HA-1樹(shù)突狀細(xì)胞核酸疫苗的構(gòu)建及其特異性CTL的誘導(dǎo)

1、HA-1樹(shù)突狀細(xì)胞核酸疫苗的構(gòu)建及其特異性CTL的誘導(dǎo)         08-03-07 11:49:00     編輯：studa20         作者：汪涯雅，張東華，劉文勵(lì)，周紅升，張路，戴敏，黃振倩， 譚獲熊平 【摘要】  本研究以次要組織相容性抗原HA-1為靶點(diǎn)，構(gòu)建HA-1樹(shù)突狀細(xì)胞核酸疫苗用于造血干細(xì)胞移植后抗白血病治療。體外培養(yǎng)移植供者樹(shù)突狀細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)、混合淋

2、巴細(xì)胞反應(yīng)檢測(cè)其免疫活性，通過(guò)電轉(zhuǎn)法將HA-1基因轉(zhuǎn)染樹(shù)突狀細(xì)胞，構(gòu)建樹(shù)突狀細(xì)胞核酸疫苗。48小時(shí)后檢測(cè)HA-1蛋白表達(dá)情況。將轉(zhuǎn)染后的樹(shù)突狀細(xì)胞與同基因淋巴細(xì)胞共孵育誘導(dǎo)特異性CTL，應(yīng)用LDH釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其體外殺傷活性。結(jié)果表明：經(jīng)外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)樹(shù)突狀細(xì)胞表型，能刺激同種淋巴細(xì)胞增殖。電轉(zhuǎn)48小時(shí)后，Western blot可檢測(cè)到HA-1蛋白表達(dá)。誘導(dǎo)的CTL體外殺傷活性高于對(duì)照組。結(jié)論：次要組織相容性抗原HA-1可作為造血干細(xì)胞移植后抗白血病治療的靶點(diǎn)。 【關(guān)鍵詞】  樹(shù)突狀細(xì)胞； HA-1基因; 樹(shù)突狀細(xì)胞核酸疫苗; 造血干細(xì)胞移植; 細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞

3、Construction of HA-1-DC Nucleic-acid Vaccine and Induction of Specific Cytotoxic T LymphocytesAbstractThe purpose of this study was to construct a HA-1-DC nucleic acid vaccine and to induce anti-leukemia effect after hematopoietic stem cell transplantation(HSCT). The dendritic cells (DCs) were gener

4、ated from HSCT donors in vitro, and its immunologic activity was studied by using flow cytometry and mix lymphocyte reaction. HA-1 gene was electroporated into the cultured DCs to construct a DC nucleic acid vaccine. After transfecting for 48 hours, the expression of HA-1 protein was detected by Wes

5、tern blot. The DCs were cultured with isogenic lymphocytes to induce specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs). The cytotoxicity of the CTLs was detected by LDH assay. The results showed that the DCs derived from peripheral blood monocytes (PBMCs)  expressed the DC phenotype, and were effective i

6、n stimulating proliferation of the allogenic lymphocytes. After electroporating for 48 hours, HA-1 protein was detected by Western blot. The cytotoxity of inducing CTLs was higher than that in the control group. It is concluded that the minor histocompatibility antigen HA-1 can be considered as a ta

7、rget of immunotherapy against leukemia after HSCT.Key wordsdendritic cell； HA-1 gene； DC nucleic acid vaccine； hematopoietic stem cell transplantation； cytotoxic T lymphocyte樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cell, DC）是目前體內(nèi)功能最強(qiáng)的專(zhuān)職抗原呈遞細(xì)胞（antigen presenting cell, APC），它們能高效攝取、處理抗原，并將多肽呈遞給靜息型T細(xì)胞，誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答，因而成為腫瘤免疫治療中重要的運(yùn)

8、載工具。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將編碼腫瘤表面的抗原基因?qū)隓C構(gòu)建相應(yīng)的核酸疫苗，是近來(lái)腫瘤免疫治療的熱點(diǎn)1，2。異基因造血干細(xì)胞移植（allogeneic hemato- poietic stem cell transplantation, allo-HSCT） 是治療白血病最有效的方法， 但移植后移植物抗宿主病(graft versus host disease, GVHD)和復(fù)發(fā)嚴(yán)重影響了病人的存活率。如何增強(qiáng)移植物抗白血?。╣raft versus leukemia, GVL）效應(yīng)，減少?gòu)?fù)發(fā)同時(shí)又不誘發(fā)GVHD，是移植成功的關(guān)鍵。限制性表達(dá)于造血干細(xì)胞和白血病細(xì)胞表面的次要組織相容性抗原（m

