轉(zhuǎn)染雙啟動子桿狀病毒表達載體在昆蟲細胞共表達人白細胞介素12

1、轉(zhuǎn)染雙啟動子桿狀病毒表達載體在昆蟲細胞共表達人白細胞介素12【 摘要 】目的通過體外表達rhIL-12，以供研究其在體內(nèi)外的生物學效應(yīng)。 方法外周血單個核細胞(PBMC)、粘附細胞和人口腔表皮樣癌細胞KB分別經(jīng)SAC(含A蛋白的金黃色葡萄球菌Cowan菌株)、IFN-LPS和PDBu(12，13-二丁酸佛波酯)刺激，以GIT(異硫氰酸胍)一步法提取細胞總RNA，經(jīng)RT-PCR技術(shù)獲取IL-12 P40和P35 cDNA，將兩條基因分別插入雙啟動子桿狀病毒轉(zhuǎn)染載體pAcUW51的多角子啟動子和P10啟動子下游，構(gòu)建真核表達載體pAcUW51/IL-12，與AcNPV共轉(zhuǎn)染昆蟲細胞Sf9，獲取表達

2、IL-12的細胞株，表達產(chǎn)物分別經(jīng)SDS-PAGE，Western blot，ELISA和生物學活性鑒定。 結(jié)果rhIL-12產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量(Mr)經(jīng)SDS-PAGE和Western blot鑒定為671036細胞。MTT法檢測IL-12表達產(chǎn)物促進NK細胞殺傷K562細胞的能力比對照可提高60%，刺激PHA激活的PBMC增殖的能力最高可達到58%。 結(jié)論成功構(gòu)建了雙啟動子桿狀病毒表達載體pAcUW51/IL-12，獲得了共表達IL-12 P40和P35亞單位的昆蟲細胞株?！?主題詞 】白細胞介素12； 表達； 桿狀病毒轉(zhuǎn)染載體 Coexpression of human IL-12 in

3、 insect cells transfected by double promoter baculovirus expression vectorWEI Haiming, TIAN Zhigang, FENG Jinbo, et al.(Shandong Cancer Biotherapy Center, Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 250062, P. R. China)【 Abstract 】ObjectiveInterleukin 12 (IL-12) is a heterodimeric cytokine composed

4、of two covalently linked chains, P40 and P35. It is necessary to express recombinant human IL-12 for studying the biological effects of this cytokine in vivo and in vitro. MethodsPeripheral blood mononuclear cells (PBMC), adherent cells and KB cell line were treated with Staphylococcus aureus Cowan

5、strain (SAC), IFN-+LPS and PDBu, respectively. Total RNA was extracted from these cells by the guanidine isothiocyanate method. cDNA for both P40 and P35 subunits of IL-12 were cloned by RT-PCR. Double promoter eukaryotic expression vectors, pAcUW51/IL-12 containing IL-12 P35 and P40 cDNA, were cons

6、tructed. The vectors were used to co-transfect the insect cells (Sf9) with linearized polyhedrosis virus genomic DNA. The cell clones expressed the rhIL-12 products were analyzed by SDS-PAGE, Western blot, ELISA and biological assays. Results6 cells. The biological activities identified by two biolo

7、gical assays showed that the expressed products increased the proliferation of human PHA-activated PBMC and also the human NK cell-mediated cytotoxicity. ConclusionDouble promoter baculovirus expression vector pAcUW51/IL-12 was successfully constructed and both P40 and P35 subunits of IL-12 were cor

8、rectly coexpressed in insect cells.【 Subject words 】Interleukin 12; Expression; Baculovirus expression vector 白細胞介素12(IL-12)主要是由抗原提呈細胞產(chǎn)生的一種異二聚體(P40和P35)細胞因子，能顯著增強NK/LAK細胞的殺傷活性，促進特異性CTL細胞的應(yīng)答能力，誘導T細胞和NK細胞大量分泌IFN-，啟動TH0細胞向TH1細胞的發(fā)育，在抗腫瘤、艾滋病等多種疾病中將發(fā)揮重要作用1。我們用SAC、LPS、IFN-和PDBu等刺激劑作用于外周血單個核細胞或口腔表皮樣癌細胞株KB，成

