實(shí)時(shí)定量RTPCR檢測(cè)急性早幼粒細(xì)胞白血病PMLRARa融合基因

1、實(shí)時(shí)定量RT?PCR檢測(cè)急性早幼粒細(xì)胞白血病PML?RARa融合基因作者：段連寧 郎麗 李惠民 劉華 王義民 張學(xué)美 【摘要】 本研究旨在建立用實(shí)時(shí)定量RT?PCR檢測(cè)急性早幼粒細(xì)胞白血病（APL）PML?RARa mRNA的方法，探討APL PML?RARa融合基因表達(dá)水平與療效的關(guān)系。用RT?PCR擴(kuò)增培養(yǎng)的NB4細(xì)胞的PML?RARa融合基因，取1g NB4細(xì)胞的總cDNA進(jìn)行10倍的梯度稀釋?zhuān)鳛闃?biāo)準(zhǔn)品，建立熒光定量RT?PCR方法，對(duì)方法的靈敏性、穩(wěn)定性、重復(fù)性進(jìn)行了測(cè)定。定量檢測(cè)4例急性早幼粒細(xì)胞白血病（APL）患者治療前后骨髓內(nèi)PML?RARa融合基因轉(zhuǎn)錄本水平，并對(duì)1例經(jīng)治療完

2、全緩解后又復(fù)發(fā)的患者PML?RARa轉(zhuǎn)錄本水平（拷貝數(shù)）進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。結(jié)果表明：用本研究 建立的實(shí)時(shí)定量RT?PCR方法可檢測(cè)出10-5 g NB4細(xì)胞cDNA中的PML?RARa融合基因，其重復(fù)性的CT值，管間、批間變異系數(shù)（CV）分別為2.1%、3.8%。4例患者初治骨髓PML?RARa基因轉(zhuǎn)錄本水平的分別為1 884、5 533、1 803、4 677拷貝，平均為3 475拷貝。經(jīng)ATRA 化療治療后其PML?RARa基因轉(zhuǎn)錄水平下降至40、135、79、229拷貝，平均為121拷貝。還有1例患者治療前PML?RARa基因轉(zhuǎn)錄本水平為8 600拷貝，經(jīng)過(guò)4個(gè)月治療，雖然此時(shí)患者處于完全緩

3、解期，但其轉(zhuǎn)錄水平拷貝數(shù)仍有730。3個(gè)月后患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)，轉(zhuǎn)錄本水平升至為11 000拷貝。經(jīng)過(guò)ATRA 化療治療后轉(zhuǎn)錄本水平又逐漸下降至1 200拷貝。結(jié)論；建立的實(shí)時(shí)定量RT?PCR靈敏、重復(fù)性好。治療后APL患者的PML?RARa融合基因轉(zhuǎn)錄本水平明顯下降，復(fù)發(fā)時(shí)基因轉(zhuǎn)錄本水平又升高。融合基因表達(dá)水平的改變與臨床疾病進(jìn)展關(guān)系一致，這有助于監(jiān)測(cè)白血病微小殘留病，評(píng)價(jià)療效及判斷預(yù)后?！娟P(guān)鍵詞】 急性早幼粒細(xì)胞白血病Detection of PML/RARa Transcripts in Acute Promyelocytic Leukemia by Real?time Quantitativ

4、e Reverse Transcription Polymerase Chain ReactionAbstractTihs study was purposed to establish a real?time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT?PCR) for detection of PML/RARa fusion gene in patients with acute promyelocytic leukemia (APL) and to explore the relationship be

5、tween the expression level of PML/RARa fusion gene transcript and the clinical status or efficacy of the therapy in APL. The conventional RT?PCR was used to amplify PML/RARa gene from cultured NB4 cells. Standard curves were constructed by modified real?time PCR on standard template after 10?fold se

6、rial dilutions of cDNA of 1 g NB4 cells. The sensitivity, stability and repeatability of this method was determined. The PML/RARa gene transcripts of bone marrows in 4 APL patients before and after treatment and in 1 APL patient relapsed after complete remission were dynamically detected by modified

