專題5 DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)

1、專題5 DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)【課題目標(biāo)】本課題通過嘗試對(duì)植物或動(dòng)物組織中的DNA進(jìn)行粗提取，了解DNA的物理化學(xué)性質(zhì)，理解DNA粗提取以及DNA鑒定的原理?！菊n題重點(diǎn)與難點(diǎn)】課題重點(diǎn)：DNA的粗提取和鑒定方法。課題難點(diǎn)：DNA的粗提取和鑒定方法。【知識(shí)要點(diǎn)】1. DNA的物理化學(xué)性質(zhì)，尤其是DNA的溶解性；2. 2.二苯胺法鑒定DNA的方法和原理。學(xué)習(xí)導(dǎo)航DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)，包括DNA的提取、蛋白質(zhì)的提取、DNA片段的擴(kuò)增等，是開展分子生物學(xué)研究的基本技術(shù)。本專題將從基礎(chǔ)入手，學(xué)習(xí)DNA的粗提取、PCR技術(shù)和血紅蛋白的提純。學(xué)習(xí)這些技術(shù)，不僅能夠幫助學(xué)生初步了解分子生物學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)方法，而且能夠

2、鞏固必修課中學(xué)習(xí)的有關(guān)DNA和蛋白質(zhì)的理論知識(shí)。本專題的3個(gè)課題相對(duì)獨(dú)立，沒有嚴(yán)格的先后順序。課題1的操作難度不高，學(xué)生比較容易獲得結(jié)果。課題2的操作難度也不高，但PCR技術(shù)的原理是難點(diǎn)，學(xué)生要充分利用教材的圖文資料，并且在教師的引導(dǎo)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。課題3的操作難度比較大，所以學(xué)生一定要在教師的精心指導(dǎo)下完成操作。課題1 DNA的粗提取與鑒定導(dǎo)學(xué)誘思1提取DNA的方法提取生物大分子的基本思路是 。對(duì)于DNA的粗提取而言，就是要利用 、 等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分。1）DNA的溶解性 DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的 中溶解度不同，利用這一特點(diǎn)，選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度就

3、能使 充分溶解，而使雜質(zhì)沉淀，或者相反，以達(dá)到分離目的。 圖51是DNA在NaCl溶液中的溶解度曲線，請(qǐng)根據(jù)曲線圖，思考：在什么濃度下，DNA的溶解度最小？DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何變化的？如何通過控制NaCl溶液的濃度使DNA在鹽溶液中溶解或析出？此外，DNA不溶于 溶液，但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)則溶于酒精。利用這一原理，可以將DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)一步的分離。2）DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性 蛋白酶能水解 ，但是對(duì) 沒有影響。大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受6080oC的高溫，而DNA在 以上才會(huì)變性。洗滌劑能夠瓦解 ，但對(duì)DNA沒有影響。3）DNA的鑒定 在 條件下，DNA遇 會(huì)被染成 色，因

4、此二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑。2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1）實(shí)驗(yàn)材料的選取 凡是含有 的生物材料都可以考慮，但是使用 的生物組織，成功的可能性更大。在下面的生物材料中選取適合的實(shí)驗(yàn)材料：魚卵、豬肝、菜花（花椰菜）、香蕉、雞血、哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞、獼猴桃、洋蔥、豌豆、菠菜、在液體培養(yǎng)基的大腸桿菌思考：哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞的特點(diǎn)？2）破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液 動(dòng)物細(xì)胞的破碎比較容易，以雞血細(xì)胞為例，在雞血細(xì)胞液中加入一定量的 ，同時(shí)用 攪拌，過濾后收集濾液即可。如果實(shí)驗(yàn)材料是植物細(xì)胞，需要先用 溶解細(xì)胞膜。例如，提取洋蔥的DNA時(shí)，在切碎的洋蔥中加入一定的 和 ，進(jìn)行充分的攪拌和研磨，過濾后收集研磨液。思考：為

5、什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂？加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？如果研磨不充分，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響?此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分？3）去除濾液中的雜質(zhì) 閱讀課本的三個(gè)方案，思考：為什么反復(fù)地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)？方案二與方案三的原理有什么不同？4）DNA的析出與鑒定 將處理后的溶液過濾，加入與濾液體積 、冷卻的 ，靜置 ，溶液中會(huì)出現(xiàn) ，這就是粗提取的DNA。用玻璃棒 攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水分。取兩支20ml的試管，各加入物質(zhì)的量濃度為 的NaCl溶液5ml，將絲狀物放入其中一支試管中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解。然后，向兩支試管中各加入4ml的

6、?；旌暇鶆蚝螅瑢⒃嚬苤糜?中加熱5min，待試管冷卻后，比較兩支試管溶液顏色的變化，看看溶解有DNA的溶液是否變 。3操作提示以血液為實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，每100ml血液中需要加入3g ，防止 。加入洗滌劑后，動(dòng)作要 、 ，否則容易產(chǎn)生大量的泡沫，不利于后續(xù)步驟地操作。加入酒精和用玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要 ，以免 ，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。二苯胺試劑要 ，否則會(huì)影響鑒定的效果。4結(jié)果分析與評(píng)價(jià)疑難點(diǎn)撥1 DNA的溶解度與NaCl溶液濃度的關(guān)系：當(dāng)NaCl溶液濃度低于0.14mol/L時(shí)，隨濃度的升高，DNA的溶解度降低；當(dāng)NaCl溶液濃度高于0.14mol/L時(shí)，隨濃度升高，DNA的溶解度升高。2

