實時熒光定量PCR [兼容模式]

1、實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR的原理和應用PCR(Polymerase Chain Reaction : 聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應是一種擴增特定的DNA片段的分子生物學技術, 能將微量的能將微量的DNA DNA DNA大量復制大量復制。 94 PCR分四個階段 qPCR 技術:qPCR技術是在PCR實驗方法的基礎上發(fā)展而來的技術,能夠對PCR擴增的目標DNA進行定量分析。具有靈敏度高、特異性強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點普通PCR技術:擴增目標DNA量,對目標DNA片段做定性分析,但無法準確得知目標DNA的含量優(yōu)點:實時監(jiān)

2、測、不需電泳、精確定量等qPCR 在PCR 的基礎上加入熒光染料或熒光探針,利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR 反應過程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。SYBR green 一、qPCR 定義定義、原理和常用熒光染料是目前最常用的熒光染料光染料,它能夠結合雙鏈狀態(tài)的DNA 分子,一旦結合就能夠發(fā)出熒光,但未結合DNA 的游離SYBR green 沒有任何熒光。SYBR green 熒光強度反映了當前樣品中的DNA 濃度 實時熒光擴增曲線圖 在指數增長期檢測熒光值:無法在同一時間點保證所有樣品都處在對數增長期閾值在指數增長期選擇一個熒光閾值,濃度高的樣品比濃度低的樣品先到達閾值為了定量

3、和比較的方便,在實時熒光定量PCR 技術中引入了幾個重要的概念:基線(Baseline:是指在PCR擴增反應的最初基線數個循環(huán)里,熒光信號變化不大。接近一條直線,這樣的直線即是基線。熒光閾值(thresholdC T:是在熒光擴增曲線熒光閾值上人為設定的一個值,它可以設定在熒光信號指數擴增階段任意位置上,一般熒光域值的設置是基線(背景熒光信號的標準偏差的10 倍。熒光域值是PCR的315個循環(huán)熒光信號標準差的10倍,熒光域值設定在PCR擴增的指數期。 閾值C T值C T值(cycle threshold:樣品熒光值到達閾值樣品熒光值到達閾值,所經歷的循環(huán)數C T值越小,樣品濃度越高 E:擴增效

4、率X0:起始DNA濃度 用已知濃度值的樣品(標準品作標準曲線,并測得CT值。由標準品的CT 值與濃度值(X可以得到方程式中的常數值 根據公式可以通過CT值計算出未知樣品的濃度。 二、Real-time PCR 方法應用絕對定量(Absolute Quantification,AQ病原體檢測轉基因食品檢測基因表達研究相對定量(Relative Quantification,RQ基因在不同組織中的表達差異藥物療效考核耐藥性研究絕對定量與相對定量的定義 絕對定量通過標準品定量絕對定量的標準樣品:已知拷貝數的質粒DNA,做系列稀釋。標準樣品的種類:含有和待測樣品相同擴增片段的克隆質粒含有和待測樣品相同

5、擴增片段的cDNAPCR的產物絕對定量絕對定量:從熒光到拷貝數 相對定量通過內標定量內標(Endogenous Control通常是-actin、GAPDH基因等看家基因在細胞中的表達量或在基因組中的拷貝數恒定,受環(huán)境因素影響小內標定量結果代表了樣本中所含細胞或基因組數量內標(內參照-校正模板在數量上的差異qPCR定量實驗是需要設定內參照的,排除用于檢測的樣品添加量的差異。在實際操作中,很多環(huán)節(jié)導致用于定量實驗的樣品添加量是不一樣的。細胞都會表達一種叫做管家基因的基因,它的特點是,無論什么組織,什么細胞,在何種狀態(tài)下,管家基因的表達量是恒定的。選用管家基因作為內參照,其含量正比于細胞數作為內參

6、照,統計數據時根據管家基因含量較正數據,就可以排除添加量的影響。常用的內參照:GAPDH, Actin, 18S-rRNA相對定量:參照因子Calibrator 相對定量分析方法1 2-Ct前提:目標序列和內參序列的擴增效率接近100%且偏差在5%以內1、用內參基因的CT值歸一目標基因的CT值:CT(test= CT (target,test -CT (ref,testCT(calibrator= CT (target, calibrator -CT (ref, calibrator 2、用校準樣本的CT值歸一試驗樣本的CT值:CT= CT(test -CT(calibrator3、計算表達水

7、平比率:2 CT=表達量的比值實例對照組實驗組 相對定量分析方法2:雙標準曲線法目標基因與內參基因擴增效率不同 待測樣品目的基因濃度待測樣品內參基因濃度F=對照樣品目的基因濃度對照樣品內參基因濃度一次qPCR實驗的分組設置對照組實驗組陽性對照已知必定能得到擴增曲線的樣品用于判斷實驗過程是否存在問題,排除假陰性陰性對照(空白對照不添加DNA模板,其余成分齊全用于排除污染等因素導致的假陽性三、熒光標記的種類非特異性熒光標記:SYBR Green特異性熒光標記:TaqMan,Molecular Beacon(分子信標法,Amplisensor(復合探針法1、SYBR Green 法 SYBR Green法優(yōu)缺點優(yōu)點:對DNA模板沒有選擇性適用于任何DNA使用方便-不必設計復雜探針非常靈敏便宜熔解曲線反應結束后設定一個升溫過程,然后慢慢把溫度降下來,因為不同DNA 片段的解鏈溫度不同,這時若PCR 產物純,則只會出現一個熒光峰,若有雜質,則會出現其他峰值,這是一個特異性檢測方法。驗證擴增產物特異性,防止引物的非特異性干擾定量檢測結果。 2、TaqMan探針法 TaqMan探針的工作原理 TaqMan法優(yōu)缺