9、功擴增出IL-12 P40和P35 cDNA，并插入雙啟子桿狀病毒表達載體pAcUW51,轉(zhuǎn)染昆蟲細胞Sf9，獲得高表達IL-12的細胞株，現(xiàn)將有關(guān)結(jié)果報告如下。材料和方法細胞株、菌株與載體：人口腔表皮樣癌細胞株KB購自中科院上海細胞所，K562、Raji和Sf9細胞為本室保存。E.coli DH5和含A蛋白金黃色葡萄球菌為本室保存菌株，雙啟動子桿狀病毒轉(zhuǎn)染載體pAcUW51購自PharMingen，含多角體啟動子和P10啟動子，可同時表達兩條多肽鏈。引物設(shè)計與合成：根據(jù)文獻2設(shè)計6條引物P1P6，序列及擴增片段見表1，P1/P2引入BamH酶切位點，P4/P5引入Bcl酶切位點，由美國Ver

10、ginia大學醫(yī)學院高斌博士提供。表1IL-12引物序列Table 1. PCR primers of human IL-12PrimerSequencebpP1GC GGATCC ATG TGT CAC CAG CAGP2AT GGATCC CTA ACT GCA GGG CACP1P2 for IL-12 P40(1003bp)P3GGA TCC AGT GCC TGC CCA GCTP3P2 for IL-12 P40(417bp)P4AT TGATCA ATG TGT CCA GCG CGC AGCP5GC TGATCA TTA GGA AGC ATT CAG ATAP4P5 for

11、IL-12 P35(676bp)P6GAA TTC GAC ACC TCT TTC ATAP6P5 for IL-12 P35(351bp) 主要試劑：限制性內(nèi)切酶Bgl、Bcl、BamHI、EcoR、牛小腸堿性磷酸酶(CIAP)、T4 DNA連接酶、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶等購自GIBCO公司，IFN-、LPS、PDBu(Phorbol-12，13-dibutyrate)等購自Sigma公司，TMF-FH昆蟲細胞培養(yǎng)基購自PharMingen公司，IL-12 ELISA試劑盒購自R&D公司。SAC的制備：含A蛋白金黃色葡萄球菌在LB斜面培養(yǎng)基上長成菌苔后，生理鹽水洗出，甲醛固定，無菌生理鹽水洗滌后，

12、80 1 h殺菌，沉淀用RPMI 1640配成2%濃度，應(yīng)用終濃度為0.02%。末梢血單個核細胞的分離與刺激：血站抗凝血經(jīng)淋巴細胞分離液分離出單個核細胞(PBMC)，后者在塑料板中37 1 h后，分離懸浮細胞(PBL)和粘附細胞2種，調(diào)細胞濃度1106/ml。用SAC刺激時終濃度為0.02%，37作用24 h，用IFN-LPS刺激時，先用1 000U/ml IFN-預(yù)處理16 h，再加LPS 5ng/ml刺激4 h。KB，Raji，K562細胞培養(yǎng)與刺激：3種細胞常規(guī)RPMI 1640培養(yǎng)后，調(diào)細胞濃度1106/ml。加終濃度為100nmol/L的PDBu，37作用24 h?？俁NA提取和RT

13、-PCR反應(yīng)：收集上述細胞經(jīng)GIT一步法提取總RNA，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，以其為模板分別擴增P40和P35長鏈及短鏈，PCR反應(yīng)體積為100l，P40長鏈(1 003bp)擴增參數(shù)為94 1 min、60 1 min、72 2 min，循環(huán)30次，其它片段為94 1 min、58 1 min、72 1 min，循環(huán)35次，末次延長72 7 min。P40和P35 cDNA序列測定：由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司完成。IL-12桿狀病毒表達載體的構(gòu)建：P40(1 003bp)cDNA和pAcUW51經(jīng)BamH酶切、低溶點瓊脂糖回收相應(yīng)片段，T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化DH5菌，提取質(zhì)粒經(jīng)P

14、CR和EcoR酶切鑒定，獲得的重組質(zhì)粒命名為pAcUW51/P40。再插入P35 cDNA，分別用Bgl酶切pAcUW51/P40，Bcl酶切P35 cDNA，回收相應(yīng)片段，T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化DH5菌，提取質(zhì)粒經(jīng)PCR和EcoR酶切鑒定(1)。1pAcUW 51/IL-12重組載體的構(gòu)建Fig 1. Map of recombinant hIL-12 plasmid constructionpAcUW51/IL-12共轉(zhuǎn)染Sf9細胞：按PharMingen公司使用說明書進行，并以空斑法篩選陽性細胞株。IL-12表達產(chǎn)物的鑒定：篩選的陽性細胞株經(jīng)RT-PCR鑒定基因表達，SDS-PAG

