枸杞多糖對(duì)荷瘤小鼠腫瘤微環(huán)境Ｔ淋巴細(xì)胞亞群及樹突狀細(xì)胞的影響

1、枸杞多糖對(duì)荷瘤小鼠腫瘤微環(huán)境淋巴細(xì)胞亞群及樹突狀細(xì)胞的影響         07-09-12 15:35:00     編輯：studa20              作者：何彥麗，應(yīng)逸，許艷麗，蘇俊芳，羅惠，王惠峰【關(guān)鍵詞】  枸杞多糖    摘要目的：研究枸杞多糖（Lycium barbarum poly

2、saccharide, LBP）對(duì)荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤微環(huán)境中T淋巴細(xì)胞亞群和樹突狀細(xì)胞（dendritic cells, DCs）的影響，探討LBP對(duì)荷瘤機(jī)體免疫逃逸的干預(yù)作用。方法：用LBP給H22荷瘤小鼠灌胃，連續(xù)2周后，測(cè)定腫瘤重量，采用流式細(xì)胞術(shù)檢查腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（tumorinfiltrating lymphocyte, TIL）中T淋巴細(xì)胞亞群和DCs的數(shù)量，以及協(xié)同刺激分子CD80（B71）表達(dá)的變化。結(jié)果：LBP可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，增加腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D4+、CD8+細(xì)胞的數(shù)量。LBP高劑量組CD4+和CD8+細(xì)胞數(shù)量的百分比高于模型組(P<0.05)。LBP低劑量和高劑

3、量組腫瘤浸潤(rùn)DCs數(shù)量及B71表達(dá)均較模型組升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：LBP的抗腫瘤作用可能與恢復(fù)荷瘤小鼠TIL中CD4+、CD8+的細(xì)胞數(shù)量、解除機(jī)體的免疫抑制狀態(tài)及增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫功能有關(guān)。LBP能否恢復(fù)荷瘤機(jī)體DCs的表型及功能尚待進(jìn)一步研究。關(guān)鍵詞枸杞多糖; 免疫抑制; 淋巴細(xì)胞亞群; 腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞; 樹突狀細(xì)胞Effects of Lycium barbarum polysaccharide on tumor microenvironment Tlymphocyte subsets and dendritic cells in H22bearing miceABSTRA

4、CT  Objective: To study the effects of Lycium barbarum polysaccharide (LBP) on tumor microenvironment Tlymphocyte subsets and dendritic cells in H22bearing mice and the mechanisms for intervention of tumor immune escape by LBP. Methods: H22bearing mice were given LBP orally for two weeks. Tlymp

5、hocyte subsets and the phenotypes of dendritic cells in tumorinfiltrating lymphocytes (TIL) were detected by flow cytometry (FCM). Results: LBP could significantly increase the numbers of CD4+ and CD8+ T cells in TIL as compared with those in model control group (P<0.05). In model control group,

6、the number of dendritic cells in tumor microenvironment decreased markedly, while in LBPtreated group, the increased number of dendritic cells and B71 expression were observed, but there were no significant differences between these two groups. Conclusion: LBP has antitumor effect probably by increa

7、sing the numbers of CD4+and CD8+ T cells in TIL to relieve the immunosuppression and enhance the antitumor function of the immune system. But whether LBP can recover the phenocyte and function of dendritic cells in H22bearing mice should be further studied.KEY WORDS  Lycium barbarum polysacchar

8、ide; immunosuppression; Tlymphocyte subsets; tumorinfiltrating lymphocyte; dendritic cells近年來的研究發(fā)現(xiàn)：腫瘤患者體內(nèi)存在多種免疫逃逸機(jī)制，表現(xiàn)為CD4+和CD8+ T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，CD4+/CD8+比值改變及腫瘤間質(zhì)中的樹突狀細(xì)胞（dendritic cells, DCs）表型異常，這些都是導(dǎo)致惡性腫瘤細(xì)胞逃逸機(jī)體免疫監(jiān)視從而造成腫瘤持續(xù)生長(zhǎng)并發(fā)生轉(zhuǎn)移的原因1,2。已有研究證實(shí)：枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide, LBP）具有明顯的免疫調(diào)節(jié)和免疫保護(hù)功能，可以