7、 制備雞血細(xì)胞液時(shí)，要在新鮮的雞血中加入檸檬酸鈉的原因制備雞血細(xì)胞液時(shí)，要在新鮮的雞血中加入抗凝劑檸檬酸鈉，防止血液凝固。其原理是檸檬酸鈉能與血漿中Ca2+發(fā)生反應(yīng)，生成檸檬酸鈣絡(luò)合物，血漿中游離的Ca2+大大減少，血液便不會(huì)凝固，因?yàn)殡u血紅細(xì)胞，白細(xì)胞都有細(xì)胞核，DNA主要存在于細(xì)胞核中，所以在離心或靜置沉淀后，要棄出上層清液血漿。3提取DNA的第一步是材料的選取，其目的是一定要選取DNA含量較高的生物材料，否則會(huì)由于實(shí)驗(yàn)過程中或多或少的損失而造成檢測的困難；第二步是DNA的釋放和溶解，這一步是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵，要盡可能使細(xì)胞內(nèi)的DNA全部溶解；第三步是DNA的純化，即根據(jù)DNA的溶解特性

8、、對(duì)酶及高溫的耐受性的不同等特性，最大限度地將DNA與雜質(zhì)分開；最后一步是對(duì)DNA進(jìn)行鑒定，這是對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的檢測。4在DNA的析出的步驟中用到玻璃棒攪拌時(shí)，注意動(dòng)作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。5盛放雞血細(xì)胞液的容器，最好是塑料容器。雞血細(xì)胞破碎以后釋放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，由于細(xì)胞內(nèi)DNA的含量本來就比較少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就會(huì)更少。因此，實(shí)驗(yàn)過程中最好使用塑料的燒杯和試管，這樣可以減少提取過程的DNA的損失。典例解析本實(shí)驗(yàn)中有三次過濾：過濾用蒸餾水稀釋過的雞血細(xì)胞液過濾溶解有DNA的2mol/LNaCl溶液以上三次

9、過濾分別為了獲得（ ）A含核物質(zhì)的濾液、紗布上的粘稠物、含DNA的濾液B含核物質(zhì)的濾液、濾液中DNA粘稠物、含DNA的濾液C含核物質(zhì)的濾液、濾液中DNA粘稠物、紗布上的DNAD含較純的DNA濾液、紗布上的粘稠物、含DNA的濾液答案：A解析:用蒸餾水稀釋雞血細(xì)胞液，使血細(xì)胞的細(xì)胞膜、核膜破裂，釋放出核物質(zhì)，此時(shí)過濾只能得到含DNA和其他物質(zhì)如蛋白質(zhì)的濾液，這種濾液必須經(jīng)過實(shí)驗(yàn)中其他步驟得相繼處理，方能得到較純的DNA。DNA在0.13mol/LNaCl溶液中溶解度最低，成絲狀粘稠物，可經(jīng)過濾留在紗布上?！菊n本問題答案和提示】（一）旁欄思考題1為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂？答：蒸餾水對(duì)于雞血細(xì)

10、胞來說是一種低滲液體，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)，使血細(xì)胞脹裂，再加上攪拌的機(jī)械作用，就加速了雞血細(xì)胞的破裂(細(xì)胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA。2加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？答：洗滌劑是一些離子去污劑，能溶解細(xì)胞膜，有利于DNA的釋放；食鹽的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。3如果研磨不充分，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響？答：研磨不充分會(huì)使細(xì)胞核內(nèi)的DNA釋放不完全，提取的DNA量變少，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等。4此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分？答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等雜質(zhì)。5為什么反復(fù)地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)？答：用

11、高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過反復(fù)溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)。6方案二與方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開；方案三利用的是DNA和蛋白質(zhì)對(duì)高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離。（二）練習(xí)1答：提取DNA的第一步是材料的選取，其目的是一定要選取DNA含量較高的生物材料，否則會(huì)由于實(shí)驗(yàn)過程中或多或少的損失而造成檢測的困難；第二步是DNA的釋放和溶解，這一步是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵，要盡可能使細(xì)胞內(nèi)的DNA全部溶解；第

12、三步是DNA的純化，即根據(jù)DNA的溶解特性、對(duì)酶及高溫的耐受性的不同等特性，最大限度地將DNA與雜質(zhì)分開；最后一步是對(duì)DNA進(jìn)行鑒定，這是對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的檢測。2答：提取蛋白質(zhì)比提取DNA的難度大。這是因?yàn)?，與DNA相比，蛋白質(zhì)對(duì)溫度、鹽濃度、pH等條件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)多種多樣，理化性質(zhì)各不相同，使得蛋白質(zhì)的提取沒有一種統(tǒng)一的方法，只能根據(jù)特定蛋白質(zhì)的特性摸索提取的條件，設(shè)計(jì)特定的方法。課堂演練一、選擇題（10個(gè)）1.在研究DNA的基因樣本前，采集來的血樣需要蛋白水解酶處理，然后用有機(jī)溶劑除去蛋白質(zhì)。用蛋白水解酶處理血樣的目的是（ D ）D.除去血細(xì)胞中的所有的蛋

