光學顯微鏡的工作原理

1、光學顯微鏡的工作原理顯微鏡是一種精密的光學儀器，已有 300 多年的發(fā)展史。自從有了顯微鏡，人們看到了過去 看不到的許多微小生物和構成生物的基本單元細胞。 目前， 不僅有能放大千余倍的光學顯微鏡， 而且有放大幾十萬倍的電子顯微鏡，使我們對生物體的生命活動規(guī)律有了更進一步的認識。在普通 中學生物教學大綱中規(guī)定的實驗中，大部分要通過顯微鏡來完成，因此，顯微鏡性能的好壞是做好 觀察實驗的關鍵。一、顯微鏡的光學系統(tǒng)顯微鏡的光學系統(tǒng)主要包括物鏡、目鏡、 反光鏡和聚光器四個部件。 廣義的說也包括照明光源、濾光器、蓋玻片和載玻片等。（一）、物鏡物鏡是決定顯微鏡性能的最重要部件，安裝在物鏡轉換器上，接近被觀察

2、的物體，故叫做物鏡 或接物鏡。1、物鏡的分類物鏡根據(jù)使用條件的不同可分為干燥物鏡和浸液物鏡；其中浸液物鏡又可分為水浸物鏡和油浸 物鏡（常用放大倍數(shù)為 90 100 倍）。根據(jù)放大倍數(shù)的不同可分為 低倍物鏡（ 10 倍以下）、中倍物鏡（ 20 倍左右）高倍物鏡（ 40 65 倍）。根據(jù)像差矯正情況，分為消色差物鏡（常用，能矯正光譜中兩種色光的色差的物鏡）和復色差物鏡 （能矯正光譜中三種色光的色差的物鏡，價格貴，使用少） 。2、物鏡的主要參數(shù)：物鏡主要參數(shù)包括：放大倍數(shù)、數(shù)值孔徑和工作距離。 、放大倍數(shù)是指眼睛看到像的大小與對應標本大小的比值。它指的是長度的比值而不是面積的比值。例：放大倍數(shù)為 1

3、00x，指的是長度是1卩m的標本，放大后像的長度是100卩m,要是以面積計算，則放大了 10,000倍。顯微鏡的總放大倍數(shù)等于物鏡和目鏡放大倍數(shù)的乘積。 、數(shù)值孔徑也叫鏡口率，簡寫NA或A ,是物鏡和聚光器的主要參數(shù)，與顯微鏡的分辨力成正比。干燥物鏡的數(shù)值孔徑為 0.05-0.95，油浸物鏡（香柏油）的數(shù)值孔徑為1.25。 、工作距離是指當所觀察的標本最清楚時物鏡的前端透鏡下面到標本的蓋玻片上面的距離。物鏡 的工作距離與物鏡的焦距有關，物鏡的焦距越長，放大倍數(shù)越低，其工作距離越長。例：10 倍物鏡上標有 10/0.25 和 160/0.17，其中 10 為物鏡的放大倍數(shù)； 0.25 為數(shù)值孔徑

4、； 160 為鏡筒長度（單位 mm）；0.17 為蓋玻片的標準厚度（單位 mm）。 10 倍物鏡有效工作距離為 6.5mm，40 倍物鏡有效工 作距離為 0.48mm 。3、物鏡的作用是將標本作第一次放大，它是決定顯微鏡性能的最重要的部件分辨力的高低。 分辨力也叫分辨率或分辨本領。 分辨力的大小是用分辨距離 （所能分辨開的兩個物點間的最小距離） 的數(shù)值來表示的。在明視距離（25cm）之處，正常人眼所能看清相距0.073mm的兩個物點，這個0.073mm 的數(shù)值，即為正常人眼的分辨距離。顯微鏡的分辨距離越小，即表示它的分辨力越高，也 就是表示它的性能越好。顯微鏡的分辨力的大小由物鏡的分辨力來決定

5、的，而物鏡的分辨力又是由它的數(shù)值孔徑和照明光線 的波長決定的。當用普通的中央照明法（使光線均勻地透過標本的明視照明法）時，顯微鏡的分辨距離為d=0.61入/NA式中d 物鏡的分辨距離，單位nm。入一一照明光線波長，單位nm。NA 物鏡的數(shù)值孔徑例如油浸物鏡的數(shù)值孔徑為 1.25,可見光波長范圍為 400700nm ,取其平均波長550 nm ,則d=270 nm，約等于照明光線波長一半。一般地，用可見光照明的顯微鏡分辨力的極限是0.2卩m。（二）、目鏡因為它靠近觀察者的眼睛，因此也叫接目鏡。安裝在鏡筒的上端。1 、目鏡的結構 通常目鏡由上下兩組透鏡組成，上面的透鏡叫做接目透鏡，下面的透鏡叫做會

