Toll樣受體4在乙型肝炎組織及細(xì)胞株 HepG2HepG2.2.15內(nèi)的表達(dá)特征

1、                 作者：郭云蔚， 尉秀清， 李永偉， 楊紹基【摘要】  【目的】 探討Toll樣受體4（TLR4）在乙型肝炎組織及細(xì)胞株HepG2/HepG2.2.15內(nèi)的表達(dá)特征?！痉椒ā?采用免疫組化染色法檢測(cè)慢性乙型病毒性肝炎(CHB)63例、慢性重型肝炎(CSH)11例及健康對(duì)照組10例肝組織TLR4的表達(dá)，綜合評(píng)分法判斷結(jié)果。常規(guī)培養(yǎng)肝癌細(xì)胞株HepG2及HepG2.2.15，采用直接免疫熒光流式細(xì)胞術(shù)(FCM

2、)檢測(cè)TLR4在細(xì)胞上表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度(MFI)及陽(yáng)性細(xì)胞率。【結(jié)果】 TLR4在慢性乙型病毒性肝炎及慢性重型肝炎患者肝組織上的表達(dá)明顯高于健康對(duì)照組（P 0.01），主要表達(dá)于肝細(xì)胞胞漿及部分胞膜，在慢性乙型病毒性肝炎中，TLR4的表達(dá)強(qiáng)度與肝組織炎癥活動(dòng)度分級(jí)(G) 呈顯著正相關(guān)(r=0.632，P0.001)。TLR4在肝癌細(xì)胞株HepG2.2.15上表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞率分別為18.24 ± 8.18、(17.79 ± 9.46)%，明顯高于HepG2的2.33 ± 0.41、(1.71 ± 0.77)%（P 0.001）。 【結(jié)論】

3、TLR4的表達(dá)與乙型病毒性肝炎肝組織的炎癥活動(dòng)密切相關(guān)，而乙型肝炎病毒可直接上調(diào)細(xì)胞TLR4的表達(dá)，故TLR4參與了乙型病毒性肝炎發(fā)病過(guò)程中的免疫反應(yīng)并極有可能與免疫損傷有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  TLR4； 乙型病毒性肝炎； 免疫組化； 流式細(xì)胞術(shù)   J SUN Yat-sen Univ(Med Sci), 2007, 28(3):284-287   目前認(rèn)為，乙型肝炎病毒侵入人體后，免疫介導(dǎo)的肝損傷是乙型病毒性肝炎發(fā)病的主要機(jī)制。Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR），是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的I型跨膜蛋白質(zhì)，已有10余個(gè)家族成員，

4、它可通過(guò)識(shí)別病原相關(guān)的分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，引發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的釋放，在天然免疫防御中起重要作用，并最終激活獲得性免疫系統(tǒng)1。部分研究顯示，TLR4等在某些病毒感染的疾病過(guò)程中有重要作用。本研究通過(guò)檢測(cè)乙型病毒性肝炎患者肝組織，肝癌細(xì)胞株HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞TLR4的表達(dá)，探討TLR4與乙型病毒性肝炎的相關(guān)性。    1   材料和方法   1.1   研究對(duì)象   標(biāo)本取自2003年

5、6月至2006年2月中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院部分住院病人共74例，男性69例，女性5例，平均年齡36（1652）歲，其中慢性乙型病毒性肝炎組(chronic viral hepatitis B,CHB)為肝穿刺標(biāo)本，共63例，慢性重型肝炎組（chronic severe hepatitis ,CSH，乙型）為肝移植病肝切除標(biāo)本，11例。另設(shè)健康對(duì)照組，標(biāo)本取自肝移植移植肝常規(guī)留取標(biāo)本，10例。均行常規(guī)石蠟包埋連續(xù)切片。診斷符合2005年慢性乙型肝炎防治指南及2000年病毒性肝炎防治方案3，4。   1.2   方法   1.2.1

6、0;  肝組織病理切片的TLR4表達(dá)檢測(cè)   采用Elivision二步法進(jìn)行免疫組化染色（Elivision二步法試劑盒購(gòu)自福州邁新公司），具體步驟參照試劑盒推薦步驟進(jìn)行，一抗為anti-TLR4 PcAb（兔源性，美國(guó)Santa Cruz公司），稀釋度為1 100，DAB顯色，用檸檬酸高溫高壓法進(jìn)行抗原修復(fù)，設(shè)立陰性對(duì)照，以PBS代替一抗。   1.2.2   診斷方法   所有病理切片均行HE、網(wǎng)狀纖維染色及HBsAg、HBeAg免疫組化染色（SABC法）以輔助慢性乙型肝炎肝組織炎癥活動(dòng)度的分級(jí)(G