9、增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤作用3,4。但LBP抗腫瘤的作用機(jī)制究竟為何？是否與其影響免疫活性細(xì)胞的功能有關(guān)？如何從免疫逃逸的角度探討LBP的抗腫瘤作用機(jī)制？有關(guān)這方面的研究卻鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以H22肝癌腹水瘤荷瘤小鼠為模型，研究LBP在全身給藥情況下，對(duì)腫瘤微環(huán)境中T淋巴細(xì)胞亞群及DCs的影響，從免疫逃逸的角度揭示LBP抗腫瘤作用的機(jī)制。1材料與方法1.1材料  昆明種小鼠，清潔級(jí)，68周齡，體質(zhì)量（18±2）g，雌雄各半，廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)0002769；H22肝癌腹水型細(xì)胞株，中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心細(xì)胞庫(kù)提供；LBP，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)藥物化學(xué)研究所自寧夏

10、枸杞子中提取，呈棕黃色粉末，純度35%；型膠原酶和型DNase酶，均為Sigma公司產(chǎn)品；淋巴細(xì)胞分離液，廣州展晨生物科技有限公司產(chǎn)品；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）標(biāo)記的抗小鼠CD4、CD80（B71）單克隆抗體，藻紅蛋白（phycoerythrin, PE）標(biāo)記的抗小鼠CD8a、CD11c單克隆抗體，美國(guó)BioLegend公司產(chǎn)品；電子天平，日本島津公司產(chǎn)品；FACS Vantage流式細(xì)胞儀，美國(guó)Becton Dickinson公司產(chǎn)品。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組  昆明種小鼠60只，隨機(jī)分成4組：正常組、模型組、LBP低劑量組和L

11、BP高劑量組，每組15只。其中后3個(gè)組，第1天右側(cè)腋下接種2×106個(gè)H22腫瘤細(xì)胞。第3天起，前2個(gè)組小鼠予以生理鹽水灌胃，0.5 ml/d；后2個(gè)組LBP給藥劑量根據(jù)文獻(xiàn)5結(jié)合預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，分別給予LBP 0.625 gkg1d1及1.25 gkg1d1灌胃（均用生理鹽水稀釋成0.5 ml/d），連續(xù)灌胃14 d。1.3LBP體內(nèi)抑瘤率的測(cè)定 每日觀察并記錄小鼠生長(zhǎng)情況及腫瘤大小，第15天小鼠眼球放血后予以脫頸處死，解剖并觀察腫瘤大小及重量，計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率：局部腫瘤的生長(zhǎng)抑制率=（模型組平均瘤重LBP組平均瘤重）/模型組平均瘤重×100%。所有動(dòng)物均摘取胸腺稱重，計(jì)算

12、胸腺指數(shù)（胸腺指數(shù)小鼠胸腺質(zhì)量/體質(zhì)量）。1.4腫瘤間質(zhì)淋巴細(xì)胞的分離  腫瘤組織稱重后，挑選瘤體質(zhì)量2 g者置于含青霉素和鏈霉素各500 U/ml、甲硝唑5 g/ml的RPMI1640培養(yǎng)液中浸泡30 min后，將瘤體剪成1 mm3大小，置于含0.05% 型膠原酶、0.003% 型DNase酶及10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，4 磁力攪拌過夜消化，200目消毒銅網(wǎng)過濾洗滌后，1 500 r/min離心15 min，分離獲得腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（tumorinfiltrating lymphocyte, TIL），用DHanks液洗滌2次，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力，調(diào)整細(xì)胞濃度至

13、1×106/ml。1.5TIL中CD4、CD8a、CD11c、CD80流式細(xì)胞儀分析  每個(gè)樣本分3管，每管中加入3×105個(gè)細(xì)胞，PBS液調(diào)整總體積為100 l，其中第1管中加入不同熒光素標(biāo)記的抗鼠CD4、CD8a單克隆抗體0.5 l（0.25 g）、1.0 l（0.2 g），第2管中加入不同熒光素標(biāo)記的抗鼠CD11c、CD80單克隆抗體1.0 l（0.2 g）、1.0 l（0.5 g），第3管為空白對(duì)照管，室溫避光孵育30 min，PBS液洗滌2次，每次實(shí)驗(yàn)取2管細(xì)胞分別加入FITC和PE單熒光素標(biāo)記抗體，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法  所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，行單因素方差分析及組間比較最小顯著差(least significant difference, LSD)法。2結(jié)果2.1LBP對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)及胸腺指數(shù)的影響  模型組平均瘤體質(zhì)量（2.48±0.40）g，LBP低劑量組和高劑量組分別為（1.89±0.29）g和（1.46±0.26）g，其中，LBP高劑量組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P&