丙型肝炎病毒NS5A蛋白功能的研究進(jìn)展

1、丙型肝炎病毒NS5A蛋白功能的研究進(jìn)展                     作者：周友乾，尹鳳鳴 馮經(jīng)華【關(guān)鍵詞】  丙型肝炎 病毒NS5A 蛋白丙型肝炎病毒(HCV)可引起肝炎、肝硬化和肝癌等一系列肝臟疾病，且慢性化幾率較高。目前全世界HCV感染人數(shù)仍呈增加趨勢(shì)，因此科學(xué)家對(duì)HCV的研究高度重視。HCV有一個(gè)大的開放閱讀框編碼約三千多個(gè)氨基酸的多聚蛋白，經(jīng)蛋白酶裂解為十個(gè)多肽片段;

2、氨基末端為結(jié)構(gòu)蛋白包括有核心蛋白、包膜蛋白E1和E2、P7蛋白;羧基末端為非結(jié)構(gòu)蛋白包括有NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白?；蠳S5A蛋白位于HCV多聚蛋白前體的1973-2419氨基酸區(qū)域，由447個(gè)氨基酸組成，氨基末端為雙親性螺旋可與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合。NS5A還包含有3個(gè)同樣的ProXaaXaaPro基序，這些基序存在于許多信號(hào)蛋白中形成伸展的螺旋，并與Src同源3(SH3)功能區(qū)結(jié)合。根據(jù)NS5A上絲氨酸殘基磷酸化程度的不同有p56和p58兩種成熟形式。越來(lái)越多的科學(xué)家推測(cè)NS5A蛋白可能在HCV干擾宿主細(xì)胞內(nèi)信號(hào)和免疫逃避方面有一定的作用，發(fā)表了不少論文。本文就

3、NS5A蛋白功能和作用機(jī)制的研究進(jìn)展作一綜述。1 與病毒復(fù)制的關(guān)系Lohmann等1最早運(yùn)用亞基因組復(fù)制子系統(tǒng)研究提出NS5A與RNA復(fù)制有關(guān)。隨后研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)NS5A的雙親性膜靶標(biāo)螺旋的變異與復(fù)制子有關(guān)，導(dǎo)入三個(gè)螺旋分裂的突變可完全終止復(fù)制子建立G418耐藥的克隆，意味著NS5A的膜結(jié)合是HCVRNA復(fù)制不可缺少的一步。體外臨時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞研究顯示NS5A和NS5B結(jié)合是由NS5A的105-162和277-334殘基與NS5B上的四個(gè)不連續(xù)的區(qū)域相結(jié)合。奇怪的是當(dāng)他們的比例為0.1或更低時(shí)，NS5A可適度刺激NS5B的聚合酶活性，而更高的比例時(shí)NS5A抑制NS5B的聚合酶活性。具體機(jī)制目前還不

4、清楚，分析認(rèn)為有可能是體外純化的NS5A和NS5B融合蛋白的作用結(jié)果并不能準(zhǔn)確地反映他們?cè)隗w內(nèi)的情況。Shimakami等刪除NS5A中與NS5B結(jié)合的部分導(dǎo)致亞基因組復(fù)制子無(wú)功能，而如果刪除部分不影響NS5A與NS5B結(jié)合則復(fù)制子仍能復(fù)制，因此推測(cè)NS5A與NS5B之間的相互作用是HCV RNA復(fù)制所必需的。用人類肝細(xì)胞cDNA文庫(kù)的酵母雙雜交篩選法研究細(xì)胞蛋白與NS5A蛋白的相互作用鑒定出33kD人類囊相關(guān)膜蛋白(hVAP-33)。體外連接及體內(nèi)聯(lián)合免疫沉淀作用研究，證實(shí)NS5A與hVAP-33之間有相互作用，病毒RNA依賴的RNA聚合酶NS5B也與hVAP-33作用，它倆分別結(jié)合到hVA

