；二抗我一般37度30min。我不喜歡參照二抗染色試劑盒說(shuō)明書。(3)抗體濃度過(guò)低。這是陰性結(jié)果的最可能原因。必須提高稀釋度，我一般首次做一種新抗體，必須先用說(shuō)明書建議的低濃度和高濃度做一次，然后決定是向高照樣低標(biāo)的目的摸索。一般先決定二抗的濃度(工作液就好辦了，直接滴加)，重點(diǎn)摸索一抗的最適濃度。注意：免疫反應(yīng)中存在前帶和后帶效應(yīng)，這提醒不是濃度越高，陽(yáng)性率就越高，

41、反之亦然。(4)重要原因排除之后，也不要無(wú)視抗體的質(zhì)量：原裝抗體一般比較穩(wěn)固，效果較好；而入口分裝次之；工作液可能要注意質(zhì)量問(wèn)題。3、同時(shí)，DAB的孵育時(shí)間可能要適當(dāng)延長(zhǎng)，在鏡下察看，偶然可延長(zhǎng)至30min。但一般3-10m in最好，此時(shí)背景也較淺。可則，申明抗體濃度不適宜。4、最初，血渾封閉時(shí)間也可響應(yīng)縮短。一般10-30min，但這個(gè)時(shí)間可以調(diào)解，啟閉主如果下降切片的整體配景著色。5、此外，細(xì)胞通透也不成輕忽。很多戰(zhàn)友以為石蠟切片一般不需細(xì)胞通透，因?yàn)榍衅瑫r(shí)可能已經(jīng)把細(xì)胞切開了，但對(duì)于胞核蛋白，建議照舊通透一下，增進(jìn)抗體等試劑充分進(jìn)入到場(chǎng)反應(yīng)。6、以上原因，都是針對(duì)現(xiàn)實(shí)中常見原因來(lái)進(jìn)行分

42、析的，條件是排除操作者的操作錯(cuò)誤而引起陰性結(jié)果，這就需要新手仍是要設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照以排除方法的問(wèn)題。還有抗體稀釋液的PH值過(guò)低等其它原因的滋擾?？傊?，要想把免疫組化做好，可能每個(gè)環(huán)節(jié)都很重要，但也存在主次之分，出現(xiàn)問(wèn)題了，需要通過(guò)先排除主要的，再順次排除主要的-這是權(quán)衡你對(duì)免疫組化原理把握與否的樞紐地點(diǎn)。案例三石蠟切片免疫熒光染色呈陰性結(jié)果或非特異性結(jié)果背景：因?qū)嶒?yàn)需要，于2008年07月04日初次做肝臟組織ZO-1(一種胞膜蛋白，慎密毗鄰蛋白)免疫熒光染色，以前我對(duì)酶免疫組化很是熟習(xí)，在園子內(nèi)也有很多置頂貼和精髓帖，但免疫熒光一直還沒(méi)做過(guò)(原理知道，但細(xì)節(jié)不太認(rèn)識(shí))。我先用石蠟切片做了5次，結(jié)果

43、不停不幻想(表示為未見特異性強(qiáng)染色)；近幾日，我又切了冰凍切片，做了2次，終究根基成功了。在這個(gè)過(guò)程中，我對(duì)免疫熒光染色技術(shù)有了全新的熟悉，而前些天發(fā)出免疫熒光乞助揭，答復(fù)的很少，所以有需要加強(qiáng)對(duì)免疫熒光方面的計(jì)議)，不當(dāng)?shù)牡胤骄凑?qǐng)斧正。有人會(huì)問(wèn)酶免疫組化做的好好的，為什么要做免疫熒光?其實(shí)，這也是我以前思慮的困難，如今我認(rèn)為可能胞膜蛋白含量不高，用通俗免疫免疫組化可能做不出來(lái)，需要敏感的免疫熒光方法來(lái)進(jìn)行蛋白檢測(cè)(我是看許多外文文獻(xiàn)都是這樣做的，因此選擇免疫熒光染色。)問(wèn)題及其解答：如何降低非特異性熒光染色和避免陰性著色?1、非特異性染色產(chǎn)生原因及其解決方案：(1)游離熒光素殘留在二抗中。一

44、部門熒光素未與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成了聚合物和衍化物，而不克不及被透析除去。二抗設(shè)置裝備擺設(shè)時(shí)用透析法或?qū)游龇▌e離熒光素符號(hào)的二抗和游離的二抗。購(gòu)置高質(zhì)量、高純度的熒光素二抗。(2)抗體之外的血清蛋黑與熒光素連系構(gòu)成熒光素脲卵白，可與組織成份分離。(3)組織抗原封閉不全。撤除查抄的抗原之外，組織中還可能存在類屬抗原(如Forssman氏抗原)，可與組織中特異性抗原之外之之響應(yīng)抗體結(jié)合。延長(zhǎng)血清封閉時(shí)間。(4)從組織中難于提純抗原性物質(zhì)，所以制備的免疫血清中常常混同一些抗其他組織成分的抗體，乃至容易混合。(5)抗體分子上標(biāo)志的熒光素份子太多，這類過(guò)量標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的抗體分子帶過(guò)量的陽(yáng)離子，可吸附于一般組

