人胎盤層粘連蛋白單克隆抗體的制備與鑒定

1、層 粘 連 蛋 白 (laminin , LN 是 細 胞 外 間 質(zhì) 成 份 中 的 一 種 非 膠 原 性 糖 蛋 白 , 主 要 存 在 于 基 底 膜 的 透 明 層 , 與 型 膠 原 等 共 同 維 持 基 底 膜 的 結(jié) 構(gòu) 和 功 能 。 自 1979年 首 次 分 離 并 命 名 以 來 1, 已 相 繼 發(fā) 現(xiàn) LN 與 某 些 疾 病 密 切 相 關(guān) , 測 定 血 清 層 粘 連 蛋 白 在 肝 纖 維 化 診 斷 2, 3、 門 靜 脈 高 壓 判 斷 4及 腫 瘤 侵 潤 5等 方 面 具 有 重 要 臨 床 價 值 。本 研 究 旨 在 研 究 制 備 抗 人 層

2、 粘 連 蛋 白 單 克 隆 抗 體 (McAb , 為 建 立 檢 測 人 層 粘 連 蛋 白 的 免 疫 學(xué) 試 劑 盒 奠 定 基 礎(chǔ) 。1材料與方法1.1動 物Balb /C 小 鼠 購 自 中 山 大 學(xué) 動 物 中 心 , 雄 性 ,人 層 粘 連 蛋 白 由 本 室 從 人 胎 盤 經(jīng) 胃 蛋 白 酶消 化 提 取 , 免 疫 層 析 純 化 。主 要 試 劑 及 儀 器RPMI-1640、 HAT 培 養(yǎng) 液 和 HT培 養(yǎng) 液 (美 國 Gibco 公 司 ; 小 牛 血 清 (美 國 Hyclone 公 司 ; 弗 氏 完 全 佐 劑 及 弗 氏 不 完 全 佐 劑 (上

3、海 生 工 ; HRP-山 羊 抗 小 鼠 IgG (華 美 生 物 工 程 公 司 ; 小 鼠 單 抗 Ig 亞 類 測 定 (McAb Isotype 試 劑 盒 (美 國 Pierce 公 司 ; 紫 外 分 光 光 度 計 (島 津 ; 酶 標 儀 (芬 蘭 雷 勃 MK3 ; 洗 板 機 (北 京 天 石 ZMX-96 ; 其 他 試 劑 為 國 產(chǎn) 分 析 純 。1.2方 法小 鼠 免 疫 試 驗用 純 化 的 hLN 免 疫 小 鼠 。 首 次 免疫 以 抗 原 加 等 量 弗 氏 完 全 佐 劑 乳 化 , 小 鼠 腹 腔 注 射 0.2ml /只 (抗 原 含 量 約 70$

4、g ; 間 隔 1個 月 后 以 抗 原 加 等 量不 完 全 佐 劑 乳 化 , 腹 腔 注 射 0.2ml /只 ; 于 融 合 前 3d , 尾 靜 脈 注 射 抗 原 0.1ml 追 加 免 疫 1次 。 追 加 免 疫 與 第 2次人胎盤層粘連蛋白單克隆抗體的制備與鑒定曾憲威 , 蔣藝勤 , 肖靜 , 楊元好(廣東省深圳市寶安區(qū)松崗人民醫(yī)院檢驗科 , 深圳518105【 摘 要 】 目 的獲 得 能 特 異 性 識 別 人 層 粘 連 蛋 白 (hLN 的 單 克 隆 抗 體 (McAb 。 方 法用 純 化 的 人 層粘 連 蛋 白 (hLN 作 抗 原 免 疫 Balb /C 小

5、 鼠 , 以 細 胞 融 合 、 酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 實 驗 (ELISA 篩 選 和 克 隆 化 技 術(shù) 獲 得 抗 hLN 的 雜 交 瘤 細 胞 株 ; 用 生 物 學(xué) 方 法 鑒 定 雜 交 瘤 細 胞 , 用 免 疫 學(xué) 方 法 鑒 定 McAb 的 特 異 性 。 結(jié) 果獲 得 4株穩(wěn) 定 分 泌 抗 人 LN 的 雜 交 瘤 細 胞 株 (2A1、 3B5、 2C4、 4D1 , 培 養(yǎng) 上 清 的 ELISA 效 價 分 別 為 :1 512、 1 1024、1 512、 1 256; 腹 水 效 價 分 別 為 :1×106、 1×107、 1