6、聚透鏡或場鏡。上下 透鏡之間或場鏡下面裝有一個光闌（它的大小決定了視場的大?。?，因為標本正好在光闌面上成像，可在這個光闌上粘一小段毛發(fā)作為指針， 用來指示某個特點的目標。 也可在其上面放置目鏡測微尺， 用來測量所觀察標本的大小。目鏡的長度越短，放大倍數(shù)越大（因目鏡的放大倍數(shù)與目鏡的焦距成反比）。2、目鏡的作用 是將已被物鏡放大的，分辨清晰的實像進一步放大，達到人眼能容易分辨清楚的程度。常用目鏡的放大倍數(shù)為 516 倍。3、目鏡與物鏡的關系物鏡已經分辨清楚的細微結構，假如沒有經過目鏡的再放大，達不到人眼所能分辨的大小，那就看 不清楚；但物鏡所不能分辨的細微結構，雖然經過高倍目鏡的再放大，也還是看

7、不清楚，所以目鏡 只能起放大作用，不會提高顯微鏡的分辨率。有時雖然物鏡能分辨開兩個靠得很近的物點，但由于 這兩個物點的像的距離小于眼睛的分辨距離，還是無法看清。所以，目鏡和物鏡即相互聯(lián)系，又彼 此制約。（三）、聚光器聚光器也叫集光器。位于標本下方的聚光器支架上。它主要由聚光鏡和可變光闌組成。其中，聚光 鏡可分為明視場聚光鏡（普通顯微鏡配置）和暗視場聚光鏡。1、光鏡的主要參數(shù)數(shù)值孔徑（ NA ）是聚光鏡的主要參數(shù)，最大數(shù)值孔徑一般是1.2 1.4，數(shù)值孔徑有一定的可變范圍，通?？淘谏戏酵哥R邊框上的數(shù)字是代表最大的數(shù)值孔徑，通過調節(jié)下部可變光闌的開放程度， 可得到此數(shù)字以下的各種不同的數(shù)值孔徑，以

8、適應不同物鏡的需要。有的聚光鏡由幾組透鏡組成， 最上面的一組透鏡可以卸掉或移出光路， 使聚光鏡的數(shù)值孔徑變小， 以適應低倍物鏡觀察時的照明。2、聚光鏡的作用聚光鏡的作用相當于凸透鏡，起會聚光線的作用，以增強標本的照明。一般地把聚光鏡的聚光焦點 設計在它上端透鏡平面上方約 1.25mm 處。（聚光焦點正在所要觀察的標本上，載玻片的厚度為 1.1mm 左右）3、可變光闌可變光闌也叫光圈，位于聚光鏡的下方，由十幾張金屬薄片組成，中心部分形成圓孔。其作用是調 節(jié)光強度和使聚光鏡的數(shù)值孔徑與物鏡的數(shù)值孔徑相適應?？勺児怅@開得越大，數(shù)值孔徑越大（觀 察完畢后，應將光圈調至最大） 。在可變光闌下面，還有一個

9、圓形的濾光片托架。說明：在中學實驗室只有教師用顯微鏡（ 1600 X或1500 X ）才配有聚光器，學生用顯微鏡（ 640X 或500X ）配的是旋轉光欄。緊貼在載物臺下，能做圓周轉動的圓盤，旋轉光欄（也稱為遮光器），光欄上有大小不等的圓孔，叫光圈。直徑分別為2、3、6、12、16mm,轉動旋轉光欄，光欄上每個光圈都可以對正通光孔，通過大小不等的光圈來調節(jié)光線的強弱。（四）反光鏡反光鏡是一個可以隨意轉動的雙面鏡，直徑為50mm, 面為平面，一面為凹面，其作用是將從任何方向射來的光線經通光孔反射上來。平面鏡反射光線的能力較弱，是在光線較強時使用，凹面鏡 反射光線的能力較強,是在光線較弱時使用。反

