(完整版)PCR技術(shù)(包含引物設(shè)計(jì))

1、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）原理：DNA 的半保留復(fù)制時(shí)，雙鏈 DNA 在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在 DNA 聚合酶與啟動子的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在實(shí)驗(yàn)條件下， DNA 在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制 DNA 的變性和復(fù)性，并設(shè)計(jì)引物做啟動子，加入 DNA 聚合酶、 dNTP 就可以完成特定基因的體外復(fù)制。 PCR類似于 DNA 的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性 - 退火 ( 復(fù)性） - 延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板 DNA 的變性：模板 DNA 經(jīng)加熱至 94

2、左右一定時(shí)間后，使模板 DNA 雙鏈或經(jīng) PCR 擴(kuò)增形成的雙鏈 DNA 解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板 DNA 與引物的退火 (復(fù)性 ) ：模板 DNA 經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至 4060 左右，引物與模板 DNA 單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；引物的延伸： DNA 模板 - 引物結(jié)合物在 DNA 聚合酶的作用下，于 72左右，以 dNTP 為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板 DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需24 分鐘， 2 3 小時(shí)就能

3、將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。PCR技術(shù)分類（常用）（ 1）反向 PCR技術(shù) (Inverse PCR, IPCR) ：反向 PCR是克隆已知序列旁側(cè)序列的一種方法主要原理是用一種在已知序列中無切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶消化基因組 DNA后酶切片段自身環(huán)化以環(huán)化的 DNA 作為模板，用一對與已知序列兩端特異性結(jié)合的引物，擴(kuò)增夾在中間的未知序列。該擴(kuò)增產(chǎn)物是線性的DNA 片段，大小取決于上述限制性內(nèi)切酶在已知基閑側(cè)翼 DNA 序列內(nèi)部的酶切位點(diǎn)分布情況。用不同的限制性內(nèi)切酶消化，可以得到大小不同的模板 DNA，再通過反向 PCR獲得未知片段 。（ 2）錨定 PCR技術(shù) (Anchored PCR, A

4、PCR) ：用酶法在一通用引物反轉(zhuǎn)錄 cDNA3-末端加上一段已知序列 , 然后以此序列為引物結(jié)合位點(diǎn)對該 cDNA 進(jìn)行擴(kuò)增 , 稱為 APCR。（ 3）不對稱 PCR技術(shù) (asymmetric PCR) ：兩種引物濃度比例相差較大的 PCR技術(shù)稱不對稱 PCR。在擴(kuò)增循環(huán)中引入不同的引物濃度 , 常用 50100 1 比例。在最初的 10 15 個(gè)循環(huán)中主要產(chǎn)物還是雙鏈 DNA, 但當(dāng)?shù)蜐舛纫锉幌谋M后 , 高濃度引物介導(dǎo)的 PCR 反應(yīng)就會產(chǎn)生大量單鏈 DNA。（4）反轉(zhuǎn)錄 PCR技術(shù) (reverse transcription PCR, RT-PCR) ：當(dāng)擴(kuò)增模板為 RNA 時(shí)

5、 , 需先通過反轉(zhuǎn)錄酶將其反轉(zhuǎn)錄為 cDNA 才能進(jìn)行擴(kuò)增。應(yīng)用非常廣泛 , 無論是分子生物學(xué)還是臨床檢驗(yàn)等都經(jīng)常采用。（ 5）巢式 PCR技術(shù) (NEST-PCR)：先用一對靶序列的外引物擴(kuò)增以提高模板量 , 然后再用一對內(nèi)引物擴(kuò)增以得到特異的 PCR 帶, 此為巢式 PCR。若用一條外引物作內(nèi)引物則稱之為半巢式PCR。為減少巢式 PCR 的操作步驟可將外引物設(shè)計(jì)得比內(nèi)引物長些 , 且用量較少 , 同時(shí)在第一次 PCR時(shí)采用較高的退火溫度而第二次采用較低的退火溫度 , 這樣在第一次 PCR時(shí) , 由于較高退火溫度下內(nèi)引物不能與模板結(jié)合 , 故只有外引物擴(kuò)增產(chǎn)物 , 經(jīng)過若干次循環(huán) , 待外引