15、E和Western blot鑒定蛋白產(chǎn)物，ELISA測定IL-12蛋白含量。MTT法檢測IL-12表達產(chǎn)物促進PBMC體外增殖能力：PBMC經(jīng)PHA作用48 h后，分離淋巴母細胞，調(diào)節(jié)細胞濃度為106/ml，加入不同稀釋度的IL-12表達產(chǎn)物再作用48 h，MTT法檢測增殖活性。MTT法檢測IL-12表達產(chǎn)物促進NK細胞殺傷活性：外周血單個核細胞經(jīng)不同稀釋度IL-12表達產(chǎn)物作用18 h后，以MTT法檢測其殺傷K562細胞的活性。 結(jié)果1.IL-12 P40 cDNA的擴增：PBMC和粘附細胞經(jīng)SAC或IFN-LPS刺激后能擴增出P40短片段(417bp)，未擴增出長片段(1 003bp)，P

16、BC經(jīng)上述作用后長、短片段均未擴增出，KB細胞經(jīng)PDBu作用后擴增出P40長片段和短片段，Raji和K562未擴增出任何片段(2)，其中1 003bp cDNA經(jīng)測序與文獻報道序列一致。2.IL-12 P35 cDNA的擴增：PBMC和粘附細胞經(jīng)SAC或IFN-LPS刺激后能擴增出P35短片段(351bp)，粘附細胞尚擴增出P35長片段(676bp)，PBL經(jīng)上述刺激后未擴增出P35片段，KB細胞經(jīng)PDBu刺激后擴增出P35長片段及短片段，Raji和K562細胞未擴增出任何片段(3)，其中676bp cDNA經(jīng)測序與文獻報道結(jié)果一致。2RT-PCR擴增hIL-12 P40 cDNA的凝膠電泳F

17、ig 2. Gel electrophoresis of RT-PCR products of hIL-12 P40 cDNALine 1: 100bp marker; Line 2: PBMC+SAC; Line 3: PBL+SAC; Line 4: adherent cells+SAC; Line 5: PBMC+IFN-+LPS; Line 6: Raji+PDBu; Line 7: KB+PDBu3RT-PCR擴增hIL-12 P35 cDNA的凝膠電泳Fig 3. Gel electrophoresis of RT-PCR products of hIL-12 P35 cDNALi

18、ne 1: 100bp marker; Line 2: PBMC+SAC; Line 3: PBL+SAC; Line 4: adherent cells+SAC; Line 5: PBMC+IFN-+LPS; Line 6: Raji+PDBu; Line 7: KB+PDBu; Line 8: adherent cells+IFN-+LPS; Line 9: Raji+PDBu; Line 10: K562+PDBu 3.pAcUW51/P40的鑒定：pAcUW51/P40經(jīng)PCR反應(yīng)能擴增出1 003bp片段，經(jīng)BamH酶切亦獲得1 003bp片段，經(jīng)EcoR酶切，正向連接出現(xiàn)5 643

19、bp和1 100bp 2條帶，反向連接出現(xiàn)6 083bp和585bp 2條帶。4.pAcUW51/IL-12的鑒定：在pAcUW51/P40的基礎(chǔ)上，插入P35片段，經(jīng)PCR反應(yīng)獲得676bp片段，經(jīng)EcoR鑒定，正向連接出現(xiàn)5 000bp+1 786bp+60bp(電泳時不易出現(xiàn))，反向連接為5 000bp+1 200bp+676bp 3條帶。5.IL-12表達產(chǎn)物的鑒定：經(jīng)空斑法篩選出表達IL-12的陽性細胞株，PCR擴增確定有P40和P35基因表達。SDS-PAGE顯示有相對分子質(zhì)量(Mr)為671036細胞。4重組hIL-12 cDNA共表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig 4. SD