13、白質(zhì)，使DNA釋放，便于進(jìn)一步提純2與析出DNA粘稠物有關(guān)的敘述，不正確的是（ C ）A.操作時(shí)緩緩滴加蒸餾水，降低DNA的溶解度 B.在操作A時(shí)，用玻璃棒輕緩攪拌，以保證DNA分子完整 C.加蒸餾水可同時(shí)降低DNA和蛋白質(zhì)的溶解度，兩者均可析出3洗滌劑能夠瓦解（ B ），但對(duì)DNA沒有影響。4在沸水浴的條件下，DNA遇（ D ）會(huì)被染成藍(lán)色。5在DNA提取過程中，最好使用塑料試管和燒杯，目的是（ B ）6下列操作中，對(duì)DNA的提取量影響最小的是（ B ）A.使雞血細(xì)胞在蒸餾水中充分破裂，放出DNA等核物質(zhì)B.攪拌時(shí)，要使用玻璃棒沿一個(gè)方向輕緩攪拌“析出DNA粘稠物”時(shí)，要緩緩加蒸餾水，直至溶

14、液中粘稠物不再增加D.在用酒精沉淀DNA時(shí)，要使用冷酒精，甚至再將混合液放入冰箱中冷卻E在DNA的溶解和再溶解時(shí)，要充分?jǐn)嚢?DNA的粗提取中，將與濾液體積相等的、冷卻的（ D ），靜置23min，溶液中會(huì)出現(xiàn)白色絲狀物。8.以血液為實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，需要向血液中加入（ C ），防止血液凝固。9.在向溶解DNA的NaCl溶液中，不斷加入蒸餾水的目的是（ C ）A.加快溶解DNA的速度 B.加快溶解雜質(zhì)的速度 C.減少DNA的溶解度，加快DNA析出 D.減小雜質(zhì)的溶解度，加快雜質(zhì)的析出10.去除濾液中的雜質(zhì)時(shí)，直接在濾液中加入嫩肉粉，利用嫩肉粉中的（ C ）分解蛋白質(zhì)。二、非選擇題（3個(gè)）1提取雞血中

15、DNA時(shí)，要除去血液中的上清液，這是因?yàn)槭裁?？答案：因?yàn)樯锨逡菏茄獫{，不含有血細(xì)胞，DNA存在于沉郁試管底部的雞血細(xì)胞的細(xì)胞核中，所以提取雞血中的DNA時(shí)，要除去血液中的上清液。2填寫本實(shí)驗(yàn)完成下列實(shí)驗(yàn)操作時(shí)所用試劑。提取雞血細(xì)胞中核物質(zhì) 溶解核內(nèi)DNA： 析出2mol/LNaCl溶液中的DNA DNA粘稠物的再溶解 提取雜質(zhì)較少的DNA白色乳狀絲狀物 DNA的鑒定 答案：蒸餾水2mol/LNaCl溶液蒸餾水2mol/LNaCl溶液冷卻的95%的酒精二苯胺3.關(guān)于DNA粗提取的實(shí)驗(yàn)材料的選擇，也經(jīng)過了多次實(shí)驗(yàn)效果的比較，最終選擇雞血做實(shí)驗(yàn)材料的原因是什么？請(qǐng)回答下列問題：雞血細(xì)胞中紅細(xì)胞 ，家

16、雞屬于鳥類，新陳代謝旺盛，因而血液中 細(xì)胞樹木較多，可以提供豐富的 。實(shí)驗(yàn)前由老師制備血細(xì)胞液供同學(xué)們做實(shí)驗(yàn)材料，而不用雞全血，主要原因是 。生活在牧區(qū)的人們，采集牛、羊和馬血比較方便，若他們按實(shí)驗(yàn)要求完成實(shí)驗(yàn)步驟后，結(jié)果是 ，這是因?yàn)檫@些動(dòng)物和人一樣，成熟的紅細(xì)胞中 ，但若改用動(dòng)物肝臟做實(shí)驗(yàn)材料，實(shí)驗(yàn)?zāi)茼樌M(jìn)行。這是因?yàn)?。若選用動(dòng)物肝臟做實(shí)驗(yàn)材料，在提取之前，最好增加 程序，使組織細(xì)胞更易分離。答案：含細(xì)胞核；紅；DNA 雞血細(xì)胞液中DNA相對(duì)含量很難提取到DNA；無細(xì)胞核；肝細(xì)胞有細(xì)胞核研磨【知識(shí)拓展】DNA中嘌呤核苷酸上的脫氧核糖遇酸生成-羥基-酮基戊醛，它再和二苯胺作用而呈現(xiàn)藍(lán)色(溶

17、液呈淺藍(lán)色)。鑒定時(shí)溶液藍(lán)色的深淺，與溶液中DNA含量的多少有關(guān)。Tris/HCl:提供緩沖體系，DNA在這一體系中呈穩(wěn)定態(tài)（Tris為三羥甲基氨基甲烷）。EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）：是DNA酶的抑制劑，可以防止細(xì)胞破碎后DNA酶降解DNA。SDS（十二烷基磺酸鈉）：可以使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離?！窘虒W(xué)反思】課題2 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段【課題目標(biāo)】本課題通過嘗試PCR（DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)的基本操作，使學(xué)生體驗(yàn)PCR這一常規(guī)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，理解PCR的原理，討論P(yáng)CR的應(yīng)用?！菊n題重點(diǎn)與難點(diǎn)】課題重點(diǎn)：PCR的原理和PCR的基本操作。課題難點(diǎn)：PCR的原理。導(dǎo)學(xué)誘思1P