5、P-33的羧基末端和氨基末端，NS5A和NS5B同時(shí)與hVAP獨(dú)立作用。免疫熒光顯示，hVAP-33主要與ER、高爾基復(fù)合體、以及前溶酶體結(jié)合。hVAP可以作為HCV復(fù)制復(fù)合物的膜受體，介導(dǎo)HCV復(fù)制復(fù)合物與膜結(jié)合，NS5A及NS5B與hVAP-33的相互作用可能會(huì)影響宿主細(xì)胞的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)功能。研究還發(fā)現(xiàn)在一些HCV分離株中有一被稱為干擾素敏感決定區(qū)(ISDR)內(nèi)的突變率與病毒RNA滴度成負(fù)相關(guān)，在人肝細(xì)胞內(nèi)NS5A的表達(dá)可活化內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site, IRES)活性，而ISDR突變則破壞IRES活性，這也預(yù)示著NS5A蛋白可能在調(diào)節(jié)HCV復(fù)

6、制中起作用。最近Okamoto等發(fā)現(xiàn)NS5A在細(xì)胞質(zhì)中與FK506結(jié)合蛋白8的相互作用也在HCV復(fù)制中發(fā)揮重要作用。2 與干擾素抗病毒治療的關(guān)系Enomoto等通過(guò)分子流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)NS5A與干擾素(IFN)治療的療效相關(guān)，并鑒定出NS5A中一個(gè)約40個(gè)氨基酸的序列在IFN耐藥種株中相對(duì)保守，而在IFN敏感種株中變異率較高，因此，推測(cè)NS5A在IFN耐藥中發(fā)揮一定的作用，并把這個(gè)氨基酸序列區(qū)稱為ISDR。隨后科學(xué)家10還發(fā)現(xiàn)：表達(dá)有IFN耐藥的HCV1b種株的NS5A蛋白的細(xì)胞對(duì)IFN部分耐藥，并允許腦心肌炎病毒和口腔炎小皰疹病毒生長(zhǎng);而在同樣的實(shí)驗(yàn)中表達(dá)IFN敏感的HCV1a或HCV2a基

7、因型或者刪除了ISDR的HCV1b型的NS5A蛋白并不能抑制IFN的活性。Nousbaum等11認(rèn)為NS5A羧基末端ISDR以外的一段序列也與IFN活性有關(guān)。IFN是由宿主不同類型的細(xì)胞為應(yīng)對(duì)病毒感染和某些刺激而分泌的細(xì)胞因子，分為型和型。型IFN(，)是由各類細(xì)胞針對(duì)病毒感染分泌的抗病毒活性多肽，表現(xiàn)出非特異性免疫應(yīng)答特點(diǎn);型IFN也稱為IFN是由促有絲分裂素或抗原刺激激活的T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌的抗病毒多肽，充當(dāng)特異性抗原免疫應(yīng)答的任務(wù)。型IFN信號(hào)途徑的傳遞始于IFN與特異性細(xì)胞表面IFN受體的結(jié)合。IFN與細(xì)胞膜上受體結(jié)合，引起受體二聚體化，受體胞內(nèi)區(qū)的酪氨酸殘基在Janus激酶作用下磷

8、酸化，而后信號(hào)傳遞體和轉(zhuǎn)錄激活劑(STATS)也被Janus激酶磷酸化。兩種Janus激酶酶家族成員JAK1和Tyk2，參與了型IFN信號(hào)傳導(dǎo)。磷酸化的STAT1和STAT2結(jié)合成異二聚體，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)與DNA結(jié)合蛋白p48結(jié)合，形成三聚體的干擾素激活基因因子3(ISGF3)。ISGF3在許多IFN激活基因啟動(dòng)區(qū)與IFN激活順式作用元件(ISRE)結(jié)合促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。除了ISGF3外，不同的STAT和二聚體以及不同的IFN轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在IFN信號(hào)傳遞途徑中也起重要作用。大量IFN激活基因表達(dá)，其蛋白產(chǎn)物介導(dǎo)IFN多效性抗病毒作用。目前認(rèn)為IFN抗RNA病毒的主要機(jī)制是其能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種dsRN