6、物基本消耗盡 , 無需取出第一次 PCR產(chǎn)物 , 只需降低退火即可直接進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。這不僅減少操作步驟 , 同時(shí)也降低了交叉污染的機(jī)會。這種 PCR稱中途進(jìn)退式 PCR，主要用于極少量 DNA 模板的擴(kuò)增。（ 6）多重 PCR技術(shù) (multiplex PCR) ：在同一反應(yīng)中用多組引物同時(shí)擴(kuò)增幾種基因片段 ,如果基因的某一區(qū)段有缺失 ,則相應(yīng)的電泳譜上這一區(qū)帶就會消失。主要用于同一病原體的分型及同時(shí)檢測多種病原體、多個(gè)點(diǎn)突變的分子病的診斷。（ 7）重組 PCR技術(shù)：重組 PCR技術(shù)是在兩個(gè) PCR擴(kuò)增體系中 , 兩對引物分別由其中之一在其 5 -端和 3-端引物上帶上一段互補(bǔ)的序列 ,

7、混合兩種 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 ,經(jīng)變性和復(fù)性 ,兩組 PCR 產(chǎn)物互補(bǔ)序列發(fā)生粘連 ,其中一條重組雜合鏈能在 PCR 條件下發(fā)生聚合延伸反應(yīng) ,產(chǎn)生一個(gè)包含兩個(gè)不同基因的雜合基因。（ 8）原位 PCR技術(shù)：利用完整的細(xì)胞作為一個(gè)微小的反應(yīng)體系來擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的目的片段 ,在不破壞細(xì)胞的前提下 ,利用一些特定的檢測手段來檢測細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物。直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，可進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位，適用于檢測病理切片中含量較少的靶序列。（ 9）熒光定量實(shí)時(shí) PCR技術(shù)反應(yīng)動力學(xué)PCR的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA 擴(kuò)增量呈指數(shù)上升，最終 DNA 擴(kuò)增量可用 Y=(1+X)n 計(jì)算， Y

8、代表 DNA 片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)， X 表示平均每次的擴(kuò)增效率， n 表示循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率理論值為 100% ，但實(shí)際情況達(dá)不到，反應(yīng)初期靶序列DNA 片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的 DNA 片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，此效應(yīng)稱平臺期，與DNA 聚合酶數(shù)量和活性、 PCR擴(kuò)增效率、非特異性產(chǎn)物的競爭等因素有關(guān)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分，短產(chǎn)物片段的長度嚴(yán)格地限定在兩個(gè)引物鏈5端之間，是需要擴(kuò)增的特定片段。短、長產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不同而形成的，以一個(gè)原始模板為例，在第一個(gè)反應(yīng)周期中，以兩條互

9、補(bǔ)的DNA 為模板，引物是從3端開始延伸，其5端是固定的，3端則沒有固定的止點(diǎn)，長短不一，這就是長產(chǎn)物片段。進(jìn)入第二個(gè)反應(yīng)周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新合成的鏈（長產(chǎn)物片段）結(jié)合引物在與新鏈結(jié)合時(shí)，由于新鏈模板的 5端序列是固定的，故這次延伸的片段 3端被固定了止點(diǎn)，保證了新片段的起點(diǎn)、止點(diǎn)都限定于引物擴(kuò)增的序列以內(nèi)，形成長短一致的短產(chǎn)物片段。由于短產(chǎn)物片段是按指數(shù)倍數(shù)增加，而長產(chǎn)物片段則以算術(shù)倍數(shù)增加，故可忽略不計(jì)，使得 PCR 的反應(yīng)產(chǎn)物不需再純化既可以保證足夠純的DNA 片段供分析、監(jiān)測。反應(yīng)五要素 - 引物、模板、 DNA 聚合酶、四種dNTP、Mg2+（1）引物設(shè)計(jì)引物長度