45、織上而顯現(xiàn)非特異性染色。(6)熒光素不雜、標(biāo)本流動(dòng)不妥等。(7)一抗和二抗孵育前提和濃度分歧適。調(diào)劑一抗和二抗孵育條件和濃度至最好。(8)一抗和二抗孵育后的清洗不充分。增加清洗次數(shù)和延長(zhǎng)清洗時(shí)間。2、陰性染色產(chǎn)生的緣由有：(1)一抗和二抗?jié)舛炔贿m合或孵育前提不當(dāng)。(2)熒光素提早闌珊。熒光本質(zhì)量欠安或操縱過(guò)程當(dāng)中出有留意躲光等避免熒光素闌珊的事項(xiàng)。(3)血清封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。(4)抗體稀釋液PH值分歧適，影響抗原抗體反應(yīng)。(5)組織切片不服、裂片或脫片很嚴(yán)重，易引起大塊陰性著色。(6)組織標(biāo)本不新穎或已冷凍組織制成的切片中抗原易彌集，易引發(fā)原本表達(dá)的部位陰性染色或弱著色。(7)熒光顯微鏡不會(huì)使用，

46、引發(fā)波長(zhǎng)選擇錯(cuò)誤。已有的常見免疫組化困難散錦1、石蠟切片和冰凍切片的比較?(1)要求做冰凍切片的紛歧定能做石蠟切片，這是明天我背一教員就教得出的結(jié)論。因?yàn)樽魇炃衅瑫r(shí)要高溫烤片，可能會(huì)毀壞組織的抗原性，假如組織的抗原性較不亂，則可作石蠟切片；然則要求做石蠟切片的，可作冰凍切片。(2)冰凍切片的劣點(diǎn)是能夠較好的保存組織的抗原免疫活性，做免疫組化時(shí)不需抗原修復(fù)這一步。錯(cuò)誤謬誤是細(xì)胞內(nèi)易形成冰晶而破損細(xì)胞布局，可能會(huì)使抗原彌散；切片厚度較石蠟的厚，做的片子沒(méi)石蠟的標(biāo)致。當(dāng)你買一抗時(shí)，目次上都寫著做什么樣的切片，如果它寫著只能做冰凍，就不能做石蠟，如寫著兩者都可，那就都能做。(3)石蠟切片的長(zhǎng)處可以連

47、結(jié)組織細(xì)胞的形態(tài)構(gòu)造，且容易寄存在室溫，而冰凍切片對(duì)照費(fèi)事，一定要存在-80度的低溫冰箱中，特別是用來(lái)做原位雜交的的切片，為了防止RNA降解，保留一向很重要。由于石蠟切片可以切到4微米擺布，所以原位純交探針容易滲入到組織中去，輕易勝利，并且得到的色彩/形態(tài)都較冰凍切片好。2、一抗的選摘要點(diǎn)和技能是甚么?(1)單克隆和多克隆抗體的挑選。由一種克隆發(fā)生的特異性抗體叫做單克隆抗體。單克隆抗體能方針明白地取單一的特異抗原決議簇連系，就像導(dǎo)彈切確天射中目的一樣。另外一方面，即便是統(tǒng)一個(gè)抗本決意簇，在機(jī)體內(nèi)也能夠由好幾種克隆來(lái)發(fā)生抗體，構(gòu)成好幾種單克隆抗體稠濁物，稱為多克隆抗體。正在抗原抗體反響中，一樣平

48、常單克隆抗體特異性強(qiáng)，但親和力相對(duì)小，檢測(cè)抗原活絡(luò)度相對(duì)便低；而多克隆抗體特異性稍強(qiáng)，但抗體的親和力強(qiáng)，活絡(luò)度下，但易出現(xiàn)非特異性染色(能夠經(jīng)由過(guò)程封鎖等制止)。(2)使用規(guī)模的選擇。有的一抗只能用于Western blotting，或免疫組化、免疫熒光、免疫沉淀等；以至講明石蠟切片或冰凍切片。(3)種屬反應(yīng)性的選擇(species reactivity)。這一點(diǎn)很重要，表白這類抗體可能存在種屬差異，且這種抗體合適檢測(cè)哪一種種屬動(dòng)物體內(nèi)的抗原。(4)種屬起原，一般兔濫觴的多是多克?。欢∈笕吹亩嗍菃慰寺?，但也有別的。憑據(jù)此根源來(lái)選擇相應(yīng)的二抗。(5)出產(chǎn)廠家的選擇。如santa Cruz公司

