Skp2與P27kip1在鼻咽癌組織中的表達及意義

1、Skp2與P27kip1在鼻咽癌組織中的表達及意義 【摘要】 Fbox蛋白家族中的一員Skp2參與細胞周期抑制蛋白P27kip1泛素化降解，研究發(fā)現Skp2在乳腺癌、胃癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中表達增加。本研究旨在探討Skp2與P27kip1在鼻咽癌組織中的表達及與鼻咽癌多項臨床病理特征的關系，并探討兩者的相關性。方法：鼻咽癌組39例，慢性鼻咽炎組24例。標本均經石蠟包埋，HE染色確診。Skp2和P27kip1蛋白的檢測采用免疫組化染色（PV9000二步法）。結果：(1) Skp2在鼻咽癌組織中的陽性表達率為71.79%，明顯高于其在慢性鼻咽炎組織中的陽性表達率(41.67%),差異有統(tǒng)計學

2、意義（P0.05）；P27kip1在鼻咽癌組織中的陽性表達率為35.90%，明顯低于其在慢性鼻咽炎組織中的陽性表達率(79.17%)，差異有統(tǒng)計學意義（P0.01）；(2) Skp2、P27kip1的蛋白表達與鼻咽癌的臨床分期、顱神經侵犯有關（P0.05），與年齡、性別、分化程度、頸淋巴結轉移無關（P0.05）；(3) Skp2、P27kip1在鼻咽癌組織中的表達呈負相關（rs=-0.373,P=0.019）。結論：鼻咽癌中Skp2蛋白表達與靶蛋白P27kip1蛋白降解有關，Skp2、P27kip1可能與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展有關，聯合檢測Skp2、P27kip1蛋白表達可作為判斷鼻咽癌生物學行為的

3、指標之一。 【關鍵詞】 鼻咽腫瘤 Skp2 蛋白 P27kip1 蛋白 細胞周期 ABSTRACT Objective: The Fbox protein Skp2 is required for the ubiquitinmediated proteolysis of the cyclindependent kinase inhibitor P27kip1. Overexpression of Skp2 has been reported in many cancers including breast carcinoma, gastric carcinoma and prostate ca

4、ncer. The purpose of this study is to investigate the correlation of Skp2 and P27kip1 expression with the clinical pathological features of nasopharyngeal carcinoma, and the correlation between expression of Skp2 and P27kip1 in nasopharyngeal carcinoma.Methods: Thirtynine cases of nasopharyngeal car

5、cinoma and twentyfour cases of chronic nasopharyngitis were enrolled in this experiment. All specimens were proved by formallinfixed paraffinembedded slides with the hematoxylin eosin staining. Expression of Skp2 and P27kip1 was determined by using an immunohistochemical staining (PV9000 twostep kit

6、). Result: The Skp2 labeling frequency (71.79%) in nasopharyngeal carcinoma was significantly higher than that (41.67%) in chronic nasopharyngitis(P0.05). The positive rate of P27kip1 expression in nasopharyngeal carcinoma was 35.90%, which was remarkably lower than that (79.17%) in chronic nasophar

7、yngitis (P0.01). Expression of Skp2 and P27kip1 protein in nasopharyngeal carcinoma was correlated with the clinical stage and cranial nerve encroachment (P0.05), but not correlated with the patient age, sex, histological grade, or lymph node metastases (P0.05). Skp2 expression was inversely correla

8、ted with P27kip1 in nasopharyngeal carcinoma（rs=-0.373, P=0.019）. Conclusion: Expression of Skp2 protein may decrease the P27kip1 level in human nasopharyngeal carcinoma, indicating it is involved in the development of human nasopharyngeal carcinoma. Skp2 and P27kip1 may be used as hopeful markers f

9、or predicting the clinical pathological features and the prognosis of these patients. KEY WORDS Nasopharyngeal carcinoma; Skp2， protein; P27kip1， protein; Cell cycle 鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma, NPC）為我國最常見的惡性腫瘤之一。多見于我國廣東、廣西等省，其發(fā)病率據國內觀察為耳鼻咽喉科惡性腫瘤之首1，但它的發(fā)病機制尚未明確。腫瘤發(fā)生的共同特征是細胞周期調控機制的紊亂，導致細胞的失控性生長2。調控細胞

