肝臟P450還原酶特異性敲除小鼠模型在毒理學中的應(yīng)用

1、肝臟P450還原酶特異性敲除小鼠模型在毒理學中的應(yīng)用 基金項目：國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃973項目（編號：2006CB504700）作者簡介：肖瑛（1981-），女，博士研究生，研究方向為藥物毒理學。*通訊作者：任進，Email: CDSER_SIMMmail. Tel & Fax：（021）50806600-2207Application of Liver-specific Cytochrome P450 Reductase knockout mice in Toxicology肖瑛，武元峰，薛翔，顧軍，任進*Xiao Ying, Wu Yuanfeng, Xue Xiang, Gu

2、 Jun, Ren Jin中國科學院上海藥物研究所，新藥研究國家重點實驗室,上海201203State Key Laboratory for New Drug Research，Shanghai Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Sciences, Shanghai, 201203關(guān)鍵詞: NADPH-細胞色素P450酶還原酶，基因敲除，器官毒性Key Word: NADPH-P450 Cytochrome Reductase, Knockout, Organ Toxicity微粒體細胞色素P450單加氧酶（P450，CYP）在內(nèi)源與

3、外源性化合物的生物轉(zhuǎn)化中起著重要的作用。P450酶蛋白種類的多樣性及其底物的重疊性使P450酶系可以催化多種類型的反應(yīng)，不僅對許多外來物質(zhì)如殺蟲劑及環(huán)境有毒物質(zhì)具有代謝作用，還參與一些起重要生理功能的內(nèi)源性物質(zhì)如激素、脂肪酸的代謝。P450酶的功能與生物學作用的重要性，使其研究具有廣闊的應(yīng)用前景。通過調(diào)控其表達和活性，可望改變生物體內(nèi)外源性化合物尤其是藥物的代謝，對于藥物的研究和開發(fā)也有重要的意義。由于P450酶系的生物學重要性，自其發(fā)現(xiàn)以來，該酶系的研究一直是藥理學和毒理學中一個十分引人注目的領(lǐng)域。P450酶基因的多態(tài)性使其有多種亞型且多具有類似的功能和相似的組織分布特征，使在一個特異組織中

4、很難去區(qū)別單個P450酶亞型的功能。目前已有多個P450酶亞型敲除（knockout，KO）小鼠模型，這些模型已被廣泛用來研究特異性P450酶亞型在外源性化合物的代謝和毒性中的作用1。然而這些KO模型都只能是針對同源性較小的P450酶亞型，對于同源性較大的亞型較難敲除；而且由于目前對于小鼠Cyp基因的調(diào)控、底物特異性以及小鼠Cyp基因的種屬差別等方面還沒有較全面的認知，所以對于很多P450酶亞型來說此種敲除方法是不可行的。Hildebrandt等提出NADPH-細胞色素P450還原酶（CPR/POR）是所有微粒體P450酶的氧化還原搭檔2，它提供P450酶氧化還原反應(yīng)所需的第一個電子。基于這個

5、原理，策略之一就是開發(fā)一個靶向敲除P450還原酶-Cpr基因的小鼠模型，其表達的缺失將抑制所有微粒體P450酶的活性。并且由于CPR在胚胎發(fā)育中具有重要功能，所以只能采用條件敲除（conditional knock）的手段來得到Cpr基因敲除小鼠模型。通過條件敲除方法已經(jīng)得到肝臟CPR特異性敲除小鼠模型3，肺臟CPR特異性敲除小鼠模型4，心臟CPR 特異性敲出小鼠模型5和全身低表達CPR的小鼠模型6，這些敲除小鼠模型在化合物的毒性機制研究中有著廣闊的應(yīng)用前景。英國和美國的兩個研究小組分別應(yīng)用（conditional knockout）條件敲除的手段（圖1）建立了肝臟CPR特異性敲除小鼠模型 3

6、, 7。該模型將限制性內(nèi)切酶酶切位點標記在Cpr基因兩側(cè)，并在肝臟中特異性表達可以識別該位點的Cre酶，從而使小鼠在發(fā)育過程中肝臟Cpr基因被逐漸敲除導致CPR蛋白表達的缺失，最終使得肝臟P450酶活性喪失。其主要特征為：圖1 肝臟CPR特異性敲除小鼠模型建立方法圖解2.1 繁殖能力以及一般特征肝臟CPR特異性敲除小鼠（Cpr-Null）小鼠交配繁殖的結(jié)果表明它們可繁育，產(chǎn)仔數(shù)平均為6仔/窩，無胎致死性。Null小鼠在被毛顏色、一般外觀及日?；顒佣急憩F(xiàn)正常。2.2 組織特異性Cpr基因敲除 肝臟CPR表達的缺失通過免疫印跡可見3周時在Null小鼠肝臟微粒體CPR蛋白表達減少為野生型小鼠（wil