9、inor histocompatibility antigens, mHags）在分離GVL和GVHD中起重要的作用3。 因此， 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用HA-1基因構(gòu)建真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染DC，誘導(dǎo)特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocytes, CTLs），發(fā)揮抗白血病效應(yīng)。材料和方法材料人重組IL-4和GM-CSF均購(gòu)自Peprotech公司，淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自上海試劑二廠(chǎng)，RPMI 1640、絲裂霉素C、MTT均為Sigma公司產(chǎn)品，胎牛血清（FCS）購(gòu)自杭州四季清公司。PE標(biāo)記的鼠抗人單克隆抗體CD80和CD14、FITC標(biāo)記的鼠抗人單克隆抗體CD83和CD86及同型對(duì)照均

10、購(gòu)自eBioscience公司。Xba和BamH限制性?xún)?nèi)切酶、1 kb DNA Marker購(gòu)自MBI公司。膠回收、質(zhì)粒小提、大提試劑盒均購(gòu)自上海華舜公司。T4DNA連接酶為Promega公司產(chǎn)品。抗his單克隆抗體購(gòu)自Novagen公司。人IL-2購(gòu)自北京四環(huán)生物制品廠(chǎng)。pcDNA3.1/hisA和pEGFP-C1 由我院婦科腫瘤中心陳剛博士惠贈(zèng)，pcDNA3.1-HA-1由荷蘭勒登(Leiden)大學(xué)醫(yī)學(xué)中心Dr.Prof.E.A.J.M.Goulmy惠贈(zèng)。流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson公司產(chǎn)品），電轉(zhuǎn)儀（ECM2001 BTX公司產(chǎn)品），電轉(zhuǎn)杯（8mmgap,GTS公司產(chǎn)品

11、），酶標(biāo)儀（Biotech公司產(chǎn)品）。方法DC體外培養(yǎng)取HA-1陰性表達(dá)的移植供者外周血，用淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞，PBS液洗滌3次，用RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，按5×106/ml接種于6孔板中，每孔2 ml，置37、5 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時(shí)，輕輕吹打去除懸浮細(xì)胞，即獲得貼壁的外周血單核細(xì)胞（PBMC），每孔加入2 ml含10FCS的RPMI 1640培養(yǎng)液，加入細(xì)胞因子rhGM-CSF 100 ng/ml及rhIL-4  40 ng/ml。隔天半量換液，補(bǔ)充細(xì)胞因子。于培養(yǎng)第7天收集懸浮細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)分析表型DC懸液用PBS液洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為

12、1×106/ml，加入Eppendorf管，每管100 l，再分別加入PE標(biāo)記的CD80、CD14及FITC標(biāo)記的CD83、CD86，4避光孵育30分鐘，PBS液洗滌，1多聚甲醛固定后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。同種混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)分離健康人外周血獲得單個(gè)核細(xì)胞，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時(shí)，收集懸浮細(xì)胞即同種異體淋巴細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞，刺激細(xì)胞（DC及同基因的PBMC）用完全培養(yǎng)液調(diào)整濃度為1×106/ml，加入終濃度25 g/ml的絲裂霉素C，37孵育30分鐘，PBS液洗滌3次，用含8FCS的RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮調(diào)整濃度，分別以1×103/孔、5×103/孔和1

13、×104/孔加入96孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔再加入1×105反應(yīng)細(xì)胞，終體積為200 l，以未加刺激細(xì)胞的淋巴細(xì)胞為陰性對(duì)照。37、5 CO2 培養(yǎng)72小時(shí)，每孔加入20 l   MTT(5    mg/ml)，避光37溫箱中孵育4小時(shí)，離心去上清，每孔加入200 l  DMSO,取波長(zhǎng)570 nm檢測(cè)A570值。結(jié)果用3孔均值表示。刺激指數(shù)（SI）=加刺激細(xì)胞孔的A570值/陰性對(duì)照孔的A570值。重組人HA-1質(zhì)粒的構(gòu)建用XbaI和BamHI限制性?xún)?nèi)切酶從pcDNA3.1-HA-1中切下358 bp HA-1的cDNA，其中包括T細(xì)胞決定簇VLHDDLLEA，經(jīng)T4DNA連接酶插入pcDNA3.1/hisA的多克隆位點(diǎn)中，經(jīng)過(guò)酶切和測(cè)序確定重組是否準(zhǔn)確，命名為pcDNA3.1/hisA-HA-1。轉(zhuǎn)染DC收集培養(yǎng)7天的DC，用RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌，電轉(zhuǎn)緩沖液（按Eppendorf公司提供的緩沖液配方配置，保證細(xì)胞在其中孵育30分鐘，存活率在90以上）重懸細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×106/ml，加入重組質(zhì)粒，終濃度為20 g/ml。電轉(zhuǎn)條件為：常溫，電壓450 V，80微秒，脈沖1次。在30分鐘內(nèi)完成，加入完全培養(yǎng)