10、周期的核心機制是由細胞周期蛋白（cyclin），周期蛋白依賴性激酶（cyclin dependent kinase,CDK）,周期蛋白依賴性激酶抑制劑（cyclin dependent kinase inhinitors,CKI）構成的調控網絡。 P27kip1是已發(fā)現的CKI家族中一類相對分子質量為27?KD的蛋白分子，可與cyclin及CDK結合，廣譜抑制cyclinECDK2,cyclinDCDK4,6以及其他cyclinCDK的激酶活性。在正常的細胞中，P27kip1蛋白可以阻斷外界刺激細胞進行細胞分裂，故認為P27kip1扮演著一種腫瘤抑制的功能，當細胞缺少P27kip1的作用時會引

11、發(fā)癌癥的發(fā)生3。 人體組織細胞中存在多種蛋白降解途徑，其中泛素依賴性蛋白水解途徑在真核生物中普遍存在，SKP1CullinF-box蛋白復合體（簡稱SCF復合體）作為泛素蛋白連接酶參與許多細胞周期調控因子的泛素依賴性蛋白水解作用，其中Fbox蛋白起特異性識別底物的作用，從而使SCF復合體具有特異性。 S期激酶相關蛋白2（Sphase kinaseassociated protein2,SKP2）是DNA復制所必需的人類Fbox蛋白家族中一員。在許多細胞周期相關蛋白的泛素依賴性蛋白水解途徑中起到特異性識別底物的作用，從而參與細胞增殖與凋亡的調控，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關。目前，已有許多細胞周期調控

12、蛋白被證明通過SKP2依賴性泛素-蛋白酶途徑降解，其中CDK抑制因子P27kip1是最受人們關注的。 當受到惡性增殖信號的刺激，P27kip1的蛋白表達水平開始下降，一方面由于合成降低，更主要的是通過SKP2介導完成的泛素-蛋白酶體降解途徑的速度提高（這個降解途徑在細胞靜止期作用很小，而在細胞接受增殖信號后明顯增強）。P27kip1蛋白水平的下降減低了它對CDK或CyclinCDK復合物活性的抑制效應，導致CDK的活化效應遞增，使細胞能夠完成細胞周期G1S期的重要轉換驅動細胞周期的運行，使細胞增殖、分裂過快、過多，至腫瘤形成。 目前SKP2、P27kip1在各種腫瘤中的表達及其兩者的相關性已成

13、為研究熱點，如淋巴瘤、消化系統(tǒng)腫瘤、肺癌、口腔鱗癌等方面，但其與鼻咽癌的關系國內外均未見有關報道。本課題旨在探討SKP2和P27kip1在鼻咽癌組織中的表達和意義，進一步研究鼻咽癌的生物學特性，了解其發(fā)病機制，或能有一定的理論價值和臨床意義。 1 材料與方法 1.1 實驗對象 收集貴陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院2003年9月至2005年9月門診耳鼻喉科纖維鏡檢查鼻咽部非角化性癌活檢組織及貴醫(yī)附院病理科部分存檔鼻咽部非角化性癌活檢組織蠟塊共39例，慢性鼻咽炎活檢標本24例。 鼻咽癌組39例中，男25例，女14例；32 72歲，按照鼻咽癌92TNM分期標準（福州）分期：期6例，期8例，期10例，期15例。39

14、例鼻咽癌患者均未行過放化療，其中28例伴有頸淋巴結轉移，15例伴有顱神經侵犯癥狀。慢性鼻咽炎組24例中，男10例，女14例，25 68歲。所有標本經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，HE染色復檢確診。兩組患者的年齡、性別差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性。 1.2 檢測方法 鼠抗人Skp2單克隆抗體、鼠抗人P27kip1單克隆抗體、PV9000試劑盒、DAB顯色劑、Citrate枸椽酸鹽緩沖液、PBS磷酸鹽緩沖液。以上試劑均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。 實驗步驟均按試劑盒說明書進行，嚴格控制實驗條件，每組實驗均設陽性對照和用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照，每組均作常規(guī)HE染色。 1.3 結果判