7、d-type，WT）的約18%，2個月大時Null小鼠肝臟中已經(jīng)檢測不到CPR蛋白（圖2）。因此，2個月大時純合子中的CPR表達基本已經(jīng)缺失。另一方面，妊娠第14天時檢測鼠胚時，未觀察到CPR蛋白水平的改變。同時在2個月大時在此兩種小鼠的肺、腎、腦和鼻粘膜中微粒體中CPR蛋白表達水平無顯著差異，再次證實了Cre表達的組織特異性以及CPR缺失的特異性。圖2 CPR蛋白的表達2.3 CPR表達的降低對微粒體CYP和HO活性的影響蛋白活性檢測結(jié)果表明2個基因型間肝微粒體CPR的活性的差別與CPR蛋白水平的差別相一致，隨著肝臟CPR蛋白表達水平的下降，2個月大時Null小鼠肝臟CPR、P450酶以及血

8、紅素氧合酶（HO）的活性相對WT小鼠都已經(jīng)下降到幾乎檢測不到的水平（圖3）。這些數(shù)據(jù)同時也證實了CPR是微粒體CYP和HO主要的電子供體。圖3 2月齡Null小鼠肝臟中酶活性比較2.4 肝中降低的CPR表達對膽固醇平衡和肝形態(tài)的影響多種依賴CPR的酶都參與膽固醇的合成，Null小鼠中肝CPR活性的降低導致2個月時胞漿總膽固醇水平與野生型相比較下降80%，同時雌雄Null小鼠肝重/體重皆顯著上升。但是體重及其他器官如腎、肺、心臟和腦的重量沒有明顯改變。與WT小鼠肝臟相比，Null小鼠的肝臟體積增大，顏色較淡，鏡下病理檢查可見脂肪空泡變性（圖4）。 圖4 肝臟的大體觀察和病理檢查2.5 肝臟CPR

9、表達缺失對肝CYP、HO-1、HO-2和環(huán)氧化物水解酶的影響Null小鼠在3周和2個月大時，伴隨肝臟CPR表達的顯著下降，肝臟微粒體總CYP含量明顯增加為WT小鼠肝臟的2倍和3倍，而腎微粒體中CYP含量也沒有增加。免疫印跡顯示P450 1A、2E1、3A分別增加了1倍，2B增加了3倍，2A蛋白水平增加了5倍。HO-1的水平也增加了約9倍，HO-2和環(huán)氧化物水解酶卻沒有受到影響。3. 肝臟CPR特異性敲除小鼠的應(yīng)用多個研究小組應(yīng)用該小鼠模型對多種化合物進行了研究，結(jié)果表明該模型對眾多外源性化合物的毒性機制研究很有價值。3.1肝臟Cpr基因敲除對醋氨酚（acetaminophen）器官特異性毒性的

10、影響 8過量醋氨酚可引起肝臟和許多肝外器官的損傷，已有研究表明P450酶在醋氨酚的代謝活化中起著重要的作用，但是肝外器官的毒性是否和醋氨酚在肝臟中的生物轉(zhuǎn)化相關(guān)卻不清楚。應(yīng)用肝臟CPR特異性敲除小鼠模型進行研究，發(fā)現(xiàn)Null小鼠比WT小鼠對醋氨酚的肝臟毒性更加耐受，而且在相同的血藥濃度下，Null小鼠中醋氨酚的肺臟、腎臟毒性相對WT中有所減輕，然而在鼻粘膜中毒性反而增大。該研究表明鼻粘膜中醋氨酚的毒性與其在肝臟中的轉(zhuǎn)化無關(guān)，而其它臟器如肺和腎臟中的毒性卻與肝臟中產(chǎn)生的醋氨酚的代謝產(chǎn)物有關(guān)系。3.2肝臟P450酶在環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide）的毒代動力學以及毒性中的作用 9環(huán)磷酰

11、胺是一個抗癌的前體藥物，它的藥效的發(fā)揮需要依靠P450酶的活化。雖然在臨床已經(jīng)用于抗癌有50年之久，但是關(guān)于其毒性與藥效的關(guān)系卻依然研究很少。應(yīng)用肝臟CPR特異性敲除小鼠模型來研究肝臟P450酶的代謝在環(huán)磷酰胺的毒代動力學中的作用，發(fā)現(xiàn)Null小鼠中環(huán)磷酰胺的清除速率以及體外肝臟微粒體代謝速率比WT小鼠中下降了6倍多。環(huán)磷酰胺的主要代謝產(chǎn)物在Null小鼠中雖有生成，但是半衰期延長近2倍，Cmax下降也近2倍。研究表明肝臟的代謝是環(huán)磷酰胺吸收和分布中的主要路徑，而且P450酶介導的氧化反應(yīng)是環(huán)磷酰胺清除過程中的一個重要步驟。 肝臟Cpr基因敲除對氯仿（chloroform）所致腎毒性的影響10氯