7、)、纖維化程度的分期(S)的診斷，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2000年病毒性肝炎防治方案。   1.2.3   免疫組化結(jié)果的判斷   采用綜合評(píng)分法（由研究者及1名病理師分別閱片評(píng)分）。陽(yáng)性著色呈棕色細(xì)顆粒狀。凡細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核淺棕色為1分、棕色為2分、深棕色為3分、不著色為0分；在高倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比，陽(yáng)性細(xì)胞占所有細(xì)胞的比例：10%為0分，11%25%為1分，26%50%為2分，51%75%為3分，76%為4分。根據(jù)上述2項(xiàng)指標(biāo)的兩積分相乘分為4級(jí)：0分為陰性(-)、14分為弱陽(yáng)性(+)、58分為中等陽(yáng)性(+)、91

8、2分為強(qiáng)陽(yáng)性(+)。   1.2.4  細(xì)胞培養(yǎng)   肝癌細(xì)胞株HepG2及HepG2.2.15（中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院傳染科實(shí)驗(yàn)室保存）培養(yǎng)液為含10%滅活新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基（GIBCO公司），HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)液另加G418，細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)傳代，然后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞以104/mL接種于6孔板中，至細(xì)胞貼壁融合90%以上時(shí)每株各取4孔消化收集細(xì)胞，進(jìn)行TLR4表達(dá)檢測(cè)，以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。   1.2.5   培養(yǎng)細(xì)胞的TLR4表達(dá)檢測(cè)   采用直接免疫熒光流式細(xì)胞術(shù)。2種

9、細(xì)胞株各收集4管，DMEM懸浮細(xì)胞，15 × 106/mL。檢測(cè)前PBS洗滌細(xì)胞，分別加入PE-anti-TLR4抗體（美國(guó)Ebioscience公司）10 L和細(xì)胞100 L，設(shè)同型對(duì)照，以PE-mouse IgG 2a（美國(guó)Ebioscience公司）10 L代替PE-anti-TLR4抗體，震蕩充分混勻，按常規(guī)方法室溫、避光孵育20 min。以PBS常溫1000 g離心5 min洗滌 1次后，以PBS配成約106/mL液，用FCM及Cellquest軟件檢測(cè)并分析TLR4的平均熒光強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞率（采用BD FACS Calibur 流式細(xì)胞儀）。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。 

10、  1.3   統(tǒng)計(jì)學(xué)分析   使用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件，相關(guān)分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，各組間的多重比較采用列聯(lián)表分析，兩組間計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，取?琢=0.05。   2   結(jié)   果   2.1   TLR4在慢性乙型病毒性肝炎患者肝組織上的表達(dá)   TLR4在CHB肝組織上主要表達(dá)于肝細(xì)胞胞漿及部分胞膜上，細(xì)胞核及匯管區(qū)無(wú)表達(dá)，與健康對(duì)照組相比，TLR4的表達(dá)明顯增強(qiáng)（P 0.01，見(jiàn)圖1AC），免疫

11、組化染色強(qiáng)度與肝組織炎癥活動(dòng)度的分級(jí)(G)呈顯著正相關(guān)(r=0.632，P 0.001)，除G3組與G4組之間無(wú)顯著性差異外，余各G組之間均有顯著性差異，見(jiàn)表1。   2.2   TLR4在慢性重型肝炎肝組織上的表達(dá)   TLR4在CSH肝組織上主要呈小灶性表達(dá)，大片壞死區(qū)基本無(wú)表達(dá)，與健康對(duì)照組相比，TLR4的表達(dá)明顯增強(qiáng)（P 0.05，圖1D），但低于CHB組G2、G3、G4級(jí)的表達(dá)（P 0.05），與G1級(jí)的表達(dá)無(wú)顯著性差異。        

12、60;  2.3   TLR4在CHB肝組織上的表達(dá)與其他臨床指標(biāo)的關(guān)系   TLR4在CHB肝組織上的表達(dá)與其他臨床指標(biāo)，包括纖維化程度的分期(S)，肝組織HBsAg、HBeAg免疫組化染色強(qiáng)度、血HBV-DNA定量，AST、ALT、ALB、TBILI、PT等肝功能指標(biāo)均無(wú)顯著性關(guān)系（r=0.0330.273，均為P 0.05）。   TLR4在肝癌細(xì)胞株HepG2.2.15上表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度為18.24±8.18（n=12），明顯高于在肝癌細(xì)胞株HepG2上表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度2.33 ± 0.41（

13、n=12，t=6.729，P 0.001）；而TLR4+的陽(yáng)性細(xì)胞率，在HepG2.2.15上為（17.79 ± 9.46）%，亦明顯高于HepG2的陽(yáng)性細(xì)胞率（1.71 ± 0.77）% （t=5.870，P 0.001）。    3   討   論   目前所知，免疫介導(dǎo)的肝損傷是慢性乙型病毒性肝炎發(fā)病的主要機(jī)制，HBV感染后，細(xì)胞毒性T細(xì)胞（Tc）、輔助性T細(xì)胞（Th）、庫(kù)普弗細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等各種免疫細(xì)胞均被激活，釋放TNF（tumor necrosis factor ）、I