15、定 Skp2、P27kip1均以細胞核或細胞核伴胞質內出現棕黃色顆粒為陽性細胞，而只有胞漿出現棕黃色為非特異性染色。鼻咽癌組織以癌細胞核著色為陽性細胞；慢性鼻咽炎組織以黏膜上皮細胞核著色為陽性細胞。取染色良好（陽性細胞染色清晰，背景染色低）的組織切片，用半定量法4行結果判定。A按陽性細胞比例評分：在高倍鏡下（400）隨機選取5個陽性細胞數多的視野計數，計數陽性細胞及總細胞數，求出陽性細胞所占總細胞數的百分比，取其平均值，并計分：無細胞染色為0分,陽性細胞25%為1分，陽性細胞占26% 50%為2分，陽性細胞占51% 75%為3分，陽性細胞75%為4分。B按染色強度計分：不染色為0分,呈淡黃色為

16、1分,呈黃色為2分,呈棕黃色為3分。最后以AB的值劃定標準：3分可判為陽性，3 5分為（），6 8分為（2 結 果 2.1 Skp2和P27kip1蛋白在鼻咽癌和慢性鼻咽炎組織中的表達情況 Skp2蛋白在鼻咽癌癌細胞核部位染色陽性，細胞漿中無表達，陽性細胞彌漫散布于鼻咽部黏膜上皮層及黏膜下，癌灶處癌細胞表現為Skp2蛋白染色強陽性（圖1），而在慢性鼻咽炎組織中陽性染色較鼻咽癌組明顯減少（圖2）。39例鼻咽癌組織中Skp2蛋白總陽性表達率為71.79%，強陽性表達率為56.41%；24例慢性鼻咽炎組織中Skp2蛋白總陽性表達率為41.67%，強陽性表達率為25%，兩組差異有統(tǒng)計學意義(2=5.6

17、3，P0.05)。 鼻咽癌組織Skp2的陽性表達(PV9000二步法，1040) 慢性鼻咽炎組織Skp2的陽性表達(PV9000二步法，1040) 鼻咽癌組織中P27kip1蛋白表達明顯減少（圖3），P27kip1蛋白在慢性鼻咽炎黏膜上皮中分布未見明顯特異性。 鼻咽癌組織P27的陽性表達(PV9000二步法，1040) 39例鼻咽癌組織P27kip1蛋白總陽性表達率為35.90%，強陽性表達率為17.95%，顯著低于其在慢性鼻咽炎的總陽性表達率79.17%，強陽性表達率58.33%（2=11.15,P0.01），見表。 2.2 Skp2和P27kip1蛋白表達與鼻咽癌多項臨床病理特征的關系 S

18、kp2和P27kip1的蛋白表達與鼻咽癌的臨床分期、顱神經侵犯有相關性（P0.05），與年齡、性別、鼻咽癌的分化程度、頸淋巴結轉移無相關性（P0.05），見表2。 2.3 鼻咽癌中Skp2與P27kip1蛋白表達的關系 經Spearman等級相關分析，在鼻咽癌中Skp2與P27kip1蛋白表達呈明顯的負相關（rs=-0.373,P=0.019）。nSkp2+P值P27kip1+P值年齡 60歲2315(65.22)0.1640.186 60歲1613(81.25)性別 男2517(68.00)0.2350.215 女1411(78.57)組織學分類 低分化3627(75.00)0.16913(

19、36.11)0.46 中高分化臨床分期 、期140.0260.035 、期2521(84.00)頸淋巴結轉移 L(+)2822(78.57)0.10410(45.45)0.287 L(-)顱神經侵犯 N(+)14(93.33)0.0180.019 N(-)2414(58.33)12(50.00) 3 討 論 腫瘤細胞的生物學特征是細胞周期調控機制的紊亂，導致細胞的失控性生長。細胞周期主要由正負調控蛋白調控。周期蛋白(cyclin)、周期蛋白依賴性激酶(cyclin dependent kinase,CDK)、周期蛋白依賴性激酶抑制劑(cyclin dependent kinase inhini