7、 real?time quantitative RT?PCR. The results indicated that the sensitivity of real?time quantitative RT?PCR for detecting PML/RARa fusion gene was about 10-5 g cDNA from NB4 cells, the repeatability and reproducibility of this method were satisfactory, intra?and inter?assay coefficients of variation

8、 were 2.1% and 3.8%. The copy numbers of PML/RARa transcripte reflecting PML/RARa fusion gene expression level in 4 newly diagnosed patients with APL were 1884, 5533,1803, 4677 and the median was 3 475. After ATRA chemotherapy copy numbers of PML/RARa transcript decreased to 40, 135, 79, 29, and mea

9、n was 121. Another patients PML/RARa gene copy number was 8600 at diagnosis, the gene copy number was 730 after therapy for 4 months, although he was in complete remission, but copy number increased to 11 000 when APL relapsed 3 months later.The copy number efficiently reduced to 1200 after ATRA che

10、motherapy.It is concluded that the established real?time quantitative RT?PCR method is sensitive, reliable, accurate and repeatable. The efficiency of method was finally tested for patient samples, showing a PML/RARa transcript copy number in APL patients significantly decrease after therapy, and in

11、crease at the time of relapse which indicate that changes of fusion gene expression levels coincide with clinical progress of disease. This method can be used to detect the minimal residual disease, assess response to treatment and evaluate prognosis of disease.Key wordsreal?time quantitative RT?PCR

12、; acute promyelocytic leukemia; PML?RARa fusion gene; minimal residual disease實(shí)時(shí)定量RT?PCR檢測(cè)急性早幼粒細(xì)胞白血病PML?RARa融合基因急性早幼粒細(xì)胞白血?。ˋPL）具有特異性的染色體易位t（15;17）易位，使17號(hào)染色體上的RARa基因與15號(hào)染色體上PML基因融合，產(chǎn)生融合基因PML?RARa。 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄?聚合酶鏈反應(yīng)（RT?PCR）技術(shù)實(shí)現(xiàn)了從定性到定量的飛躍，自動(dòng)化程度高，因而其應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。我們應(yīng)用這一方法檢測(cè)PML?RARa融合基因作為APL臨床診斷、評(píng)估微小殘留?。∕RD）和判斷其

13、預(yù)后的手段。材料和方法主要儀器PE9600型定性PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)Perkin?Elmer公司產(chǎn)品），PowerPac3000型電泳儀，Gel Doc1000紫外圖像分析系統(tǒng)和配套分析軟件（Bio?Rad公司產(chǎn)品），Gene Amp5700 Sequence Detecor定量PCR擴(kuò)增儀及配套分析系統(tǒng)和配套分析軟件（美國(guó)Bio?Rad公司產(chǎn)品）；5700型定量PCR儀（美國(guó)ABI公司產(chǎn)品）；5417R高速冷凍離心機(jī)和5415C高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品）。主要試劑RPIM 1640（Gibco公司產(chǎn)品）；胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司產(chǎn)品）；淋巴細(xì)胞分離液（中國(guó)協(xié)和醫(yī)科

14、大學(xué)生物研究所產(chǎn)品）；TRIzoL試劑（美國(guó)MRC公司產(chǎn)品）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司產(chǎn)品）；PML?RARa基因、?肌動(dòng)蛋白(?actin)寡核苷酸引物（上海生工生物工程公司產(chǎn)品）；DEPC水（焦碳酸二乙酯）(Bio Basic Inc產(chǎn)品)；LoadingBuffer, DNA Marker DL2000,Taq DNA聚合酶, dNTP(大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品)；Sybr Green染料(美國(guó)Bio?Rad公司產(chǎn)品)。檢測(cè)標(biāo)本細(xì)胞系 NB4細(xì)胞（引自上海瑞金醫(yī)院血液研究所）常規(guī)培養(yǎng)。骨髓標(biāo)本 取自5例APL患者的骨髓（男3例，女2例，14歲-42歲，平均年齡30歲）。單個(gè)