6、5;106、 1×105; 采 用 ELISA 相 加 法 表 明 2A1、 4D1與 3B5、 2C4識 別的 hLN 上 的 抗 原 決 定 簇 和 識 別 的 不 同 , 4株 單 抗 均 屬 實 IgG 。 結(jié) 論成 功 建 立 了 4株 穩(wěn) 定 分 泌 抗 人 LN McAb的 雜 交 瘤 細 胞 株 , 它 們 分 別 識 別 hLN 上 2個 不 同 的 抗 原 位 點 , 有 望 作 為 hLN 定 量 檢 測 的 特 異 性 抗 體 ?！?關(guān) 鍵 詞 】 層 粘 連 蛋 白 ; 單 克 隆 抗 體 ; 酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 試 驗 ; 制 備 中 圖 分 類 號

7、:Q513.2文 獻 標 識 碼 :APreparation and Identification of Monoclonal Antibody Against Human LamininZENG Xian-wei , JIANG Yi-qing , XIAO Jing , YANG Yuan-hao(Department of Labortory Medicine , People 5s Hospital of Songgang , Shenzhen 518105, China 【 Abstract 】 ObjectiveTo prepare a monoclonal antibody (M

8、cAb against human laminin (hLN . MethodsSpleen cells from Balb /c mice immunized with human laminin (hLN were fused with Sp2/0myeloma cells. The specific McAb were screened by ELISA and identified by western blot. ResultsFour hybridoma cell lines (2A1, 3B5, 2C4and4D1 secreting specific McAb agaionst

9、 human laminin (hLN were selected and determined to recognize different epitops on human laminin. The titers of the culture supernatant determined by ELISA of the four clones were 1 512, 1 1024, 1 512, and 1 256; of the ascites were 1×106, 1×107, 1×106and 1×105. McAbs of 2A1and 4

10、D1recognize one epitope on human laminin , whereas 3B5and 2C4recognize another epitope. 2A1, 4D1, 3B5and 2C4are IgG McAbs.ConclusionFour hybridoma cell lines producing high titer and specific McAbs against the human laminin were established.【 Key words 】 laminin ; McAb ; ELISA ; preparation作者簡介 :曾憲威

11、 (1965 , 男 , 主管技師 , 從事專業(yè)為臨床醫(yī)學(xué)檢驗。 基礎(chǔ)研究論著 文章編號 1672-3619(200707-0636-03636 熱帶醫(yī)學(xué)雜志 2007年 7月第 7卷第 7期表 1雜 交 瘤 細 胞 的 染 色 體 計 數(shù) 及 Ab Ig 亞 類 鑒 定 Tab.1Counting of the hybridoma cell line chromosomes and the monoclonal antibody isotyping identification細 胞 株2A1 3B5 2C4 4D1每 個 細 胞 染 色 體 數(shù) 目1019899107Ig 亞 類IgG1I

12、gG1IgG2aIgG1輕 鏈 McAb 亞 類 表 2不 同 細 胞 株 McAb 抗 原 表 位 的 鑒 定Tab.2Resultes of AI (% between hybridoma cells by ELISA (450nm AI (% 2A1 3B5 2C4 4D1 2A1-86.380.831.63B578.4-29.576.52C482.230.4-86.44D1 28.6 77.8 75.4 -免 疫 的 間 隔 時 間 至 少 為 4周 。AI=2A 1+2/(A 1+A 2 -1×100%如 AI 值 >50%, 則 相 加 實 驗 陽 性 , 說 明

13、2株 單 抗 間 沒 有 競 爭 性 抑 制 現(xiàn) 象 , 表 位 不 同 , 反 之 , 則 存 在 競 爭 性 抑 制 現(xiàn) 象 , 具 有 相 同 的 抗 原 表 位 。2結(jié)果2.1雜 交 瘤 細 胞 系 的 建 立脾 細 胞 與 Sp2/0的 融 合 率 達 到 97%以 上 (836/862 孔 , 間 接 ELISA 初 次 篩 選 得 到 15個 陽 性 孔 。 經(jīng) 反 復(fù) 免 疫 篩 選 , 4次 克 隆 化 后 , 得 到 4株 克 隆 生 長 好 , 經(jīng) 檢 測 呈 陽 性 的 雜 交 瘤 細 胞 , 分 別 命 名 為 2A1、 3B5、 2C4、 4D1, 均 能 夠 保

