串聯(lián)重復(fù)核定位信號(hào)的綠色熒光蛋白融合載體的構(gòu)建與原核表達(dá).

1、【摘要】目的：構(gòu)建綠色熒光蛋白-串聯(lián)重復(fù)核定位信號(hào)融合蛋白的表達(dá)載體(HisEGFP 3xNLS，并在原核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)與純化。方法：采用PCR方法從原先克隆在pEGFP C1載體中的3xNLS與 EGFP編碼序列擴(kuò)增 出來，使用常規(guī)酶切和連接方法將其重組至pET 14b載體中，對(duì)陽性克隆進(jìn)行酶切、PCR和測(cè)序鑒定。轉(zhuǎn)化BL21(DE3)大腸桿菌株，用IPTG誘導(dǎo)融合蛋白 表達(dá)，并利用NiNTA親和層析純化該融合蛋白。結(jié)果： 構(gòu)建的His EGFP3xNLS融合蛋白表達(dá)載體是正確的，該載體可在大腸桿菌內(nèi)高效表達(dá)，用NiNTA純化獲得了相對(duì)分子質(zhì)量約36 kD的融合蛋白。結(jié)論： 成功構(gòu)建了 Hi

2、s EGFP 3xNLS融合蛋白表達(dá)載體，并在原核細(xì)胞中獲得了高效表達(dá)和純化， 為進(jìn)一步研究NLS介導(dǎo)信號(hào)分子入核提供了實(shí)驗(yàn)材料?！娟P(guān)鍵詞】核定位信號(hào) 載體蛋白質(zhì)類 基因表達(dá) 蛋白純化Abstract Objective: To con struct the expressi on vector of HisEGFP 3xNLS fusi on protein and obta in its expressi on and purificati on in E. coli. Methods: 3xNLS and EGFP seque nee wasamplified by PCR from p

3、EGFP C1 3xNLS vector and clo ned into pET14b vector followi ng the rout ine procedures. After ide ntificati on by en zyme digesti on, PCR and seque ncing, the positive clones were tran sformed into BL21 (DE3) compete nt cells, and the expressi on of His EGFP 3xNLS fusi on protein was in duced with I

4、PTG and further purified by NiNTA affinity chromatography. Results: Thecon structed HisEGFP 3xNLS fusi on protein vector highly expressedin E. coli. With NiNTA affin ity chromatography, a purified Hisfusi on protein with relative molecular mass of approximately 36 kD was obta in ed. Con clusi on: Th

5、e expressi on vector of HisEGFP 3xNLSfusi on prote in is con structed, expressed and purified un der non den aturi ng con diti ons, which may sig nifica ntly facilitate future study of the mecha nism by which NLS mediate the nu clear tran slocati on of certa in sig nal molecules.Key words nuclear lo

6、calization signal; carrier proteins; gene expressi on; prote in purificati on信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的時(shí)空特征，即信號(hào)蛋白的亞細(xì)胞定位(subcellular localization )和激活后移位(translocation)已成為目前細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域1，2，信號(hào)分子的特異性亞細(xì)胞定位有助于細(xì)胞高效經(jīng)濟(jì)地完成 各種正常生理功能和病理反應(yīng)。在刺激誘導(dǎo)的多種不同信號(hào)分子的移位入核過 程中，核定位信號(hào)(nuclear localization signal, NLS )都扮演著重要的角 色24，但目前NLS與核孔復(fù)合體(nu

7、clear pore complex, NPC )的相互作 用介導(dǎo)信號(hào)分子入核的具體機(jī)制仍未完全闡明。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了與增強(qiáng)型綠色熒 光蛋白(enhan ced green fluoresce nt prote in, EGFP)融合的 3 個(gè)串聯(lián)重復(fù)的NLS融合蛋白原核表達(dá)載體，為研究 NLS介導(dǎo)信號(hào)分子入核的機(jī)制提供了一 個(gè)重要的工具。1 材料和方法1.1 質(zhì)粒帶有三個(gè)串聯(lián)重復(fù)的NLS(3xNLS增強(qiáng)型綠色熒光蛋白載體 pEGFP C1 由挪威Troms大學(xué)Seternes教授饋贈(zèng)，該質(zhì)粒中3xNLS的序列為 aggaagaggaagctgctgaggaagaggaagctgctgaggaag