20、S-PAGE analysis of hIL-12 cDNA coexpressionLine 1: Sf9 cells; Line 2-5: Sf9 cells transfected pAcUW51/IL-12 from 1 to 4 days; Line 6: protein marker 6.MTT法檢測IL-12表達產(chǎn)物促進NK細胞殺傷K562細胞的能力：當效靶比為101、IL-12作110 000稀釋時NK細胞的殺傷活性比對照提高60%，當效靶比為1001、IL-12作1100、11 000稀釋時，NK細胞的殺傷活性比對照分別提高55%和25%。7.MTT法檢測rhIL-12刺激P

21、BMC增殖活性：將rhIL-12依次作1102、1103、1104、1105稀釋，PBMC的增殖活性依次為24%、48%、58%、21%。討論在迄今為止所發(fā)現(xiàn)的細胞因子中，IL-12具有獨特的結(jié)構(gòu)特點，為兩條多肽鏈通過二硫鏈共價結(jié)合的Mr為70103(P70)二聚體，其重鏈(P40)由306個氨基酸組成，包含10個半胱氨酸殘基和4個潛在的糖基化位點，輕鏈(P35)由197個氨基酸組成，包含7個半胱氨酸殘基和3個潛在的糖基化位點。為了克隆和表達IL-12 P40和P35基因，我們通過SAC和IFN-LPS分別作用PBMC、PBL和粘附細胞，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，參考已發(fā)表的IL-12 cDNA基

22、因序列，設(shè)計相應(yīng)引物，結(jié)果從PBMC和粘附細胞中擴增出IL-12的2條基因片段，經(jīng)PDBu刺激的人KB細胞也擴增出2條基因片段，可能由于不同細胞IL-12 mRNA的豐度不同，僅在KB細胞和粘附細胞中擴增出編碼IL-12全長氨基酸的cDNA P40和P35，在PBL、Raji、K562細胞中未擴增出IL-12基因片段。由于IL-12由2條多肽鏈組成，且含有較多糖基化位點，體外表達較為困難。桿狀病毒/昆蟲細胞表達體系是真核表達體系中較為先進的一種，由于桿狀病毒基因組可在昆蟲細胞內(nèi)復制和轉(zhuǎn)錄，其巨大的DNA(80200kb)復制后組裝在桿狀的核衣殼內(nèi)，后者具有較大的柔軟性，能容納大片段外源DNA，

23、桿狀病毒體內(nèi)高表達多角體蛋白和P10蛋白，其啟動子具有極強的啟動蛋白表達能力，被用來構(gòu)建桿狀病毒轉(zhuǎn)染質(zhì)粒3，我們選用PharMingen公司最新構(gòu)建的雙啟動子桿狀病毒轉(zhuǎn)染載體pAcUW51，該載體以桿狀病毒AcNPV多角體啟動子為構(gòu)建基礎(chǔ)再插入P10啟動子，可同時表達2條多肽鏈。但2個啟動子下游均沒有多克隆位點，其中多角體啟動子下游僅有BamH插入位點，P10啟動子下游僅有EcoR和Bgl插入位點(見1)，而P40 cDNA中含EcoR位點，P35基因中含EcoR、BamH和Bgl位點。這樣P40 cDNA只能以BamH單酶切方式插入pAcUW51，經(jīng)EcoR鑒定獲取正向連接重組載體pAcUW

24、51/P40后，再以Bgl切成線性，同時將P35 cDNA經(jīng)Bcl酶切(Bgl和Bcl粘末端匹配)，從而將P35 cDNA插入pAcUW51/P40，構(gòu)建成功pAcUW51/IL-12重組載體，將該重組載體與Baculo GoldTMDNA共轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細胞獲取了IL-12真核表達產(chǎn)物，經(jīng)PCR、ELISA、SDS-PAGE、Western blot等方法鑒定后，證實表達產(chǎn)物為rhIL-12，Mr為67103，但SDS-PAGE顯示67103為主帶，未見明顯P35和P40帶型，估計完整蛋白未完全解開，與DAnerea用CHO表達的產(chǎn)物相似4，其中原因有待進一步分析。進一步研究發(fā)現(xiàn)，該表達產(chǎn)物對NK細胞殺傷K562細胞有較強的促進作用，體外對PBMC也有較強的促進增殖能力，該表達產(chǎn)物的獲取，為IL-12的免疫調(diào)控和抗腫瘤研究工作奠定了基礎(chǔ)?；痦椖浚荷綎|省