18、CR原理填寫下列表格參與的組分在DNA復(fù)制中的作用解旋酶DNA母鏈合成子鏈的原料DNA聚合酶引物DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械模ǔNA的羥基末端稱為 ，而磷酸基團(tuán)的末端稱為 。DNA聚合酶不能 開始合成DNA，而只能 ，因此，DNA復(fù)制需要引物。DNA的合成方向總是 。在DNA的復(fù)制過程中，復(fù)制的前提是 。在體外可通過控制 來實(shí)現(xiàn)。在 的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個(gè)過程稱為 。PCR利用了DNA的 原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結(jié)合。由于PCR過程的溫度高，導(dǎo)致DNA聚合酶失活，后來 的DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，大大增加了PCR的效率。PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖

19、溶液中提供： ， ， ， ，同時(shí)通過控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行。2PCR的反應(yīng)過程PCR一般要經(jīng)歷 循環(huán)，每次循環(huán)可以分為 、 和 三步。從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由 延伸而成的DNA單鏈會(huì)與 結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸，這樣，DNA聚合酶只能 ，使這段固定長度的序列成指數(shù)擴(kuò)增。3實(shí)驗(yàn)操作在實(shí)驗(yàn)室中，做PCR通常使用 ，它是一種薄壁塑料管。具體操作時(shí)，用微量移液器，按PCR反應(yīng)體系的配方在 中依次加入各組分，再參照下表的設(shè)置設(shè)計(jì)好PCR儀的循環(huán)程序即可。4操作提示為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的 、 、 以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行 。PCR

20、所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在 儲(chǔ)存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。在微量離心管中添加反應(yīng)成分時(shí)，移液管上的槍頭要 。疑難點(diǎn)撥PCR是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，它能以極少量的DNA為模板，在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬份的DNA拷貝。這項(xiàng)技術(shù)有效地解決了因?yàn)闃悠分蠨NA含量太低而難以對(duì)樣品進(jìn)行分析研究的問題，被廣泛的應(yīng)用于遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆和DNA序列測定等各方面。2細(xì)胞內(nèi)參與DNA復(fù)制的各種組成成分及其作用解旋酶：打開DNA雙鏈 DNA母鏈：提供DNA復(fù)制的模板 4種脫氧核苷酸：合成子鏈的原料 DNA聚合酶：催化合成DNA子鏈 引物：使DNA

21、聚合酶能夠從引物的3，端開始連接脫氧核苷酸（引物是一小段DNA或RNA，它能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)。用于PCR的引物長度通常為2030個(gè)核苷酸）3DNA的合成方向DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，通常將DNA的羥基末端稱為3，端，而磷酸基團(tuán)的末端稱為5，端。DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從3，端延伸DNA鏈，因此，DNA復(fù)制需要引物。當(dāng)引物與DNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3，端開始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5，端向3，端延伸。4PCR的反應(yīng)過程PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為變性（當(dāng)溫度上升到90oC以上時(shí)，雙鏈DNA

22、解聚為單鏈）、復(fù)性（溫度下降到50oC左右，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合）和延伸（溫度上升到72oC左右，溶液中的四種脫氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈）三步。從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物延伸而成的DNA單鏈會(huì)與引物結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸，這樣，DNA聚合酶只能特異的復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列成指數(shù)擴(kuò)增。5PCR技術(shù)與DNA的復(fù)制PCR反應(yīng)是通過控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行。PCR反應(yīng)的實(shí)質(zhì)就是DNA復(fù)制，所以有關(guān)PCR反應(yīng)的題目與DNA復(fù)制的原理相同，計(jì)算方法也大體相同。

23、例如：PCR反應(yīng)中的目的片段一般以2n的方式積累，其中n為反應(yīng)循環(huán)次數(shù)。一個(gè)DNA片段在30次循環(huán)后反應(yīng)物中大約有10億個(gè)這樣的片段。（230）典例解析一個(gè)由15N標(biāo)記的DNA分子，放在沒有標(biāo)記的環(huán)境中培養(yǎng)，利用PCR循環(huán)5次后標(biāo)記的DNA分子總數(shù)的（ ）A 1/10 B 1/5 C 1/16 D1/25答案：C解析：一個(gè)DNA分子利用PCR技術(shù)循環(huán)5次后產(chǎn)生的DNA分子數(shù)目為2n。而DNA的復(fù)制是半保留復(fù)制，其特點(diǎn)是：新形成的DNA雙鏈，一條是來自親代DNA分子的母鏈，另一條是新形成的子鏈。這樣最初由15N標(biāo)記的DNA分子復(fù)制后，其標(biāo)記的兩條鏈就分別進(jìn)入兩個(gè)子代DNA分子中，這樣兩個(gè)子代DN

24、A分子被標(biāo)記了。以后均是在沒有標(biāo)記的環(huán)境中培養(yǎng)，不論經(jīng)過多少次復(fù)制，最初標(biāo)記的兩條鏈?zhǔn)冀K存在于兩個(gè)DNA分子中，這樣經(jīng)過n次循環(huán)后，標(biāo)記的DNA分子中2/2n,即1/2n-1?！菊n本問題答案和提示】練習(xí)1.提示：繪圖可參考教科書中圖5-9。PCR反應(yīng)中的目的片段一般以2n的方式積累，其中n為反應(yīng)循環(huán)次數(shù)。一個(gè)DNA片段在30次循環(huán)后反應(yīng)物中大約有10億個(gè)這樣的片段（2n=230=1 073 741 824)。2.提示：PCR引物是根據(jù)需要擴(kuò)增的目標(biāo)DNA的堿基序列來設(shè)計(jì)的。引物的設(shè)計(jì)需要豐富的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，感興趣的學(xué)生可以參考分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（見本專題參考書目），書中有詳盡的論述?！菊n堂