9、A依賴的蛋白激酶(PKR)，這種PKR在RNA病毒基因復(fù)制時(shí)與dsRNA結(jié)合而激活，激活后能夠磷酸化翻譯啟始因子eIF-2a亞單位的51位絲氨酸殘基，使磷酸化的eIF-2a無(wú)法參與蛋白多肽鏈的翻譯過(guò)程，從而抑制病毒或細(xì)胞蛋白的合成，達(dá)到抗病毒的效果12。而研究發(fā)現(xiàn)NS5A中ISDR及與其相臨的羧基末端的26個(gè)殘基與PKR的一個(gè)二聚作用區(qū)域結(jié)合后能夠抑制PKR自身的磷酸化和對(duì)其他外來(lái)物質(zhì)的磷酸化從而抑制PKR活性。不過(guò)也有科學(xué)家13，14報(bào)道未能發(fā)現(xiàn)ISDR與IFN療效的關(guān)系。Podevin等15雖然證實(shí)NS5A能夠抑制IFN抗腦心肌炎病毒和口腔炎小皰疹病毒的活性，但不管是IFN敏感的還是不敏感

10、的NS5A在Huh7或HeLa細(xì)胞中都未觀察到對(duì)PKR活性的影響，用共免疫沉淀和共免疫熒光方法也未檢測(cè)到NS5A和PKR的相互作用。這提示NS5A可能還通過(guò)其他機(jī)制抑制IFN的抗病毒活性。Khabar等16發(fā)現(xiàn)白介素8(IL8)能夠減弱IFN的抗病毒活性，提示內(nèi)源性的IL8的產(chǎn)生有助于病毒的感染。Polyak等17也發(fā)現(xiàn)HCV感染的患者血清中IL8的水平高于對(duì)照組，IFN無(wú)應(yīng)答組高于應(yīng)答組，并提出NS5A能夠促進(jìn)IL8的產(chǎn)生并減弱IFN的抗病毒活性。隨后Girard等18用芯片分析法觀察到了同樣的現(xiàn)象。Blindenbacher等19發(fā)現(xiàn)表達(dá)有HCV全基因組的轉(zhuǎn)基因小鼠IFN刺激轉(zhuǎn)錄因子ISG

11、F3的DNA結(jié)合活性降低，而淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒易感性增加。Shuai等20認(rèn)為Stats的絲氨酸磷酸化在IFN信號(hào)的調(diào)節(jié)方面起著關(guān)鍵性的作用。Macdonald等21推測(cè)NS5A可能通過(guò)與連接蛋白Grb2相互作用抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)MAPK的活性;這樣，NS5A可降低Stat1絲氨酸的磷酸化并減弱細(xì)胞對(duì)IFN的反應(yīng)。然而，他們22隨后發(fā)現(xiàn)對(duì)IFN敏感和耐藥的HCV不同基因型的NS5A都能與Grb2結(jié)合，似乎并不支持這個(gè)假說(shuō)。3 與促進(jìn)宿主細(xì)胞有絲分裂的關(guān)系HCV能夠通過(guò)調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的有絲分裂信號(hào)途

12、徑來(lái)調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)和活性，從而維持其慢性感染狀態(tài)。目前認(rèn)為主要有三種途徑：ERK途徑、SAPK/JNK途徑和p38MAPK途徑23。他們都是基于一個(gè)包含有MAPK的三重激酶信號(hào)組件，NS5A能夠調(diào)節(jié)這三種MAPK信號(hào)途徑。NS5A能夠抑制ERK MAPK途徑：體外研究顯示NS5A能夠與Grb2結(jié)合。Grb2能夠通過(guò)一個(gè)SH2區(qū)與活化的EGF受體上磷酸化的酪氨酸殘基結(jié)合使鳥嘌呤核苷酸交換因子Sos遷移到細(xì)胞膜，然后催化Ras GDP-GTP轉(zhuǎn)換，并激活ERK途徑22。Tan等24報(bào)道NS5A并不阻止Grb2-Sos復(fù)合體的形成，而后Hanafusa等進(jìn)一步證實(shí)NS5A能與Grb2 SH2區(qū)結(jié)