10、光鏡通常一面是平面鏡,另一面是凹面鏡,裝在聚光器下面,可以在水平與垂直兩個方向上任意 旋轉。反光鏡的作用是使由光源發(fā)出的光線或天然光射向聚光器。當用聚光器時一般用平面鏡,不用時用 凹面鏡；當光線強時用平面鏡,弱時用凹面鏡。觀察完畢后,應將反光鏡垂直放置。（五）照明光源顯微鏡的照明可以用天然光源或人工光源1、天然光源 光線來自天空,最好是由白云反射來的。不可利用直接照來的太陽光。2、人工光源 、對人工光源的基本要求：有足夠的發(fā)光強度；光源發(fā)熱不能過多。 、常用的人工光源：顯微鏡燈；日光燈（六）濾光器 安裝在光源和聚光器之間。作用是讓所選擇的某一波段的光線通過,而吸收掉其他的光線,即為了 改變光線

11、的光譜成分或削弱光的強度。分為兩大類：濾光片和液體濾光器。（七）蓋玻片和載玻片 蓋玻片和載玻片的表面應相當平坦,無氣泡,無劃痕。最好選用無色,透明度好的,使用前應洗凈。蓋玻片的標準厚度是 0.17 ± 0.02mm，如不用蓋玻片或蓋玻片厚度不合適，都回影響成像質量。載玻片的標準厚度是 1.1 ± 0.04mm， 一般可用范圍是1 1.2mm，若太厚會影響聚光器效能，太薄則容易破裂。二、顯微鏡的機械裝置顯微鏡的機械裝置是顯微鏡的重要組成部分。其作用是固定與調節(jié)光學鏡頭，固定與移動標本等。 主要有鏡座、鏡臂、載物臺、鏡筒、物鏡轉換器、與調焦裝置組成。（一）、鏡座和鏡臂1、鏡座

12、作用是支撐整個顯微鏡，裝有反光鏡，有的還裝有照明光源。2、鏡臂 作用是支撐鏡筒和載物臺。分固定、可傾斜兩種。（二）、載物臺（又稱工作臺、鏡臺）載物臺作用是安放載玻片，形狀有圓形和方形兩種，其中方形的面積為120mmx 110mm。中心有個通光孔，通光孔后方左右兩側各有一個安裝壓片夾用的小孔。分為固定式與移動式兩種。有的載 物臺的縱橫坐標上都裝有游標尺，一般讀數(shù)為0.1mm，游標尺可用來測定標本的大小，也可用來對被檢部分做標記。（三）、鏡筒鏡筒上端放置目鏡，下端連接物鏡轉換器。分為固定式和可調節(jié)式兩種。機械筒長（從目鏡管上緣 到物鏡轉換器螺旋口下端的距離稱為鏡筒長度或機械筒長）不能變更的叫做固定

13、式鏡筒，能變更的 叫做調節(jié)式鏡筒，新式顯微鏡大多采用固定式鏡筒，國產顯微鏡也大多采用固定式鏡筒，國產顯微 鏡的機械筒長通常是 160mm。安裝目鏡的鏡筒，有單筒和雙筒兩種。單筒又可分為直立式和傾斜式兩種，雙筒則都是傾斜式的。 其中雙筒顯微鏡，兩眼可同時觀察以減輕眼睛的疲勞。雙筒之間的距離可以調節(jié)，而且其中有一個 目鏡有屈光度調節(jié)（即視力調節(jié)）裝置，便于兩眼視力不同的觀察者使用。（四）、物鏡轉換器物鏡轉換器固定在鏡筒下端，有3 4 個物鏡螺旋口，物鏡應按放大倍數(shù)高低順序排列。旋轉物鏡轉換器時，應用手指捏住旋轉碟旋轉，不要用手指推動物鏡，因時間長容易使光軸歪斜，使成像質 量邊壞。（五）、調焦裝置顯

14、微鏡上裝有粗準焦螺旋和細準焦螺旋。有的顯微鏡粗準焦螺旋與裝在同一軸上，大螺旋為粗準焦 螺旋，小螺旋為細準焦螺旋；有的則分開安置，位于鏡臂的上端較大的一對螺旋為是粗準焦螺旋， 其轉動一周，鏡筒上升或下降 10mm。 位于粗準焦螺旋下方較小的一對螺旋為細準焦螺旋，其轉動一周，鏡筒升降值為 0.1mm，細準焦螺旋調焦范圍不小于1.8mm。三、顯微鏡及其部件的使用1 、使用單筒顯微鏡時，要養(yǎng)成用左眼觀察的習慣（因一般用右手畫圖），觀察時要兩眼同時睜開，不要睜一只閉一只，因為這樣易于疲勞。為了訓練學生習慣于兩眼同時睜開觀察，可剪一塊長約14cm,寬約6cm的長方形硬紙片， 在靠近左端處挖一個直徑比鏡筒上