20、tors, CKI)是參與細胞調控的主要因子。CDK與cyclinCDK復合物正性催化細胞周期進程，而CKI 通過與cyclin、CDK或cyclinCDK復合物結合抑制并阻斷細胞周期進程。 細胞周期的運行受多種因素調控，有兩個主要的調控點：一個處于G1/S轉折點G1期檢測點，是控制細胞進入S期的控制點；另一個處于G2/M轉折點G2期檢測點。在G1期早期，cyclinD和CDK4,6復合物發(fā)揮正向調節(jié)作用，進入G1期中后期cyclinE和CDK2復合物進行正向調節(jié)5。 P27kip1是已發(fā)現的CKI的兩大家族中（KIP家族和INK4家族）KIP家族的重要成員之一，可廣泛抑制cyclinCDK復

21、合物的活性，主要抑制cyclinECDK2、cyclinDCDK4等細胞G1期激酶復合物，使細胞停滯在G1期，從而實現其細胞負性調控功能。P27kip1蛋白功能受到抑制，則可能破壞其抑制調控細胞周期的功能，促進細胞過度增殖，阻止凋亡，以上過程可能是其參與細胞癌變的分子機制6。P27kip1作為細胞周期的負調控因子，通常被認為是一種抑癌基因7。但是，有關P27kip1在人類腫瘤中的大量研究卻甚少發(fā)現P27kip1基因的缺失或突變，而是表現為P27kip1蛋白表達水平的大大減少。某些致癌基因則通過介導P27kip1蛋白的不穩(wěn)定性，使其降解增加，達到致癌作用8。 本研究發(fā)現，P27kip1在慢性鼻咽

22、炎組織中的陽性率為79.17%，而在鼻咽癌組織中的陽性率為35.90，明顯低于慢性鼻咽炎組，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。此結果支持體外細胞株檢查幾種即在靜止期細胞中，P27kip1呈高水平表達，隨著增生活性的增加，P27kip1蛋白水平下降。提示在鼻咽癌的發(fā)生中P27kip1蛋白的減少起重要作用。對不同臨床特征的鼻咽癌患者比較P27kip1表達，在組織學分化及淋巴結轉移上未發(fā)現差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。但研究結果發(fā)現，P27kip1蛋白陽性表達率在臨床分期、期及有顱神經侵犯組均明顯低于、期和無顱神經侵犯組(P0.05)，提示P27kip1與腫瘤臨床分期、顱神經侵犯有顯著相關性，可

23、能在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本研究中P27kip1蛋白表達與鼻咽癌組織學分級、淋巴結轉移之間的差異無統(tǒng)計學意義。而Ciaparron等9分析P27kip1蛋白在一系列不同階段人類結腸癌標本中的表達，發(fā)現P27kip1的表達與腫瘤分級之間有顯著的關系，高中分化的腫瘤有P27kip1的高表達，而低分化的腫瘤顯示低表達；Tan等10分析了202例T1a,T1b浸潤性乳腺癌，發(fā)現P27kip1表達水平和淋巴結轉移與乳腺癌生存率顯著相關。這可能是因為鼻咽癌本身的病理特點98%屬低分化鱗癌，本實驗收集的標本中絕大多數亦為低分化鱗癌，中高分化組樣本含量較小，來院就診的病例大多屬中晚期，已發(fā)生淋巴結轉移