8、aggaagctg ctg，利用Hind III和Pst I克隆在pEGFP C1中。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌株 DH5x，提取質(zhì)粒DNA用DNA/RN定量?jī)x測(cè)定DNA濃度，置-20 C保存?zhèn)溆谩?pET14b質(zhì)粒和大腸桿菌株 BL21(DE3)由本室保存。1.2 主要試劑QIAprep Spin Miniprep Kit和 NiNTA親和樹脂是 QIAGEN公司產(chǎn)品，限制性內(nèi)切酶(Nde I、BamH I)、T4 DNA連接酶和Pyrobest高保真DNA聚合酶 購自 TaKaRa公司，100 bp 和 1 kb DNA ladder 分別是 Toyobo 公司和 Stratagene公司產(chǎn)品，異

9、丙基-B -D-硫代半乳糖(isopropyl B D thiogalactoside, IPTG )購自Sigma Aldrich 公司，引物由英駿公司合成。1.3 His EGFP 3xNLS融合載體的構(gòu)建見圖1。從pEGFP C13xNLS載體中擴(kuò)增EGFP和 3xNLS所用的上游引物序列為5' tacatat gatggtgagcaagggcgaggagct3'，其中下劃線部分是EGFP基因編碼序列的第123位堿基；下游引物序列為5' taggatccttacgggcccgcggtaccgtcgactgca3 '，其中下劃線部分是添加的終止密碼子及pEG

10、FP C1載體上BamH I位點(diǎn)前的25位堿基的反向互補(bǔ)序列。用 Pyrobest 高保真聚合酶進(jìn)行 PCR反應(yīng)(95 C 30 s, 55 C 30 s,72 C 60 s，共30個(gè)循環(huán))，擴(kuò)增片段大小為 848 bp。將PCF產(chǎn)物用Nde I和BamH I 酶切，隨后與Nde I和BamH I雙酶切并電泳切膠回收的pET 14b連接，將連 接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌株 DH5x。挑取單菌落接種于Amp的 LB培養(yǎng)基中， 37 °C振搖過夜。取 5 ml菌液用QIAprep Spin Miniprep Kit 小量提取質(zhì)粒 后，用Nde I和BamH I酶切鑒定。另外使用上述引物對(duì)重

11、組體進(jìn)行PCR鑒定。酶切及PCF鑒定產(chǎn)物用1.2 %瓊脂糖凝膠電泳，并在凝膠圖像分析儀上成像。 重組體最終經(jīng)測(cè)序鑒定無誤后，置-20 C保存?zhèn)溆谩?.4 His EGFP 3xNLS融合蛋白的原核表達(dá)及純化將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌株 BL21(DE3)。挑取單菌落，置于2 ml LB(Amp+)培養(yǎng)基中，37 C振搖培養(yǎng)至D600約為0.6時(shí)，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，繼續(xù)振搖3 h。利用12 % SDS PAGE來鑒定表達(dá)融合蛋 白的菌落。對(duì)有His EGFP 3xNLS融合蛋白表達(dá)的菌落進(jìn)行大量(100 ml) 菌液擴(kuò)增誘導(dǎo)，6 000 X g、4 C離心10 mi

12、n ;將細(xì)菌沉淀重懸于4 ml結(jié)合緩 沖液(300 mmol/L NaCl, 50 mmol/L NaH2PO4, 10 mmol/L 咪唑,0.1% TritonX 100, pH8.0 )中，超聲破碎，15 000 X g, 4 C離心15 min。將上清加入 100卩l(xiāng) NiNTA親和樹脂中4 C孵育1 h，然后用1 ml的洗滌緩沖液(300mmol/L NaCl, 50 mmol/L NaH2PO4, 20 mmol/L 咪唑,pH8.0 )洗 NiNTA親和樹脂3次；最后用洗脫緩沖液(300 mmol/L NaCl, 50 mmol/L NaH2PO4, 250 mmol/L咪唑,p

13、H8.0 )洗脫蛋白后，12% SDS PAGE鑒定結(jié)果。2 結(jié)果 2.1 His EGFP 3xNLS融合載體的鑒定電泳結(jié)果表明有約0.85 kb和4.7 kb兩個(gè)條帶，符合插入片段的大小(圖2A)。用特異性引物進(jìn)行PCF反應(yīng)擴(kuò)增出約0.85 kb的條帶，也符合預(yù)計(jì)結(jié)果（圖 2B）。測(cè)序結(jié)果（用 T7 promoter primer 和 T7 term in ator primer雙向測(cè)通）證實(shí)插入到pET 14b載體中的目的片段是正確的。2.2 His EGFP 3xNLS融合蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)和純化經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，細(xì)菌裂解液在約36 kD處形成一條濃密的蛋白條帶，與預(yù) 期的Hi