25、演練】一選擇題（10個(gè)）1DNA分子復(fù)制時(shí)，解旋的兩條鏈中（ C ）A僅一條作為復(fù)制模板 B兩條鏈作為模板并復(fù)制出兩個(gè)不同的DNA分子C兩條鏈作為模板并復(fù)制出兩個(gè)相同的DNA分子D兩條鏈作為模板，各自合成一條子鏈，然后兩條母鏈重新結(jié)合為原來的雙螺旋分子，兩條新鏈結(jié)合成一個(gè)全新的DNA分子2.下列關(guān)于DNA復(fù)制過程的正確順序是（ D ）互補(bǔ)堿基對(duì)之間氫鍵斷裂互補(bǔ)堿基對(duì)之間形成氫鍵DNA分子在解旋酶的作用下解旋以解旋后的母鏈為模板進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)子鏈與母鏈盤旋成雙螺旋狀結(jié)構(gòu)A B C D3.下列各項(xiàng)過程中，遵循“堿基互補(bǔ)配對(duì)原則”的有（ A ）DNA復(fù)制RNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄A B C D4.實(shí)

26、驗(yàn)室內(nèi)模擬生物體DNA的復(fù)制必需的一組條件是（ D ）酶游離的脫氧核苷酸ATPDNA分子mRNAtRNA適宜的溫度適宜的酸堿度A B C D5.利用PCR技術(shù)，把一個(gè)雙鏈DNA分子當(dāng)作第一代，經(jīng)過3次循環(huán)，在第四代DNA分子中，有幾條第一代脫氧核苷酸的長鏈？（ A ）A 2 B 4 C 8 D 16，6.關(guān)于DNA分子的敘述中，正確的是（ C ）A .DNA的兩條鏈?zhǔn)菢O性相同，同向平行 B.DNA的兩條鏈?zhǔn)菢O性相同，反向平行C.DNA的兩條鏈中極性不同，反向平行的 D.DNA的兩條鏈?zhǔn)菢O性不同，同向平行7.假設(shè)PCR反應(yīng)中，只有一個(gè)DNA的片段作為模板，請(qǐng)計(jì)算在30次循環(huán)后，反應(yīng)物中大約有多少

27、這樣的DNA片段（ B ）A 215 B 230 C 260 D 2318.DNA的合成方向總是（ C ）延伸。A從DNA分子的左端向右端 B從DNA分子的右端向左端C從子鏈的5，端向3，端 D從子鏈的3，端向5，端9.要使PCR反應(yīng)在體外的條件下順利地進(jìn)行，需要嚴(yán)格的控制（ C ）A 氧氣的濃度 B酸堿度 C溫度 D 大氣的濕度10.DNA分子經(jīng)PCR反應(yīng)循環(huán)一次后，新合成的那條子鏈的脫氧核苷酸的序列應(yīng)與（ ）A模板母鏈相同 B非模板母鏈相同 C兩條模板母鏈相同 D兩條模板母鏈都不相同二非選擇題（2個(gè)）1PCR技術(shù)是把某一DNA片段在實(shí)驗(yàn)條件下，合成許許多多相同片段的一種方法，利用這種技術(shù)能

28、快速而特異的擴(kuò)增任何要求的目的基因或者DNA分子片段，“人類基因組計(jì)劃”的研究中常用到這種技術(shù)。請(qǐng)結(jié)合有關(guān)知識(shí)，回答有關(guān)此技術(shù)的一些問題：PCR技術(shù)能把某一DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，依據(jù)的原理是： 在實(shí)驗(yàn)條件下，DNA分子進(jìn)行擴(kuò)增，除了所要擴(kuò)增的DNA片段處，還需要 、和 、 等條件。某DNA片段有160個(gè)堿基，其中有腺嘌呤35個(gè)，若讓該DNA分子擴(kuò)增三次（即復(fù)制三次）至少需要腺嘌呤脫氧核苷酸和鳥嘌呤脫氧核苷酸的數(shù)目分別是 和 個(gè)。答案：DNA分子具有雙螺旋結(jié)構(gòu)和DNA分子中堿基的互補(bǔ)配對(duì)四種脫氧核苷酸、能量、酶 245、3152將大腸桿菌置于含15N的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。這樣，后代大腸桿菌細(xì)胞中的DNA

29、雙鏈均被15N標(biāo)記。然后將被15N標(biāo)記的大腸桿菌作為親代轉(zhuǎn)到普通培養(yǎng)基中，繁殖兩代。親代、第一代、第二代大腸桿菌DNA的狀況如圖所示。第一代大腸桿菌DNA貯存的遺傳信息與親代大腸桿菌DNA貯存的遺傳信息完全相同的原因是 。如果將第二代大腸桿菌的DNA分子總量作為整體1，其中，帶有15N的第二代大腸桿菌DNA分子約占總量的 %。如果將第二代大腸桿菌的DNA含量作為整體1，其中含15N標(biāo)記的第二代大腸桿菌的DNA含量（脫氧核苷酸單鏈）約占總量的 %答案：它們均是以親代15N標(biāo)記的DNA雙鏈的每條鏈為模板，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成的50 25【參考資料】凝膠濃度要依據(jù)DNA分子的大小來確定。編碼雙歧