24、的病例較多，本研究所收集的淋巴結陰性病例組樣本含量較小。 目前，P27kip1蛋白已被證明通過Skp2依賴性泛素-蛋白酶體途徑降解。 泛素依賴性蛋白水解途徑是真核細胞中的一種重要的蛋白降解途徑，主要降解胞內泛素化的蛋白質。泛素經過泛素活化酶（E1）、泛素結合酶(E2)及泛素連接酶(E3)等一系列催化步驟結合底物蛋白，形成泛素-底物蛋白復合體，使底物進入26S蛋白酶體內實現泛素化降解。泛素連接酶復合物SCF(Skp1CullinFbox)的Fbox亞基能特異性識別底物并與之結合，使之進入泛素化降解。Skp2正是Fbox蛋白家庭成員之一11。 Skp2與Skp、cullin1結合形成SCF(Skp

25、2)泛素蛋白連接酶，通過Skp2可識別結合cyclinCDK212，cyclinCDK2復合體使P27kip1的187位蘇氨酸磷酸化，Skp2特異作用于磷酸化的P27kip1,使其通過泛素蛋白酶途徑降解13,這是泛素依賴性蛋白水解途徑調節(jié)細胞周期的機制。 本研究發(fā)現，Skp2蛋白陽性表達率與鼻咽癌臨床分期、顱神經侵犯呈明顯的相關性(P0.05)，提示Skp2可能在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，檢測其蛋白表達對判斷鼻咽癌的臨床分期及惡性程度有一定意義。與P27kip1相同，Skp2蛋白表達與鼻咽癌的組織學分化、淋巴結轉移無關。 本研究結果顯示，在鼻咽癌中Skp2蛋白和P27kip1蛋白表達呈顯著

26、負相關(P0.05)，與眾多的文獻報道一致。提示，(1) 鼻咽癌中P27kip1低表達可能產生于Skp2高表達介導的P27kip1降解升高。由此可以推測，在鼻咽癌患者的鼻咽黏膜被覆上皮細胞中，Skp2過表達通過加速對P27kip1的泛素化降解，使細胞異常增殖不能得到有效抑制，導致細胞過度增殖，分化程度降低，最終發(fā)生癌變，此過程可能為鼻咽癌分子發(fā)病機制之一，可為鼻咽癌的診治提供一定的理論依據；(2) Skp2有可能成為鼻咽癌治療的新靶點。Skp2在多種腫瘤中高表達或普遍表達，而在相應正常組織中低表達或不表達，故具有較好的特異性。抑癌藥物可通過降低細胞中Skp2表達，提高P27kip1蛋白水平，導

27、致細胞周期停頓，抑制癌細胞增殖14,15；(3) Skp2與P27kip1可望成為臨床上診斷鼻咽癌及判斷其進展、預后的聯合指標。聯合檢測Skp2、P27kip1可能作為判斷鼻咽癌生物學行為的指標之一?！緟⒖嘉墨I】 1 王正敏，陸書昌.現代耳鼻咽喉科學M.北京：人民軍醫(yī)出版社，2001.10.2 Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancerJ. Cell, 2000, 100(1):5770.3 管曉翔，于正洪，陳龍邦.P27kip1蛋白與腫瘤的康復和預后研究進展J.中國臨床康復，2003,8(2):340341.4 Mattern J, Koo

28、nlagi R, Volm M. Smokingrelated increase of 06methlguanineDNA methylrtansferase expression in human lung carcinomaJ. Carcinogenesis, 1998, 19:12471250.5 時偉紅.P27及其臨床意義的研究J.國外醫(yī)學遺傳學分冊,2001, 1：4850.6 Hartwell LH, Kastan MB. Cell cycle control and cancer J. Science, 1994, 266 (5192):18211828.7 St Croix B

29、, Florenes VA, Rak JW, et al. Impact of the cyclin dependent kinase inhibitor P27kip1 on resistance of tumor cell to anticancer agentsJ. Nat Med, 1996, 2:12041210.8 Yang HY, Zhou BP, HungMC, et al. Oncogenic signs of HERZ/neu in regulating the stability of the cyclindepentment kinase inhibitor P27kip1J. J Biol Chem, 2000, 275:2473524739.9 Ciaparron M, Marco C, Hirofumi Y, et al. Localization and expression of kipl in multistage colorectal carcinogenesisJ. Cancer Res, 1998， 58(1):114122.10 Z