14、s EGFP 3xNLS融合蛋白大小一致。利用Ni NTA親和層析法對(duì)細(xì) 菌裂解液進(jìn)行純化后，在約36 kD處得到一條唯一的蛋白條帶（圖3）。3 討論許多信號(hào)通路激活的最終結(jié)果都可引起細(xì)胞的基因表達(dá)發(fā)生改變，這通常 需要在信號(hào)通路被激活時(shí)，該級(jí)聯(lián)中的某種蛋白從細(xì)胞質(zhì)移位到細(xì)胞核中，通 過作用于其下游底物引起特異性的基因轉(zhuǎn)錄。真核細(xì)胞可以通過多種機(jī)制迅速 誘導(dǎo)蛋白質(zhì)從胞質(zhì)移位入核5。影響蛋白質(zhì)在胞質(zhì)和胞核中分布主要包括兩個(gè) 因素，即與核轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)器或錨定蛋白的相互作用6，7。對(duì)于某種信號(hào)蛋白而 言，如果其分布于胞質(zhì)中，且核輸入速率低于核輸出速率，那么當(dāng)其與輸入受 體-輸入素的結(jié)合增加，與輸出受體-輸

15、出素的結(jié)合降低，或兩者同時(shí)存在時(shí)將 迅速移位入核8。蛋白進(jìn)出細(xì)胞核都必須通過 NPC小于50 kD的分子能通過核孔自由擴(kuò)散 進(jìn)出核，而大一些的分子則需要一個(gè) NLS4。NLS般具有如下特征：（1）長(zhǎng) 度一般小于20個(gè)氨基酸；（2）在蛋白入核內(nèi)后不被移除；（3）通常富含帶正 電的（堿性）氨基酸。除此之外，NLS之間不存在一致的序列9。核輸入過程 可分為三個(gè)步驟。首先，位于胞質(zhì)中的貨物（需要移位入核的蛋白質(zhì)，具有 NLS或與具有NLS的蛋白質(zhì)結(jié)合）與輸入素結(jié)合，形成的貨物-輸入素復(fù)合體， 隨后被靶向到NPC上。移位過程需要小分子量 GTP酶Ran GTP的參與和生理溫 度，目前該過程的具體機(jī)制尚未

16、闡明。入核后，貨物-輸入素復(fù)合體在RanGTP與輸入素結(jié)合后解離。貨物在核中被卸下，而輸入素返回到胞質(zhì)中進(jìn)行下 一輪的轉(zhuǎn)運(yùn)。因而，NLS對(duì)于蛋白質(zhì)移位入核具有重要作用4。研究表明， p38調(diào)節(jié)/激活蛋白激酶/MAPK激活蛋白激酶5移位入核依賴于其C末端的 NLS10。Seternes等利用三個(gè)串聯(lián)重復(fù)NLS序列與EGFP融合的真核表達(dá)載體證實(shí) 了 p38通過與其下游底物MK5的結(jié)合和對(duì)其的激活來參與其核-胞質(zhì)分布的調(diào)控 11。為了研究NLS在介導(dǎo)蛋白質(zhì)入核中的確切機(jī)制（例如通過某些抑制劑的 使用），實(shí)驗(yàn)中選取一個(gè)典型的單個(gè) NLS核心序列（RKRKL）構(gòu)建了 EGFF融合 的原核表達(dá)載體，然而

17、該載體表達(dá)的His EGFP NLS融合蛋白加入細(xì)胞后并不能入核，說明融合蛋白內(nèi)的單個(gè) NLS可能在空間上被掩蓋。結(jié)合 Seternes等 的結(jié)果，使用三個(gè)串聯(lián)重復(fù)的 NLS來構(gòu)建與EGFP融合的原核表達(dá)載體，該載體 經(jīng)鑒定正確后，在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，獲得了純化的His EGFP 3xNLS融合蛋白，這為進(jìn)一步研究NLS在介導(dǎo)蛋白質(zhì)入核中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1Teruel MN, Meyer T. Tran slocati on and reversible localizatio n of sig nali ng prote ins: a dyn amic future f

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