15、核細(xì)胞的分離及總RNA提取取患者EDTA抗凝骨髓2 ml，用淋巴細(xì)胞分離液分離獲得單個(gè)核細(xì)胞，然后對(duì)單個(gè)核細(xì)胞和培養(yǎng)的5106個(gè)NB4細(xì)胞，分別采用TRIzoL試劑并按試劑操作說(shuō)明書(shū)提取總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度后，-80保存?zhèn)溆谩Ｒ锏脑O(shè)計(jì)和合成PML?RARa融合基因形成過(guò)程中，RARa上的斷裂點(diǎn)總是位于第2個(gè)內(nèi)含子內(nèi)，但是PML上的斷裂點(diǎn)存在很多變異，主要集中在3個(gè)斷裂點(diǎn)叢集區(qū)（bcr）。bcr1在第6個(gè)內(nèi)含子內(nèi)，形成長(zhǎng)型轉(zhuǎn)錄本（L）。斷裂點(diǎn)bcr3在PML第3個(gè)內(nèi)含子內(nèi)，產(chǎn)生短型轉(zhuǎn)錄本（S）；而bcr2斷裂點(diǎn)位于第6外顯子內(nèi)形成變異型轉(zhuǎn)錄本（V）。這3種轉(zhuǎn)錄本分別占70（L），

16、20（S）和10（V）。我們檢測(cè)了L型融合基因拷貝數(shù)。L型引物序列參照了國(guó)外文獻(xiàn)1，應(yīng)用actin作為內(nèi)對(duì)照，具體序列如下表：L型 上游引物P6 ：5 ?GTCTTCCTGCCCAACAGC AACC?3 (190 bp)；下游引物R1：5 ?CTCACAGGC GCTGACCCCATAGT?3。?actin 上游引物： 5 ?AACGGC TCCGGCATGTGCAA?3 (117 bp)，下游引物： 5 ?CTTCTGACCCATGCCCACCA?3cDNA合成取1 g總RNA，采用cDNA合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，20 l體系的組成如下：隨機(jī)引物（oligodT 0.5 g/l）1 l,

17、 5buffer 4 l, RNA酶抑制劑（20 U/l） 1 l, 10 mmol/L dNTP Mix 2 l, 逆轉(zhuǎn)錄酶（MMULV） 1 l。反應(yīng)條件37 5分鐘,42 60分鐘,70 10分鐘。cDNA合成后以cDNA為模板進(jìn)行?actin管家基因的PCR擴(kuò)增(圖1)，判斷是否逆轉(zhuǎn)錄成功。Figure 1. Electrophoresis pattern of ?actin amplified by RT?PCR on agarose gel.轉(zhuǎn)錄本類(lèi)型的定性PCR確定取上述cDNA 2 l作為模板，以L型的正反向引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。25 l體系包括10buffer 2.5 l，Mg

18、Cl2 (25 mmol/L)2.5 l，dNTP (10 mmol/L)1 l,Taq酶（5 U/l）0.2 l,正反相引物均為1 l。反應(yīng)條件：94 5分鐘，94 45秒，60 60秒，72 90秒，共40個(gè)循環(huán)，72 6分鐘。L型轉(zhuǎn)錄本的擴(kuò)增長(zhǎng)度190 bp。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，如圖2：退火溫度為58時(shí)在250-500 bp之間有非特異性條帶，60時(shí)非特異性條帶較58時(shí)少，我們選擇60為退火溫度。Figure 2. Electrophoresis pattern of PML?RARa amplified by RT?PCR on agarose gel.L型PML?RARa基因標(biāo)準(zhǔn)品