49、抗體一般1ml，價(jià)錢2100元左右；而chemicon公司一抗一般100ul，價(jià)錢2800元左右。這兩個(gè)廠家的同一種抗體它的實(shí)際效價(jià)不亂是不同的，我一般用后者抗體做免疫組化效果較好，而前者做Western blotting效果還可以。3、在甚么環(huán)境下利用TritonX-100?(1)Triton X-100化學(xué)稱號(hào)為聚乙二醇辛基苯基醚，是一種去污劑。在免疫組織化學(xué)(10um薄切片)和免疫細(xì)胞化學(xué)中一般用Triton X-100作為細(xì)胞通透劑，在膜上挨孔。(2)其作用原理：Triton X-100可以消融細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜、細(xì)胞器膜上的脂質(zhì)而使抗體及大分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進(jìn)入胞漿和胞核內(nèi)，故在細(xì)胞免疫組

50、化時(shí)尤為推薦使用，這樣抗體就能逆利進(jìn)入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。(3)Triton X-100既是一種概況活性劑，也有抗氧化作用，具體參閱：、封閉血清的選擇原則是什么?(1)膜上或切片上有殘剩的位點(diǎn)可以非特異性吸附抗體，造成后續(xù)結(jié)果的假陽(yáng)性！(2)封閉血清一般是和二抗同一來(lái)源的，血清中動(dòng)物本身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合，否則在后面的步驟中如果和二抗發(fā)生結(jié)合，會(huì)造成背景。(3)也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來(lái)源一致。5、抗體孵育條件的比力?(1)一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，此中4度效果最佳；孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37度1-2h，而4度過(guò)

51、夜和從冰箱拿出后37度復(fù)溫45min。(2)二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時(shí)間需要摸索。6、一抗4度孵育后為何要進(jìn)行37度復(fù)溫?(1)一圓里，防備切片從4度間接放進(jìn)PBS易脫片；(2)另一方面，使抗原抗體結(jié)合更波動(dòng)。一般不需要,但對(duì)表達(dá)較弱的抗原可能有效,4度和37度時(shí)分子活動(dòng)體式格局不同,前者分子碰碰機(jī)率和活動(dòng)速度小于后者,后者結(jié)合更快,但敏感性也提高了并易造成非特異染色。(3)實(shí)在，我更附和后一種道法，因?yàn)槲覝y(cè)驗(yàn)考試把肝臟或睪丸電影從4渡過(guò)夜拿出后，曲接用PBS洗沒(méi)收生過(guò)脫片征象。究竟勝于雄辯！7、DAB顯色時(shí)間如何掌控?(1)DAB顯色時(shí)間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時(shí)

52、間，到出現(xiàn)淺棕色本底時(shí)即可沖洗；(2)DAB顯色時(shí)間很短(如幾秒或幾十秒)就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說(shuō)明你的抗體濃度過(guò)高或抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，需要下調(diào)抗體濃度或縮短你的抗體孵育時(shí)間；(3)此外，若很短時(shí)間就出現(xiàn)背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長(zhǎng)封閉時(shí)間；(4)DAB顯色時(shí)間很長(zhǎng)(如跨越十幾分鐘)才出現(xiàn)陽(yáng)性染色，一方面能夠申明您的抗體濃度太低或孵育時(shí)間太短(最好一抗4度留宿)；另外一方面就是封閉時(shí)間太長(zhǎng)。8、免疫組化成績(jī)?nèi)艉侮U發(fā)?(1)陽(yáng)性著色細(xì)胞計(jì)數(shù)法。在40*光鏡下，隨機(jī)選擇不堆疊的10個(gè)視家，野生或機(jī)械計(jì)數(shù)陽(yáng)性著色細(xì)胞，每組36張不同動(dòng)物組織切片，然落后行組間比擬即可

53、。(2)灰密度分析法。通過(guò)在不同組別和不同動(dòng)物組織切片上選擇溝通地區(qū)、不異條件下用image j進(jìn)行灰密度分析，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析即可。(3)評(píng)分法。通過(guò)在光學(xué)顯微鏡下對(duì)組織切片劃分按染色程度(03分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色)、陽(yáng)性局限進(jìn)行評(píng)分(14分為025%、2650%、5175%、76100%)，終究可以分?jǐn)?shù)相加，再舉行對(duì)照。關(guān)于以上這幾種方法，各有益弊，請(qǐng)仔細(xì)選擇。要念獲得準(zhǔn)確效果的條件是你要做出著色平均、靠山很淺的高質(zhì)量切片。9、在什么環(huán)境下進(jìn)行組織抗原修復(fù)，抗原修復(fù)的條件是什么?(1)由于組織中部份抗原在甲醛或多聚甲醛固定過(guò)程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而落空