14、持 體 外 連 續(xù) 傳 代 3個 月 以 上 , 液 氮 中 凍 存 后 復(fù) 蘇 仍 能 穩(wěn) 定 分 泌 抗 體 且 效 價 不 變 。2.2McAb 的 鑒 定3討論層 粘 連 蛋 白 的 檢 測 主 要 應(yīng) 用 于 肝 纖 維 化 診 斷 、 門 靜 脈 圖 14株 McAb 與 hLN 免 疫 印 跡 實 驗Fig.1Western blot analysis of binding 4McAb with hLN 1:2A1; 2:3B5; 3:2C4; 4 :4D1637 ! (上 接 第 635頁 7 8 91011SKURRAY RA. Proton-dependent multid

15、rug efflux systems J .Microbiol Rev , 1996, 60(4 :575-608.JACK DL , YANG NM , SAIER MH. The drug /metabolitetransporter superfamily J Eur J Biochem , 2001, 268(13 :3620-3639.NINIO S , ELBAZ Y , SCHULDINER S. The membrane topologyof EmrE-a small multidrug transporter from Escherichia coliJ . FEBS Let

16、t , 2004, 562(1-3 :193-196.CONSEIL G , PEREZ -VICTORIA JM , JAULT JM , et al.Protein kinase C effectors bind to multidrug ABC transportersand inhibit their activity J Biochemistry , 2001, 40(8 :2564-2571.SHABAAN AM , MOHAMED MM , ABDALLAH MS , et al. Cloning and characterization of a Schistosoma man

17、soni 1H and 30S clones as two tegumental vaccine candidate antigens J . Acta Biochim Pol , 2003, 50(1 :269-278.GOBERT GN , STENZEL DJ , MCMANUS DP , et al. The ultrastructural architecture of the adult Schistosoma japonicum tegument J . Int J Parasitol , 2003, 33(14 :1561-1575. 收 稿 日 期 :2007-04-10;

18、修 回 日 期 :2007-05-20高 壓 判 斷 4及 腫 瘤 侵 潤 5等 方 面 有 重 要 的 臨 床 價 值 , 所 以 層 粘 連 蛋 白 的 研 究 是 目 前 較 為 活 躍 的 領(lǐng) 域 之 一 。雖 然 LN 的 發(fā) 現(xiàn) 已 多 年 , 國 內(nèi) 外 少 數(shù) 實 驗 室 建 立 放 射 免 疫 和 酶 免 檢 測 方 法 , 但 試 劑 的 穩(wěn) 定 性 、 靈 敏 度 、 線 性 范 圍 和 操 作 的 簡 便 性 等 存 在 較 大 的 問 題 。臨 床 推 廣 困 難 , 主 要 原 因 之 一 就 是 因 為 缺 乏 高 質(zhì) 量 的 單 克 隆 抗 體 。 本 研 究

19、應(yīng) 用 自 制 用 純 化 的 人 層 粘 連 蛋 白 (hLN 作 抗 原 免 疫 Balb /C 小 鼠 , 以 細 胞 融 合 、 酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 實 驗 (ELISA 篩 選 和 克 隆 化 技 術(shù) 獲 得 抗 hLN 的 雜 交 瘤 細 胞 株 , 與 小 鼠 骨 髓 瘤 細 胞 融 合 建 立 了 4株 能 穩(wěn) 定 分 泌 抗 hLN McAb 的 雜 交 瘤 細 胞 株 , 并 獲 得 了 針 對 hLN 上 兩 個 不 同 抗 原 決 定 簇 的 McAb 。 初 步 研 究 表 明 , 這 4株 McAb 與 抗 原 具 有 良 好 的 親 和 性 和 特 異 性 ,

20、 為 建 立 雙 抗 體 夾 心 法 檢 測 人 血 清 中 層 粘 連 蛋 白 方 法 奠 定 了 物 質(zhì) 基 礎(chǔ) 。參 考 文 獻 TIMPL R , ROHDE H , ROBEY PG , et al.Laminin-aglycoprotein from basement membrance J . J Biol Chem , 1979, 254:9933- 9935.NIEMELA O , RISTELI L , SOTANIEMI EA , et al. Type collagen and laminin-related antigens in human serum in alcoholic liver disease J . Eur J Clin Invest , 1985, 15:132-137.KROPF J ,