19、的構(gòu)建用紫外分光光度計(jì)測(cè)NB4細(xì)胞的cDNA的濃度后，取1 g的cDNA依次進(jìn)行10倍的梯度稀釋?zhuān)盅b為1 g，10-1 g，10-2 g，10-3 g，10-4 g，10-5 g作為各自的標(biāo)準(zhǔn)品。（在NB4細(xì)胞中1 g的cDNA包含104拷貝的PML?RARa基因1）（圖3）。Figure 3. Amplification curves of reference at 102 -104 initiation copy number.定量PCR反應(yīng)定量PCR反應(yīng)體系 25 l體系中包括 10Buffer 2.5 l，MgCl2 (25 mmol/L)2.5 l，dNTP(10 mmol/L)1

20、 l,Taq酶（5 U/l）0.2 l,正反相引物均為1 l, cDNA或標(biāo)準(zhǔn)品2 l，SYBER?GREE染料3 l。熔解曲線(xiàn)分析先按94 5分鐘，94 45秒，60 60秒，72 90秒， 40個(gè)循環(huán)，72 6分鐘的反應(yīng)條件進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，儀器自動(dòng)進(jìn)行了熔解曲線(xiàn)分析，如圖4示：從熔解曲線(xiàn)圖中可見(jiàn)到兩個(gè)峰，一個(gè)峰值在69左右，另一個(gè)峰值在88左右。69左右的峰為引物二聚體小片段和染料結(jié)合釋放熒光產(chǎn)生的。88左右的峰為目的片段和染料結(jié)合釋放熒光產(chǎn)生的。我們?yōu)榱讼∑畏翘禺惍a(chǎn)物的影響，在延伸后加了升溫至87，持續(xù)5秒的步驟。則定量PCR反應(yīng)條件為：94 5分鐘，94 45秒，

21、60 60秒，72 90秒，87 5秒，共40個(gè)循環(huán)，72 6分鐘。Figure 4. Analysis of melting curve. Derivative(?dF/Dt):negative value of ten to one time derivative of fluorescence strength changed with temperature. 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)將各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的起始拷貝數(shù)取對(duì)數(shù)，作為橫坐標(biāo)，其所對(duì)應(yīng)的Ct值(循環(huán)域值，cycle threshold )作為縱坐標(biāo)，即可做出相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(圖5、6)。將各個(gè)樣本的平均Ct值，代入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，就可求出PML?R

22、ARa基因和?actin的拷貝數(shù)。校正的PML?RARa轉(zhuǎn)錄本水平(Dose N)=（PML?RARa的拷貝數(shù)?actin的拷貝數(shù)）1052。 結(jié)果方法的靈敏度對(duì)培養(yǎng)的 1 g NB4細(xì)胞的cDNA，進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)謩e用建立的熒光定量RT?PCR作檢測(cè)，可得到Ct值，其檢測(cè)PML?RARa融合基因的靈敏度達(dá)10-5 g cDNA（表1），由此制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.997。方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性我們對(duì)104基因拷貝數(shù)的模板分別做5個(gè)反應(yīng)管檢測(cè)。比較同一次反應(yīng)不同反應(yīng)管間的批內(nèi)變異及重復(fù)5次檢測(cè)比較不同時(shí)間的反應(yīng)結(jié)果的批間變異。檢測(cè)到該濃度同一次反應(yīng)不同反應(yīng)管的Ct值分別為：2

23、1.8，21.5，20.8，21.4，22.0；不同時(shí)間檢測(cè)的Ct值為：20.8，21.6，22.3，23.0，21.7。批內(nèi)變異系數(shù)為2.1，批間變異系數(shù)為3.8%。這說(shuō)明本方法穩(wěn)定性和重復(fù)性均好。分析4例APL患者（經(jīng)定性PCR電泳結(jié)果確定為L(zhǎng)型）初治時(shí)骨髓PML?RARa基因轉(zhuǎn)錄本水平，其轉(zhuǎn)錄本水平（拷貝數(shù)）分別為1 884，5 533，1 803，4 677，平均拷貝數(shù)為3475（表2）。以上4例APL患者經(jīng)ATRA化療治療6個(gè)月左右后，再次檢測(cè)其PML?RARa基因轉(zhuǎn)錄水平（拷貝數(shù)），結(jié)果分別為40，135，79，229，平均拷貝數(shù)為121。具體數(shù)據(jù)如表2。4例患者治療后基因拷貝數(shù)分