14、FN（interferon ）、IL-2（interleukin-2）、IL-6（interleukin-6）等細(xì)胞因子，從而對(duì)肝臟造成損傷，故研究免疫損傷的具體機(jī)制及尋找有效且副作用小的免疫治療方法一直是慢性乙型肝炎治療的熱點(diǎn)及難點(diǎn)。   TLR是連接天然免疫及獲得性免疫系統(tǒng)的重要橋梁1，其中TLR4是該家族中目前研究得較清楚的成員，它主要表達(dá)在巨嗜細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞上，它識(shí)別PAMPs或相關(guān)內(nèi)源性配體后，通過(guò)髓樣分化因子88依賴(lài)性信號(hào)傳導(dǎo)途徑（MyD88），可引起細(xì)胞因子如IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF及IFN等的合成與釋放，促使免

15、疫細(xì)胞成熟、分化和功能化，并在部分研究中提示TLR4能促進(jìn)機(jī)體對(duì)病毒的清除。   正常肝臟是人體各組織中表達(dá)TLR最低的器官之一，新近細(xì)胞研究顯示，某些炎癥或前炎性因子如細(xì)菌脂多肽、IL-la、TGF-可以上調(diào)肝細(xì)胞TLR表達(dá)。在與病毒性肝炎相關(guān)性的研究中，Machida等的研究發(fā)現(xiàn)，在感染HCV的Raji細(xì)胞系中，TLR4的表達(dá)有明顯的升高，而在感染HCV的患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中，TLR2及TLR4均有明顯的升高，并認(rèn)為HCV感染后B細(xì)胞分泌IL-6及TNF的能力明顯加強(qiáng)，這一功能是由TLR4介導(dǎo)的。Mozer-Lisewska等對(duì)感染HCV的兒童患者的研究中發(fā)現(xiàn)，病肝組

16、織上有TLR2及TLR4的表達(dá)，而正常肝組織則無(wú)，認(rèn)為T(mén)LR在兒童丙型病毒性肝炎免疫清除及損傷中起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，給轉(zhuǎn)基因小鼠注射TLR配體，可抑制HBV的復(fù)制。Duesberg等在對(duì)HCV疫苗的研究中，發(fā)現(xiàn)HCV的T細(xì)胞抗原決定表位與脂多肽結(jié)合，是有效的免疫刺激劑，而這一作用是由TLR2、TLR4介導(dǎo)的。至于TLR與乙型病毒性肝炎的關(guān)系如何，目前尚不清楚。   我們的研究顯示，TLR4在健康肝中基本不表達(dá)或僅有輕度表達(dá)，而在慢性乙型病毒性肝炎及慢性重型肝炎肝組織中，TLR4的表達(dá)明顯升高，主要表達(dá)于肝細(xì)胞胞漿及部分胞膜，與Mozer-Lisewska等關(guān)于兒童丙型病

17、毒性肝炎的研究基本一致。另外，在慢性乙型病毒性肝炎中，隨著肝組織炎癥活動(dòng)度分級(jí)(G)的升高，TLR4的表達(dá)有升高的趨勢(shì)。故我們認(rèn)為，TLR4作為可對(duì)微生物病原體直接做出防御反應(yīng)同時(shí)誘發(fā)繼發(fā)免疫反應(yīng)的受體之一，參與了慢性乙型病毒性肝炎發(fā)病過(guò)程的免疫反應(yīng)，并且這種參與較傾向于免疫介導(dǎo)的肝損傷。慢性重型肝炎肝組織TLR4的表達(dá)強(qiáng)度低于慢性乙型病毒性肝炎組G24級(jí)，與G1級(jí)相當(dāng)?shù)脑?，可能與重型肝炎存在較多的壞死區(qū)，導(dǎo)致有功能的肝細(xì)胞大量減少且活性降低，進(jìn)而合成TLR4分子的能力下降有關(guān)。為了進(jìn)一步了解乙型肝炎病毒本身與TLR4表達(dá)的關(guān)系，我們進(jìn)行了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。HepG2.2.15細(xì)胞株是由HepG2細(xì)

18、胞株轉(zhuǎn)染了乙型肝炎全病毒形成，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TLR4在HepG2.2.15細(xì)胞上表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞率均明顯高于HepG2，故可推測(cè)乙型肝炎病毒能直接上調(diào)細(xì)胞TLR4的表達(dá)。   由此可知，TLR4與乙型病毒性肝炎的關(guān)系密切并且可能在病毒性肝炎的免疫損傷中起較重要作用。但是，乙型肝炎病毒是通過(guò)何種途徑上調(diào)TLR4的表達(dá)，TLR4又是如何引起免疫細(xì)胞的聚集成熟，刺激細(xì)胞因子的釋放，具體機(jī)制均需進(jìn)一步研究，而調(diào)節(jié)或干擾TLR4信號(hào)途徑，是否有望成為較為有效的病毒性肝炎的免疫治療方法，有待進(jìn)一步證實(shí)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  MEDZHITOV R, PRESTON-HU

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