15、端外徑略小的圓孔，把圓孔套在鏡筒上段，觀察時兩眼同時睜開，利用紙片的右端擋住右眼的視線，這樣訓練一段時間后，就能 習慣于兩眼同時睜開,然后把紙片去掉。2、直筒顯微鏡的鏡臂與鏡座連接處,是一個機械關節(jié),可用于調節(jié)鏡筒的傾斜度,便于觀察,鏡臂不能過于后傾,一般不超過40°。但是在使用臨時裝片觀察時,禁止使用傾斜關節(jié)（當鏡筒傾斜時,載物臺也隨之傾斜,載玻片上的液體易流出） ,尤其是裝片內含酸性試劑時嚴禁使用,以免污 損鏡體。3、目鏡和物鏡的使用一般都是用一個放大倍數(shù)適中的目鏡（10X）和最低倍的物鏡開始觀察，逐步改用倍數(shù)較高的物鏡，從中找到符合實驗要求的放大倍數(shù)。轉換物鏡時,先用低倍鏡觀察

16、,調節(jié)到正確的工作距離（成像最清晰）。如果進一步使用高倍物鏡觀察,應在轉換高倍物鏡之前,把物像中需要放大觀察的部分移至視野中央（將低倍物鏡轉換成高 倍物鏡觀察時,視野中的物像范圍縮小了很多） 。低倍物鏡和高倍物鏡基本齊焦（同高調焦） ,在用 低倍物鏡觀察清晰時,換高倍物鏡應可以見到物像,但物像不一定很清晰,可以轉動細準焦螺旋進 行調節(jié)。通常認為,使用任何一個物鏡時,有效放大倍數(shù)的上限是1, 000 乘它的數(shù)值孔徑,下限是 250 乘它的數(shù)值孔徑。如40X物鏡的數(shù)值孔徑是 0.65,則上、下限分別為：1000X 0.65=650倍和250X 0.65 -163倍，超過有效放大倍數(shù)上限的叫做無效放

17、大，不能提高觀察效果。低于下限的放大倍數(shù)則人 眼無法分辨,不利于觀察。一般最實用的放大倍數(shù)范圍是 500700 乘數(shù)值孔徑之間的數(shù)字。4、油浸物鏡的使用使用油浸物鏡時,一般不要使用同高調焦。同高調焦只適用于每臺顯微鏡的原配物鏡,在使用低倍 和高倍物鏡時,是一個極有利的方便條件,但在使用油浸物鏡時,則受到一定限制,一般地說,用 油鏡觀察未加蓋玻片的標本片（載玻片）時,利用同高調焦的安全度較大,而對于有蓋玻片的標本 片,要小心使用,因為油浸物鏡的工作距離很短,在設計和裝配時所考慮的同高是對標準厚度蓋玻 片的。用油浸物鏡時,只在標本片上滴香柏油。觀察完畢后,要及時進行清潔工作,如不及時進行,香柏 油

18、粘上灰塵,擦拭時灰塵粒子可能磨損透鏡,香柏油在空氣中暴露時間長,還會變稠、變干,擦拭 很困難,對儀器很不利。擦拭要細心,動作要輕。油浸物鏡前端先用干的擦鏡紙擦一兩次,把大部 分油去掉，再用二甲苯滴濕的擦鏡紙擦兩次，最后再用干的擦鏡紙擦一次。標本片上的香柏油可用 “拉紙法”（即把一小張擦鏡紙蓋在香柏油上，然后在紙上滴一些二甲苯，趁濕把紙往外拉，這樣 連續(xù)三四次，即可干凈，一般不會損壞未加蓋玻片的涂片標本）擦凈。擦鏡紙也要防塵，一般在使 用前，將每頁剪成 8 小塊，貯存在一個干凈的小培養(yǎng)皿中，用起來既節(jié)省又方便。5、聚光器的使用方法 、使用聚光器的原因當放大倍數(shù)增加時，一方面由于放大倍數(shù)越高，透鏡數(shù)目越多，被透鏡吸收的光線也越多；另一方 面由于視場 （指的是所能看到被檢標本的范圍） 的亮度與放大倍數(shù)的平方成反比， 即放大倍數(shù)越高， 視場越暗。為了得到足夠的亮度，必須安裝聚光器，把光線集中到所要觀察的標本上。 、觀察時聚光器應處的高度觀察時，要保證得到最好的觀察效果，聚光器的聚光焦點應正好落在標本上。要實現(xiàn)這個條件，就 必須調節(jié)聚光器的高度。當用平行光照明時