24、別為治療前的了1/47，1/41，1/23，1/21。治療前后患者PML?RARa轉(zhuǎn)錄本水平的比較4 例患者治療前轉(zhuǎn)錄本水平的平均數(shù)3 475（1 803-5 533）拷貝， 經(jīng)ATRA化療治療 6 個(gè)月后再次檢測(cè)轉(zhuǎn)錄本水平，其平均數(shù)為121（40-229）拷貝。治療前和治療后轉(zhuǎn)錄本水平經(jīng)t檢驗(yàn)得p=0.036(0.05），說(shuō)明治療前和治療后轉(zhuǎn)錄本水平之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。4例患者治療前轉(zhuǎn)錄水平的變異系數(shù)為55%,治療后轉(zhuǎn)錄水平的變異系數(shù)為68%,治療后變異系數(shù)大于治療前，由此推測(cè)不同患者對(duì)化療藥的敏感程度差異比較大。還有1例患者治療前基因轉(zhuǎn)錄本水平為8 600拷貝，經(jīng)過(guò)4個(gè)

25、月治療，雖然此時(shí)患者處于完全緩解期，但其轉(zhuǎn)錄水平拷貝數(shù)仍有730。3個(gè)月后患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)，轉(zhuǎn)錄本水平升至為11 000拷貝。經(jīng)過(guò)ATRA 化療治療后轉(zhuǎn)錄本水平又逐漸下降至1 200拷貝（圖7）。討論實(shí)時(shí)定量RT?PCR（real?time quantitative reverse?transcription polymerase chain reaction, RT?PCR）是在普通PCR反應(yīng)中加入能與PCR產(chǎn)物結(jié)合的熒光探針或熒光染料，使之熒光信號(hào)隨著擴(kuò)增產(chǎn)物的增加而成比例增長(zhǎng)，儀器實(shí)時(shí)檢測(cè)每一個(gè)循環(huán)結(jié)束后的熒光強(qiáng)度，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)比得出定量結(jié)果。可以直接檢測(cè)目的基因的起始數(shù)量，從而動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)

26、融合基因水平3。從擴(kuò)增到產(chǎn)物分析都是閉管操作，最大限度避免了污染，無(wú)PCR后處理。SYBR green 是一種能與雙鏈DNA結(jié)合的熒光染料，游離時(shí)幾乎沒(méi)有熒光信號(hào)，本底很低。PCR進(jìn)行過(guò)程中，它能結(jié)合到擴(kuò)增產(chǎn)物雙鏈DNA的小溝中，熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的非特異性雙鏈DNA（如引物二聚體）也會(huì)和染料結(jié)合產(chǎn)生熒光信號(hào)，其產(chǎn)生的干擾可通過(guò)熔解曲線(xiàn)分析得到解決。只要有合適的引物就可實(shí)現(xiàn)目的基因的RQ?PCR4。較之序列特異性熒光探針，它無(wú)需探針設(shè)計(jì)，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)難度，且價(jià)格便宜，是一種值得推薦的熒光定量PCR技術(shù)。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，用熒光定量PCR方法重復(fù)40次反應(yīng)，其Ct值的變異系數(shù)為1.6%。