12、仿是一種常用的化學試劑，可引起肝臟和腎臟的損傷。已有體外實驗表明氯仿可被腎臟P450酶代謝為具有腎毒性的中間產(chǎn)物，但是腎臟P450酶在氯仿所引起的腎毒性中所起的作用并沒有直接的體內(nèi)證據(jù)。應(yīng)用肝臟CPR特異性敲除小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，給予氯仿后，Null小鼠的腎毒性比WT小鼠更嚴重。同時，組織分布結(jié)果表明，Null小鼠組織中的氯仿含量要高于WT小鼠。該研究表明肝臟P450酶的缺失并不能使氯仿引起的腎毒性減輕，進一步提示腎臟P450酶在氯仿引起的腎毒性中發(fā)揮著重要的作用。3.4肝臟P450酶在馬兜鈴酸（aristolochic acid）腎病中的作用11馬兜鈴酸腎病（aristolochic acid

13、 nephropathy, AAN）一直受到眾多學者的廣泛關(guān)注，但是關(guān)于馬兜鈴酸的代謝和其引起的腎毒性之間的關(guān)系卻不是很清楚。我們應(yīng)用肝臟CPR特異性敲除小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，給予馬兜鈴酸I后，Null小鼠的腎臟損傷比WT小鼠更嚴重，而WT小鼠預(yù)給藥CYP1A的誘導劑3-MC后，馬兜鈴酸I引起的腎毒性減輕，存活率提高。Null小鼠中馬兜鈴酸I的清除率低于WT小鼠和3-MC預(yù)給藥的小鼠。組織分布結(jié)果表明，Null小鼠肝臟和腎臟中馬兜鈴酸I的分布高于WT小鼠，WT小鼠又高于3-MC預(yù)給藥的小鼠。同時，細胞水平研究表明，馬兜鈴酸I對人腎小管上皮細胞的毒性高于它的主要代謝產(chǎn)物馬兜鈴內(nèi)酰胺I，而且在有S9活

14、化系統(tǒng)存在的情況下馬兜鈴酸I引起的細胞毒性降低。該研究表明肝臟P450酶可以將馬兜鈴酸代謝為毒性較低的代謝產(chǎn)物，因此在馬兜鈴酸I引起的腎毒性中具有解毒作用。此外，肝臟CPR特異性敲除小鼠還用來研究P450和過氧化物酶在環(huán)境致癌物苯并芘和3-硝基苯并蒽醌的生物活化中的作用12, 13以及作為一種體內(nèi)篩選模型對多種化合物進行了研究14，同時此模型還可以用于脂類代謝的研究等15, 16。肝臟CPR特異性敲除小鼠模型可以用來系統(tǒng)地從整體動物的水平來研究肝臟P450酶以及CPR相關(guān)的酶在內(nèi)外源性化合物的生物轉(zhuǎn)化中的作用。該小鼠模型在肝外毒性化合物如腎毒性化合物、肺毒性化合物等的毒性機理研究中有著重要的應(yīng)

15、用前景，可用來研究靶器官內(nèi)的毒性是否和肝臟中的生物轉(zhuǎn)化相關(guān)，以及肝臟中生物轉(zhuǎn)化與靶器官內(nèi)生物轉(zhuǎn)化分別在該化合物毒性中的作用，同時亦可對比研究原型化合物與代謝產(chǎn)物的毒性機制。在外源性化合物的代謝研究中，該小鼠模型尤其有著廣闊的應(yīng)用前景。肝臟是體內(nèi)最重要的參與外源性化合物代謝的器官，其中P450酶是最主要的參與代謝轉(zhuǎn)化的生物酶，該小鼠模型可以用來研究化合物是否經(jīng)過肝臟P450酶代謝及代謝途徑是否唯一。除了微利體P450酶以外，線粒體中也有著豐富的P450酶，該小鼠模型也可以用來研究肝臟線粒體P450酶在內(nèi)外源性化合物生物轉(zhuǎn)化中的可能作用。另外，肝臟中還存在著豐富的胞漿酶（cytosolic enz

16、ymes），如黃素單加氧酶等，這些酶與P450酶在內(nèi)外源性化合物毒性作用中的功能也可以通過該小鼠模型進行相應(yīng)的研究。參考文獻1.Muruganandan S, Sinal CJ. Mice as clinically relevant models for the study of cytochrome P450-dependent metabolism. J Clin Pharmacol Ther 2008;83(6):818-28.2.Okada H, Watanabe Y, Inoue T, et al. Transgene-derived hepatocyte growth facto

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