30、桿菌16srRNA的DNA片段大小約為1 500個(gè)核苷酸的長度，因此根據(jù)表4-1選用1（1 g/100 mL，下同）的凝膠濃度。表4-1瓊脂糖凝膠濃度與DNA分離范圍的關(guān)系瓊脂糖凝膠濃度(%)線型DNA分子的分離范圍(千堿基對(duì)，kb) 5601200.8100.570.960.230.12核酸電泳緩沖液有三種，分別是Tris硼酸(TBE)、Tris乙酸(TAE)和Tris磷酸(TPE)。在上述三種緩沖液中：TBE與TPE緩沖液容量高，對(duì)DNA的分離效果好，但TPE液中含磷酸鹽的濃度偏高，容易使DNA沉淀。TAE液的緩沖容量低，價(jià)格較便宜。本實(shí)驗(yàn)選用的是TBE緩沖液。緩沖液中的EDTA可螯合正價(jià)

31、陽離子，從而抑制DNA酶的活性，防止PCR產(chǎn)物被降解。10倍濃縮的TBE緩沖液配方如下。Tris108 gEDTA9.3 g硼酸55 g將上述物質(zhì)溶解后，用蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH為8.08.2備用，使用時(shí)需稀釋10倍。核酸電泳常用的指示劑是溴酚藍(lán)，溴酚藍(lán)在堿性條件下呈藍(lán)紫色。指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液。載樣緩沖液的作用是：能夠增加樣品密度，確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)；能夠在電泳中形成肉眼可見的藍(lán)紫色指示帶，從而幫助預(yù)測核酸電泳的速度和位置；能夠使樣品呈現(xiàn)藍(lán)紫色，使加樣操作更方便。核酸電泳后，需要染色才能在紫外線下觀察到帶型。最常用的染色方法是溴化乙錠染色

32、法。溴化乙錠(EB)是一種熒光染料，有劇毒，因此操作時(shí)要非常小心。EB可嵌入DNA雙鏈的堿基對(duì)之間，在紫外線激發(fā)下，能發(fā)出紅色熒光。染色的方法有兩種。一種是在凝膠電泳液中加入EB，使其終濃度為0.5 g/mL；一種是在電泳后，將凝膠浸入0.5 g/mL的EB溶液中，染色1015 min。當(dāng)凝膠染色過深時(shí)，可以將凝膠放入蒸餾水中浸泡30 min后再觀察。PCR實(shí)驗(yàn)很容易出現(xiàn)假陽性或假陰性的結(jié)果。出現(xiàn)假陰性結(jié)果的常見原因有：Taq DNA聚合酶活力不夠或其活性受到抑制；引物設(shè)計(jì)不合理；提取的模板質(zhì)量或數(shù)量不過關(guān)以及PCR系統(tǒng)的建立欠妥當(dāng)；循環(huán)次數(shù)不夠；等等。當(dāng)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)假陰性的情況時(shí)，應(yīng)首先在原來

33、擴(kuò)增的產(chǎn)物中再加入Taq DNA聚合酶，并增加510次循環(huán)。為了防止假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，在選用Taq DNA聚合酶時(shí)，要注意用活力高、質(zhì)量好的酶。同時(shí)，在提取DNA模板時(shí)，應(yīng)特別注意避免提取物中含有抑制酶活性的污染物，如酚、氯仿等的存在。盡管Taq DNA聚合酶對(duì)模板純度的要求不高，但也不允許有機(jī)試劑的污染。PCR擴(kuò)增的先決條件以及特異性的高低，很大程度上取決于引物與靶DNA的互補(bǔ)情況，尤其需要保證引物的3 端與靶基因互補(bǔ)。PCR技術(shù)高度靈敏，極其微量的靶基因污染都會(huì)造成非目標(biāo)DNA片段的大量擴(kuò)增，因此模板DNA的污染是PCR假陽性結(jié)果的主要原因。此外，樣品中存在靶基因的同源序列也可能造成假陽性

34、結(jié)果。為了避免因污染而造成的假陽性結(jié)果，PCR操作時(shí)要注意做到：隔離操作區(qū)，分裝試劑，簡化操作程序，使用一次性吸頭等【教學(xué)反思】課題3 血紅蛋白的提取和分離【課題目標(biāo)】本課題通過嘗試對(duì)血液中血紅蛋白的提取和分離，使學(xué)生能夠體驗(yàn)從復(fù)雜體系中提取生物大分子的基本過程和方法，并了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理，為今后學(xué)習(xí)運(yùn)用這些技術(shù)打下基礎(chǔ)。【課題重點(diǎn)與難點(diǎn)】課題重點(diǎn)：凝膠色譜法的原理和方法。課題難點(diǎn)：樣品的預(yù)處理；色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填?！緦?dǎo)學(xué)誘思】1凝膠色譜法凝膠色譜法也稱做 ，是根據(jù) 分離蛋白質(zhì)的有效方法。凝膠實(shí)際上是一些由 構(gòu)成的多孔球體，在小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道，相

35、對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子通過凝膠時(shí)速度不同，相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì) 進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程 ，移動(dòng)速度 ；而相對(duì)分子質(zhì)量 的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在 移動(dòng)，路程 ，移動(dòng)速度 。相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。2緩沖溶液緩沖溶液的作用是 。緩沖溶液通常由 溶解于水中配制而成的。生物體內(nèi)進(jìn)行的各種生物化學(xué)反應(yīng)都是在一定的pH下進(jìn)行的，例如：血漿的pH是 ，要在實(shí)驗(yàn)條件下準(zhǔn)確模擬生物體內(nèi)的過程，必須保持體外的pH與體內(nèi)的基本一致。3電泳電泳是指 。許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上 。在電場的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與