10、： 15-30bp ，常用為 20bp 左右。引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp 為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb 的片段。引物堿基： G+C 含量以 40-60% 為宜， G+C 太少擴(kuò)增效果不佳， G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶。 ATGC 最好隨機(jī)分布，引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能超過 3 個(gè)，一對引物間也不易多于四個(gè)連續(xù)堿基的互補(bǔ)性。 【引物的 GC含量和 Tm 值應(yīng)該協(xié)調(diào)： Tm=4 （G+C ）+2 （ A+T ）】避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3端的互補(bǔ)，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。引物 3端為關(guān)鍵堿基，是PCR延伸的起始端，不能進(jìn)行任何修飾，也

11、不能形成二級結(jié)構(gòu)的可能，一般3端也不能發(fā)生錯(cuò)配，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致 PCR 失敗。 5 端無嚴(yán)格限制，只起限定 PCR產(chǎn)物長度的作用，對擴(kuò)增特異性影響不大，因此常用來引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)， 被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對酶切分析或分子克隆很有好處。引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量： 每條引物的濃度 0.1 1umol 或 10 100pmol ，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會。（ 2）DNA 聚合酶：目前有兩種 Taq

12、DNA 聚合酶供應(yīng)，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR反應(yīng)約需酶量 0.5-2.5 U/50 ml ，濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。（ 3）dNTP 的質(zhì)量與濃度： dNTP 溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以 1M NaOH 或 1M Tris-HCL 的緩沖液將其 PH 調(diào)節(jié)到 7.0 7.5 ，小量分裝， -20 冰凍保存。多次凍融會使 dNTP 降解。在 PCR 反應(yīng)中， dNTP 應(yīng)為 50200umol/L ，尤其是注意 4 種 dNTP 的濃度要相等 ( 等摩爾配制 )，如其中任何一種濃度不同于其它幾

13、種時(shí) ( 偏高或偏低 )，就會引起錯(cuò)配。濃度過低又會降低 PCR 產(chǎn)物的產(chǎn)量。（4）模板 (靶基因 ) 核酸：模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA 純化方法通常采用SDS 和蛋白酶 K 來消化處理標(biāo)本。SDS 的主要功能是：溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白， SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋白酶 K 能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA 結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR 反應(yīng)。（ 5）Mg2+ 濃度： Mg2+ 對 PCR擴(kuò)增的特異性和

14、產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的 PCR反應(yīng)中，各種 dNTP 濃度為 200umol/L時(shí)， Mg2+ 濃度為 1.5 2.0mmol/L 為宜。 Mg2+ 濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會降低Taq DNA合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。聚RT-PCR - 是將 RNA 的反轉(zhuǎn)錄（ RT）和 cDNA 的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（ PCR）相結(jié)合的技術(shù)。總 RNA 提?。?-70保存）Trizol 法：1、取組織 100 于玻璃勻漿器中，加入 1ml Trizol 冰上抽打勻漿（邊勻漿邊暫停）2、移入 1.5mlEP 管中，顛倒混勻，室溫保存5min3、加氯仿 0.2ml （總體積的1/5

15、 ），振蕩混合，室溫放置5min4、4，離心 12000 rpm ，15min5、取上層液相（約 400 l）移入一新 1.5ml EP 管中，加等體積異丙醇（約 400 l）,振蕩混合，室溫保存 10min6、4，離心 12000 rpm ，10min7、棄上清液，加1ml 75% 無水乙醇（ 4保存），振蕩混合8、4，離心 7500 rpm ，5min9、棄上清液，室溫放置 20min(EP 管倒置在濾紙上 )使 RNA 沉淀干燥（不能完全干燥）10、加 20ul DEPC 水至 EP管中，在 60 孵育 3-5min( 或手握3-5min), 使 RNA 充分溶解（可保存在液氮或低溫冰箱