54、抗原性。通過(guò)抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定族從新表露，提高抗原檢測(cè)率。(2)修復(fù)方法從強(qiáng)到弱一般分為三種，高壓修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)。修復(fù)液也分為若干種(具體的可以查閱相干資料，大量的：中性的、高pH的等)。(3)微波修復(fù)，我們一般用6min*4次，結(jié)果不錯(cuò)。10、內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的滅活時(shí)間和濃度是什么?(1)一般3%過(guò)氧化氫滅活時(shí)間短面，可以10min擺布；而0.3%過(guò)氧化氫則可以恰當(dāng)?shù)⒄`關(guān)閉時(shí)間，一般1030min。(2)用甲醇設(shè)置過(guò)氧化氫比單蒸水或PBS可能好在護(hù)衛(wèi)抗原和固定組織作用，過(guò)氧化氫孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易引起脫片.(3)現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后4度避光保存。11、如何才能充分脫蠟?(1)蠟不溶

55、于水，如果脫蠟不干凈，少量蠟存留于切片上，將會(huì)引發(fā)染色不均勻、陽(yáng)性物時(shí)隱時(shí)現(xiàn)、真假難辨、背景染色增加等。為領(lǐng)會(huì)決上述的問(wèn)題，切片在染色前必須徹底脫蠟，目前用于脫蠟的試劑主如果二甲苯，因它脫蠟力強(qiáng)，脫蠟時(shí)間較短；(2)脫蠟的時(shí)間要根據(jù)季候，室平和試劑的新鮮碰面是在不同。若是在炎天，室溫較高，脫蠟試劑也新鮮，則脫蠟時(shí)間不需許多，3-5分鐘就已足夠。假如在冬季，室溫較低，脫蠟試劑也較陳腐，則脫蠟時(shí)間需要延長(zhǎng)，10-20分鐘或更長(zhǎng)。(3)當(dāng)天切的切片，燒烤2小時(shí)后進(jìn)行染色，切片帶有溫度進(jìn)行脫蠟這將可加快脫蠟的過(guò)程，如果預(yù)先切好烤好的切片，在染色前，還必須對(duì)切片進(jìn)行加溫10-20分鐘，然后再行脫蠟，這樣

56、脫蠟速度放慢，效果魁梧更好?？傊?，操作時(shí)應(yīng)根據(jù)不同的時(shí)節(jié)，不同的室溫，不同的試劑來(lái)決定，脫蠟的時(shí)間，原則上是要徹底、清潔、完全地脫去切片上的蠟。12、如何最大限度地降低組織非特異性染色?(1)收縮一抗/兩抗孵育時(shí)間、密釋抗體來(lái)節(jié)制。這是最主要的一條。(2)一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，倡議試用單克隆抗體看看。(3)內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和死物素在肝凈、腎臟等構(gòu)造露量很高(含血細(xì)胞多的組織)，需求經(jīng)由過(guò)程延伸滅活時(shí)間和增添滅活劑濃度來(lái)低落布景染色；(4)非特異性組分與抗體聯(lián)合，這必要經(jīng)過(guò)延長(zhǎng)二抗濫觴的植物免疫血清封閉時(shí)間和得當(dāng)增添濃度來(lái)增強(qiáng)封閉結(jié)果；(5)縮短DAB孵育時(shí)間或降低DAB濃度/過(guò)氧

57、化氫濃度等；(6)恰當(dāng)增長(zhǎng)PBS沖洗次數(shù)和浸洗時(shí)間，在一抗、二抗或SP孵育以后的浸洗尤其主要；(7)防止標(biāo)本染色過(guò)程中出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。13、蘇木素復(fù)染時(shí)間的掌握?(1)蘇木素復(fù)染時(shí)間要看那時(shí)的室溫、溶液的新舊、目的抗原的定位等狀況，一般數(shù)秒-數(shù)分鐘。不外這個(gè)假如染色不睬想可以解救的。即：染色深則分化時(shí)間稍長(zhǎng)些即可；染色淺則再置于蘇木素中染色便可。(2)鹽酸酒精是分化，氨水是返蘭。作用分歧。電影復(fù)染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒粗中數(shù)秒(肯定行動(dòng)要快)后拿出流水振洗，在放入氨水中返蘭即可。(3)如果分化的色彩過(guò)淺，可以復(fù)置于蘇木素中染色。14、PBS的清洗體例選擇、次數(shù)和時(shí)間的選擇?(1)單獨(dú)沖洗，防行交叉反應(yīng)制成污染。臨床上天天檢測(cè)的病例良多，所用的抗體品種及項(xiàng)目也多，若是在插手一抗孵育完后，將它們?cè)谝粋€(gè)缸內(nèi)洗，如許就會(huì)形成交織污染，影響末了的成效。準(zhǔn)確的