36、其所帶電荷 的電極移動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各分子 以及分子本身的 、 的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的 ，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。兩種常用的電泳方法是 和 ，在測定蛋白質(zhì)分子量時(shí)通常使用 。蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于 以及 等因素。4蛋白質(zhì)的提取和分離蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步： 、 、 和 。5樣品處理血液由 和 組成，其中紅細(xì)胞最多。紅細(xì)胞具有 的特點(diǎn)。紅細(xì)胞中有一種非常重要的蛋白質(zhì) ，其作用是 ，血紅蛋白有 個(gè)肽鏈組成，包括 ，其中每條肽鏈環(huán)繞一個(gè) ，磁基團(tuán)可攜帶 。血紅蛋白因含有 呈現(xiàn)紅色。紅細(xì)胞的洗滌 洗滌紅細(xì)胞的目的是 ，采集的血樣要及時(shí)采用 分離紅細(xì)胞，然后

37、用膠頭吸管吸出上層透明的 ，將下層暗紅色的 倒入燒杯，再加入 ，緩慢攪拌 ，低速短時(shí)間離心，如此重復(fù)洗滌三次，直至 ，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。血紅蛋白的釋放 在 和 作用下，紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。分離血紅蛋白溶液 將攪拌好的混合溶液離心后，試管中的溶液分為4層。第一層為無色透明的 ，第2層為白色薄層固體，是 ，第3層是紅色透明液體，這是 ，第4層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過濾，除去之溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。透析 取1mL的血紅蛋白溶液裝入 中，將透析袋放入盛有300mL的物質(zhì)的量的濃度為20mmol/L的 中，透析12h。透析可以去除樣

38、品中 的雜質(zhì)，或用于更換樣品的 。6凝膠色譜操作第一步要制作 ，第二步要 ，因?yàn)?，所以裝柱前需要根據(jù)色譜柱的內(nèi)體積計(jì)算所需要的凝膠量。在裝填凝膠柱時(shí)，不得有 存在。因?yàn)闅馀輹?huì) ，降低分離效果。第三步是 ?！疽呻y點(diǎn)撥】1凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理凝膠色譜法也稱為分配色譜法，它是根據(jù)分子量的大小分離蛋白質(zhì)的方法之一。所用的凝膠實(shí)際上是一些微小的多孔球體，這些小球體大多數(shù)是由多糖類化合物構(gòu)成，小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道，當(dāng)一個(gè)含有各種分子的樣品溶液緩慢流經(jīng)時(shí)，各分子在色譜柱內(nèi)進(jìn)行兩種不同的運(yùn)動(dòng)，即垂直向下的運(yùn)動(dòng)和無規(guī)則的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，只能分布在顆粒之間

39、，通過的路程較短，移動(dòng)速度較快；相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較容易進(jìn)入凝膠內(nèi)的通道，通過的路程較長，移動(dòng)速度較慢。因此，樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出，相對(duì)分子質(zhì)量中等的分子后流出，相對(duì)分子質(zhì)量最小的分子最后流出，這種現(xiàn)象又叫分子篩現(xiàn)象。此外，凝膠本身具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，相對(duì)分子質(zhì)量大的分子通過這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上的空襲時(shí)阻力大，而相對(duì)分子質(zhì)量小的分子通過時(shí)阻力小，因此不同分子量的蛋白質(zhì)分子可以獲得分離。2與其他真核細(xì)胞相比，紅細(xì)胞的特點(diǎn)及這一特點(diǎn)對(duì)進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離的意義哺乳動(dòng)物及人的成熟的紅細(xì)胞是雙面凹圓餅狀，沒有細(xì)胞核和細(xì)胞器。其含有的血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過觀察顏

40、色來判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實(shí)驗(yàn)操作。3電泳的作用及其原理電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。許多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可解離基團(tuán)，它們?cè)谀硞€(gè)特定的pH下會(huì)帶上正電或負(fù)電；在電場的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極方向移動(dòng)。電泳技術(shù)就是在電場的作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而達(dá)到對(duì)樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的目的?！镜淅馕觥坑媚z色譜法分離蛋白質(zhì)時(shí)，分子量大的蛋白質(zhì)（ D ）A路程較長，移動(dòng)速度較慢 B路程較長

41、，移動(dòng)速度較快C路程較短，移動(dòng)速度較慢 D路程較短，移動(dòng)速度較快解析：在小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道，當(dāng)相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長，移動(dòng)速度較慢；而相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快?！菊n本問題答案和提示】（一）旁欄思考題你能從凝膠色譜的分離原理分析為什么凝膠的裝填要緊密、均勻嗎？答：凝膠實(shí)際上是一些微小的多孔球體，小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道。相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，只能分布在顆粒之間，通過的路程較短，移動(dòng)速度較快；相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較容

42、易進(jìn)入凝膠內(nèi)的通道，通過的路程較長，移動(dòng)速度較慢。因此，樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出，相對(duì)分子質(zhì)量中等的分子后流出，相對(duì)分子質(zhì)量最小的分子最后流出，從而使各種相對(duì)分子質(zhì)量不同的分子得以分離。如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻，就會(huì)在色譜柱內(nèi)形成無效的空隙，使本該進(jìn)入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過，攪亂洗脫液的流動(dòng)次序，影響分離的效果。（二）練習(xí)1答：凝膠色譜法也稱為分配色譜法，它是根據(jù)分子量的大小分離蛋白質(zhì)的方法之一。所用的凝膠實(shí)際上是一些微小的多孔球體，這些小球體大多數(shù)是由多糖類化合物構(gòu)成，小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道，當(dāng)一個(gè)含有各種分子的樣品溶液緩慢流經(jīng)時(shí)，各分子在色譜柱內(nèi)進(jìn)行兩種不同