13、合抑制Grb2-Sos與生長(zhǎng)因子受體結(jié)合，并未抑制Grb2-Sos的結(jié)合。NS5A能夠活化JNK MAPK信號(hào)途徑：NS5A與連接蛋白TRAF2結(jié)合，再與配體上的TNF受體結(jié)合，參與JNK的活化25。Park等26認(rèn)為NS5A不是直接活化JNK，僅僅是通過(guò)TNF增強(qiáng)其活性。NS5A還可通過(guò)與TRAF2相互作用調(diào)節(jié)JNK的活性，在缺乏TNF時(shí)，NS5A也能夠通過(guò)足夠表達(dá)TRAF2調(diào)節(jié)JNK的活性。NS5A也能夠抑制EGF刺激的p38MAPK的活性：這條途徑在通過(guò)下游靶標(biāo)控制蛋白翻譯方面起著關(guān)鍵性的作用，主要是磷酸化翻譯啟始因子eIF4E和調(diào)節(jié)其活性。NS5A的表達(dá)能夠降低eIF4E的磷酸化27。

14、4 與細(xì)胞凋亡的關(guān)系NS5A能夠利用多種機(jī)制抑制外源性和內(nèi)源性凋亡刺激因子減少宿主細(xì)胞的凋亡。TNF是一種主要的外源性凋亡刺激因子，研究表明28，29表達(dá)NS5A蛋白的細(xì)胞能夠抵擋TNF的作用，與對(duì)照組相比細(xì)胞凋亡明顯減少。生物化學(xué)分析顯示NS5A與TNF應(yīng)答連接蛋白TRADD相互作用調(diào)節(jié)抑制TNF-信號(hào)。TRADD與配體上活化的TNF受體結(jié)合并形成一個(gè)復(fù)合體，這個(gè)復(fù)合體再向多個(gè)下游的效應(yīng)器(胱門蛋白酶、NF-B等)傳達(dá)信號(hào);NS5A與TRADD結(jié)合能夠阻斷這些信號(hào)。內(nèi)源性的凋亡主要通過(guò)促凋亡和抗凋亡信號(hào)的平衡來(lái)調(diào)節(jié)，例如Bcl2蛋白家族包含有促凋亡和抗凋亡成分，他們?cè)诰€粒體和細(xì)胞核膜上受Bc

15、l-2相似區(qū)域(BH)間相互作用的驅(qū)動(dòng)形成異二聚體。這家族中不同成分之間的平衡指導(dǎo)著凋亡反應(yīng)30。Chung等31發(fā)現(xiàn)Bcl2家族抗凋亡成分的BH區(qū)域與ISDR序列具有相似性。NS5A內(nèi)的BH區(qū)域能夠和促凋亡的Bcl2蛋白(Bax)結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這需要NS5A和Bax都存在于細(xì)胞核內(nèi);然而，完整的NS5A只存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。目前認(rèn)為是凋亡細(xì)胞中的caspase家族切割了NS5A全長(zhǎng)蛋白致使其內(nèi)部穩(wěn)含的核定位信號(hào)暴露出來(lái)，從而使NS5A進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮功能32。在DNA損傷或不正常復(fù)制時(shí)p53是一種內(nèi)源性凋亡信號(hào)。Majumder等33發(fā)現(xiàn)NS5A在細(xì)胞漿中能與p53結(jié)合形成復(fù)合物，封閉了p5

16、3與其特異DNA序列的結(jié)合區(qū)域或使p53發(fā)生空間構(gòu)形變化導(dǎo)致結(jié)合區(qū)域隱蔽起來(lái)，抑制p53與DNA序列結(jié)合，使p53的反式激活作用減退，從而影響了p53下游基因(p21等)的活化和表達(dá)。NS5A還能粘附于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜并介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激，產(chǎn)生應(yīng)激后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子34，后者被線粒體吸收使跨膜電位發(fā)生改變，導(dǎo)致線粒體內(nèi)氧化活性產(chǎn)物(ROS)水平升高，進(jìn)而介導(dǎo)NF-B和STAT3的激活和核轉(zhuǎn)位;發(fā)揮它們調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的生物效應(yīng)，抑制p53的功能及其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用。龔國(guó)忠等35也研究證實(shí)NS5A能減弱DNA損傷劑誘導(dǎo)的G1期阻滯并阻斷S期停滯，推測(cè)這可能使細(xì)胞DNA受到損傷時(shí)不能得到及時(shí)有效的修復(fù)，細(xì)胞在