16、-70 ）測 RNA 濃度：走 RNA 變性電泳觀察 18s 、28s 條帶，分光光度計(jì)檢測 260/280 吸光度比值調(diào)零： 750ul DEPC 水測量： 745ul DEPC 水 + 5ul RNA總 RNA 濃度 = OD260 40 稀釋倍數(shù)（ 150 倍） ug/ml= OD26040 150ug/ml= OD2606 ug/ul A1/A2 應(yīng)在 1.8-2.0之間注意：提取RNA 的質(zhì)量主要是要通過260/280 的比值看是不是在 2.0 左右，當(dāng) OD260/OD2801.8 時(shí)提示有蛋白或酚的污染，需要進(jìn)一步純化 RNA；還要跑膠看看 28s 、 18s、 5s 的三條帶是

17、不是清晰，一般質(zhì)量好的 RNA， 28s:18s 的亮度比例在 2:1 左右，最后一條 5s 的應(yīng)該比較淡。逆轉(zhuǎn)錄 RT（ cDNA：一周內(nèi) -20 保存，長期 -70保存）RT 反應(yīng)體系： 20ul 體系第一步：約20 分鐘RNA 抽提物5lRadome 引物2 lRNAsin0.5 l1、65 15 分鐘2、立即放入冰浴第二步：約2 小時(shí)RNAsin0.5l10mM dNTP1l5 RT 緩沖液4l25mM MgCl24 lAMV3l1、37 1.5 小時(shí)2、94 5-10 分鐘3、反應(yīng)物保存于 -20 或進(jìn)行 PCR聚合酶鏈反應(yīng) PCR(產(chǎn)物 -20 保存 )PCR反應(yīng)體系： 100 l

18、 體系約 4.5小時(shí)約5小時(shí)25mM MgCl22 l3l10 PCR緩沖液5l5 l10mM dNTP1 l1l10pmol/ l 上游引物2.5l2.5 l10pmol/ l 下游引物2.5l2.5 lcDNA 模板2.5 l5 lddH2O34 l30lTaq 酶0.5 l1 l輕質(zhì)石蠟油50 l50 l1、94 2 分鐘， 55 1分鐘， 72 2 分鐘 為第一個(gè)步1 個(gè)循環(huán)2、94 45秒， 55 40秒， 72 1 分鐘 為第二步 30/40 個(gè)循環(huán)3、72 10 分鐘4、取出后 4保存， 5 分鐘后 -20保存或走電泳瓊脂糖凝膠電泳：約1.25 小時(shí)1、配制 0.5 TBE 電泳

19、緩沖液300 ml2、配制凝膠濃度 1.7% （ 40ml 0.5 TBE 加 0.68g 膠），微波爐中火 2 分鐘溶解膠，冷卻至 60 加入溴乙錠 2l（ 10mg/ml 的終濃度 0.5 g/ml ），充分混勻3、將溫?zé)岬哪z倒入已置好梳子的膠膜中，在室溫下放置 30-45min 后現(xiàn)進(jìn)行電泳4、加樣 8 l PCR 反應(yīng)產(chǎn)物 +2 l 溴酚蘭 ，空一格加 DNA marker5、電泳 50-80V ，電場強(qiáng)度不宜高于5V/cm6、在紫外燈下觀察 ,DNA 存在則顯示出紅色熒光條帶 ,采用凝膠成像系 統(tǒng)拍照保存。電泳緩沖液 (5 TBE 貯存液 )：Tris 54g 、硼酸 27.5g 、0.5M EDTA 20ml pH8.0 、加蒸溜水至 1000ml 。使用時(shí)，將 5TBE 稀釋 10 倍成 0.5 TBE 就可以在電泳時(shí)使用 (工作濃度 )。上樣緩沖液 (6 緩沖液， 4保存 ) ：0.25% 溴酚藍(lán)、 0.25% 二甲苯青 FF、 30% 甘油瓊脂糖凝膠配制：（ 1.0% ） 1.0g 瓊脂糖 +100ml 電泳緩沖液，微波爐加熱至沸騰 (如果首次煮膠，一定要煮透，以不出現(xiàn)泡沫為標(biāo)志 ) ，熔化的瓊脂物冷卻至 60時(shí)加入 10mg/ml 溴化乙錠5l，充分混勻，將溫?zé)岬哪z倒入已置好梳子的膠膜中，在室溫下放置 30-45min( 可以放入 4