43、的運(yùn)動(dòng)，即垂直向下的運(yùn)動(dòng)和無規(guī)則的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)。相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，只能分布在顆粒之間，通過的路程較短，移動(dòng)速度較快；相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較容易進(jìn)入凝膠內(nèi)的通道，通過的路程較長，移動(dòng)速度較慢。因此，樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出，相對(duì)分子質(zhì)量中等的分子后流出，相對(duì)分子質(zhì)量最小的分子最后流出，這種現(xiàn)象又叫分子篩現(xiàn)象。此外，凝膠本身具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，相對(duì)分子質(zhì)量大的分子通過這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上的空隙時(shí)阻力大，而相對(duì)分子質(zhì)量小的分子通過時(shí)阻力小，因此不同分子量的蛋白質(zhì)分子可以獲得分離。2答：在一定范圍內(nèi)，能對(duì)抗外來少量強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或稍加稀釋不引起溶液pH發(fā)生明顯變化

44、的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。緩沖溶液通常是由一或兩種化合物（緩沖劑）溶解于水中制得，調(diào)節(jié)緩沖劑的配比就可制得不同pH范圍的緩沖液。緩沖溶液的作用是維持反應(yīng)體系的pH不變。在生物體內(nèi)進(jìn)行的各種生物化學(xué)過程都是在精確的pH下進(jìn)行的，受到氫離子濃度的嚴(yán)格調(diào)控。為了在實(shí)驗(yàn)室條件下準(zhǔn)確地模擬生物體內(nèi)的天然環(huán)境，就必須保持體外生物化學(xué)反應(yīng)過程有與體內(nèi)過程完全相同的pH。3答：電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。許多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可解離基團(tuán)，它們?cè)谀硞€(gè)特定的pH下會(huì)帶上正電或負(fù)電；在電場的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷

45、相反的電極方向移動(dòng)。電泳技術(shù)就是在電場的作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而達(dá)到對(duì)樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的目的。4答：血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品的處理；再經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離；然后通過凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化；最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。5答：血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過觀察顏色來判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫液。這使血

46、紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實(shí)驗(yàn)操作。課堂演練一 選擇題1凝膠色譜法是根據(jù)（ B ）分離蛋白質(zhì)的有效方法。A分子的大小 B相對(duì)分子質(zhì)量的大小 C帶電荷的多少 D溶解度2緩沖液的作用是：在一定范圍內(nèi)，抵制外界的影響來維持（ B ）基本不變。A溫度 B pH C滲透壓 D氧氣濃度3電泳是指帶電粒子在電場的作用下向著與其所帶電荷（ B ）的電極移動(dòng)。A相同 B相反 C相對(duì) D相向4.哺乳動(dòng)物和人的成熟的紅細(xì)胞中的（ A ）與氧氣的運(yùn)輸有關(guān)。A血紅蛋白 B肌紅蛋白 C肌動(dòng)蛋白 D肌球蛋白5血液由血漿和各種血細(xì)胞組成，其中（ C ）的含量最多。A白細(xì)胞 B血小板 C紅細(xì)胞 D淋巴細(xì)胞6為防止血液

47、凝固，在采血容器中要預(yù)先加入抗凝血?jiǎng)?D ）。7將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，離心后，可以明顯看到試管中的溶液分為4層，其中第3層是（ C ）A無色透明的甲苯層 B脂溶性物質(zhì)的沉淀層 C血紅蛋白的水溶液 D其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物二 非選擇題1電泳利用了待分離樣品中各種分子 以及 、 的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速率，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。答案：帶電性質(zhì)的差異；分子本身的大??；形狀的不同2你能描述血紅蛋白分離的完整過程嗎？答案：血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步。包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品的處

48、理；在經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離；然后通過凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化；最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。參考資料聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白純度1試劑的配制（1）丙烯酰胺和N, N-甲叉雙丙烯酰胺  用去離子水配制29%（29 g/100 mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N, N-甲叉雙丙烯酰胺的貯存液。由于丙烯酰胺和雙丙烯酰胺在貯存過程中會(huì)分別緩慢轉(zhuǎn)變?yōu)楸┧岷碗p丙烯酸，這一反應(yīng)是由光或堿催化的。因此在每次使用前，應(yīng)核實(shí)溶液的pH不超過7.0；并且應(yīng)將配制好的溶液置于棕色瓶中，室溫貯存，每隔幾個(gè)月須重新配制。（2）十二烷基硫酸鈉（SDS）  用去離子水配成10%的貯存液，于室溫保存。（3）用于制備分離膠和濃縮膠的Tris緩沖液  1.5 mol/L、pH8.8的Tris緩沖液（分離膠緩沖液）；1 mol/L、pH6.8的Tris緩沖液（濃縮膠緩沖液）。（4）TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二胺)  TEMED通過催化過硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺與雙丙烯酰胺的聚合。（5）過硫酸銨  用去離子水配制10%的過硫酸銨溶液。過硫酸銨提供驅(qū)動(dòng)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需