17、病理狀態(tài)下繼續(xù)增殖分化，最后導(dǎo)致細(xì)胞功能和表型改變，是HCV致腫瘤病變的細(xì)胞分子機(jī)制之一。最近Inubushi等36發(fā)現(xiàn)NS5A還可能通過(guò)抑制Syk激酶的活性而導(dǎo)致宿主肝細(xì)胞癌變。         【參考文獻(xiàn)】  1Lohmann V, Korner F, Koch JO, et al. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell lineJ.Science, 1999, 285110-113.Elazar M,

18、Cheong KH, Liu P, et al. Amphipathic helix-dependent localization of NS5A mediates hepatitis C virus RNA replicationJ.J Virol, 2003, 776055-6061.Shirota Y, Luo H, Qin WP, et al. Hepatitis C virus (HCV) NS5A binds RNA-dependent RNA polymerase (RdRP) NS5B and modulates RNA-dependent RNA polymerase act

19、ivityJ.J Biol Chem, 2002, 27711149-11155.Qin W, Yamashita T, Shirota Y, et al. Mutational analysis of the structure and functions of hepatitis C virus RNA-dependent RNA polymeraseJ.Hepatolog, 2001, 33728-737.Shimakami T, Hijikata M, Luo H, et al. Effect of interaction between hepatitis C virus NS5A

20、and NS5B on hepatitis C virus RNA replication with the hepatitis C virus repliconJ.J Virol, 2004, 782738-2748.Iusida MI, Nagano Fujii M, Nidom CA, et al. Correlation between mutations in the interferon sensitivity-determining region of NS5A protein and viral load of hepatitis C virus subtypes 1b, 1c

21、, and 2aJ.J Clin Microbiol, 2001, 39(11)3858-3864.He Y, Yan W, Coito C, et al. The regulation of hepatitis C virus (HCV) internal ribosome-entry site-mediated translation by HCV replicons and nonstructural proteinsJ.J Gen Virol, 2003, 84(3)535-543.Okamoto T, Omori H, Kaname Y, et al. A single-amino-

22、acid mutation in hepatitis C virus NS5A disrupting FKBP8 interaction impairs viral replicationJ.J Virol. 2008, 82(7)3480-3489.Enomoto N, Sakuma L, Asahina Y, et al. Mutations in the nonstructural protein 5A gene and response to interferon in patients with chronic hepatitis C virus 1b infectionJ.N En

23、gl J Med, 1996,33477-81.10Noguchi T, Satoh S, Noshi T, et al. Effects of mutation in hepatitis C virus nonstructural protein 5A on interferon resistance mediated by inhibition of PKR kinase activity in mammalian cellsJ.Microbiollmmunol, 2001,45829-840.11Nousbaum JB, Polyak SJ, Ray SC, et al. Prospec

24、tive characterization of full-length hepatitis C virus NS5A quasispecies during induction and combination antiviral therapyJ.J Virol, 2000,749028-9038.12Williams BR. Signal integration via PKRJ.SciSTKE, 2001,89RE2.13Paterson M, Laxton CD, Thomas HC, et al. Hepatitis C virus NS5A protein inhibits int

25、eferon antiviral activity, but the effects do not correlate with clinical responseJ.Gastroenterology, 1999,1171187-1197.14Aizaki H, Saito S, Ogino T, et al. Suppression of interferon-induced antiviral activity in cells expressing hepatitis C virus proteinsJ.J Interferon Cytokine Res, 2000,201111-1120.15Podevin P, Sabile A, Gajardo R, et al. Expression of hepatitis C virus NS5A natural mutants in a hepatocytic cell line inhibits the antiviral effect of interferon in a PKR-independent mannerJ.Hepatology, 2001,331503-1511.16Khabar KS, Al-Zoghaibi F, Al-Ahdal M