27、如電泳凝膠掃描定量，其變異系數(shù)高達(dá)31%，兩者相差19倍多4。本實(shí)驗(yàn)管間、批間變異系數(shù)分別為2.1%和3.8%，與其相近。說(shuō)明本方法穩(wěn)定性和重復(fù)性均好。我們使用定量RT?PCR方法檢測(cè)PML?RARa融合基因的靈敏度達(dá)10-5 g cDNA，按10-5 g cDNA/細(xì)胞計(jì)算，本方法可從105個(gè)正常細(xì)胞中查出1個(gè)白血病細(xì)胞，與文獻(xiàn)報(bào)道的定量RT?PCR方法相仿5。我們建立實(shí)時(shí)定量RT?PCR檢測(cè)急性早幼粒細(xì)胞白血病融合基因，同時(shí)檢測(cè)同一標(biāo)本的融合基因及管家基因，不必考慮RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的差異，以校正拷貝數(shù)（PML?RARa的拷貝數(shù)?actin的拷貝數(shù)）105表示，使用管家基因?acti

28、n對(duì)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)化，更具科學(xué)性。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT?PCR技術(shù)，不僅能夠確定患者PML?RARa轉(zhuǎn)錄本的有無(wú)，而且可確定其轉(zhuǎn)錄本水平，觀察其動(dòng)態(tài)變化。通過(guò)實(shí)時(shí)定量RT?PCR監(jiān)測(cè)PML?RARa轉(zhuǎn)錄本水平的變化，可以預(yù)測(cè)急性早幼粒細(xì)胞白血病患者的治療反應(yīng)，定量白血病細(xì)胞的殘余數(shù)量和預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)，這比細(xì)胞遺傳學(xué)檢查早數(shù)月6,7。我們檢測(cè)了4例APL患者初治時(shí)骨髓PML?RARa基因轉(zhuǎn)錄本水平，其分別為1 884，5 533，1 803，4 677拷貝，平均拷貝數(shù)為3 475。經(jīng)ATRA化療治療后基因轉(zhuǎn)錄水平分別為40，135，79，229拷貝，平均拷貝數(shù)為121。經(jīng)治療后PMLRARa基因轉(zhuǎn)錄本水平明顯

29、下降，證明治療是有效的。治療前和治療后轉(zhuǎn)錄本水平經(jīng)t檢驗(yàn)得P=0.036（0.05），這說(shuō)明治療前和治療后轉(zhuǎn)錄本水平之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4例患者治療前時(shí)轉(zhuǎn)錄水平的變異系數(shù)為55%,治療后轉(zhuǎn)錄水平的變異系數(shù)為68%。治療后變異系數(shù)大于治療前，由此我們可以推測(cè)，不同患者對(duì)化療藥的敏感程度差異比較大。還有1例患者治療前PML?RARa基因轉(zhuǎn)錄本水平為8 600拷貝，經(jīng)過(guò)2個(gè)月誘導(dǎo)鞏固治療，雖然此時(shí)患者處于完全緩解期，但其轉(zhuǎn)錄水平拷貝數(shù)仍有730。5個(gè)月后患者復(fù)發(fā)，轉(zhuǎn)錄本水平升至11 000拷貝數(shù)。經(jīng)過(guò)ATRA 化療治療后轉(zhuǎn)錄本水平又逐漸下降至1 200?？傊?，實(shí)時(shí)定量RT?PCR是一種快速、準(zhǔn)確和

30、高度敏感的實(shí)驗(yàn)方法，它不僅能夠檢測(cè)到微小殘留病灶的存在，更重要的是，通過(guò)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)PML?RARa轉(zhuǎn)錄本水平及其變化，可以預(yù)測(cè)急性早幼粒細(xì)胞白血病患者的治療反應(yīng)，定量白血病細(xì)胞的殘余數(shù)量和預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)，這比定性PCR檢測(cè)具有更為重要的臨床意義?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1Cassinat B, Zassadowski F, Balitrand N, et al. Quantitation of minimal residual disease in acute promyelocytic leukemia patients with t(15;17) translocation using real?time RT?PCR. Leukemia, 2000; 14:324-3282Gu BW，Hu J，Xu L，et alFeasibility and clinical significance of real?time quantitative RT?PCR assay of PML?RARa fusion transcript in patients with acute promyeloeytic leukemiaHematol J，2001;2:330-3403Diverio D, Rossi V, Avv