固定化在合成化學工業(yè)及食品工業(yè)上之應(yīng)用

1、固定化在合成化學工業(yè)及食品工業(yè)上之應(yīng)用固定化酵素之微生物應(yīng)用概況固定化合物應(yīng)用年次胺基酸酵素DL-胺基酸之光學分割1969天冬酸(E. coli菌體)L-天冬酸之製造1973青黴素酸酵素6-胺基青黴素之製造1973葡萄糖異性化酵素高果糖漿之製造197374延胡索酸酵素(Brevibacterium ammoniagenes菌體)L-蘋果酸之製造1974天冬酸酵素L-天冬酸之製造1975乳糖酵素低乳糖奶之製造1977固定化酵素及固定化菌體之應(yīng)用現(xiàn)況應(yīng)用範圍應(yīng)用及研究現(xiàn)況發(fā)酵工業(yè)胺基酸、糖、核酸、有機酸、生物鹼等之生產(chǎn)食品工業(yè)乳糖之分解、乾乳酪、高果糖漿、轉(zhuǎn)化糖等之製造、牛奶或食品之殺菌、酒精飲料

2、之製造、果汁苦味之去除、包裝食品之除氧等?；瘜W工業(yè)酒精燃料、氫氣及甲烷氣體之製造、有機化合物之轉(zhuǎn)換等。分析氧電極法、微生物電極化、氧免疫測定法等之臨床檢查或種種化學分析之應(yīng)用、測定之自動化、迅速化、簡便化等。醫(yī)療臨床檢查、氧治療劑、人工臟器等。環(huán)境淨化酚、苯、氰化物、Caprolactam oligomer之分解、硝酸或亞硝酸之還原、BOD或氰化物之測定等。生化學氧反應(yīng)機構(gòu)、氧之機能或構(gòu)造之解析、採用親和力色層分析的生質(zhì)成份之分離、濃縮、精製等。微生物的酵素製劑酵素生產(chǎn)菌種用途液化amylaseBacillus subtilisB. amyloliquefaciensB. stearother

3、mophilusAspergillus orizae纖維除糊劑、酒醪液化、製造水飴或葡萄糖、食品加工、消化劑。糖化amylaseRhizopus delemar葡萄糖的製造CellulaseTrichoderma virideIrpex lacteusMost of Wood-decayed fungi穀物、蔬菜、果實加工、消化劑、飼料添加劑。InvertaseSaccharomyces cerevisiae製造轉(zhuǎn)化糖、防止食品中的糖結(jié)晶。LactaseSaccharomyces fragilis防止冰淇淋中乳糖的結(jié)晶Glucose oxidaseAspergillus nigerPenici

4、llium motatum除去食品中的氧氣、防止食品變質(zhì)。Glucose isomeraseStreptomyces albus果糖製造ProteaseAspergillus oryzaeAspergillus saitoiBacillus subtilisStreptomyces griseus消化劑、消炎劑、皮革工業(yè)、製麵包、除去啤酒或清酒之混濁、速釀味噌或醬油、食肉軟化劑、調(diào)味液的製造。PectinaseAspergillus nigerPenicillium sclerotiniaConithyrium diploidiella消化劑、milk flavor，羊皮洗淨、脂肪酸製造。Li

5、paseCandida cylindraceaCandida paralipolyticaRhizopus oryzae柑桔類之若味除去AsparaginaseEscherichia coli治療白血病、淋巴癌PenicillinaseBacillus cereusBacillus subtilisCheese的製造(除去牛乳中的penicillin)*一、 胺基酸1. DL-胺基酸之光學分割胺基酸之光學分割法有：物理化學法、化學法、生物學法、酵素法。其中酵素法係利用酵素特有的高光學特異性來進行光學分割之方法。在胺基酸結(jié)構(gòu)中，只有L-胺基酸可被人體吸收，而D-胺基酸則無法為人體所吸收，然而自然

6、界中大多數(shù)的胺基酸是以DL-形態(tài)存在。故利用胺基酸分解酵素 (ammino-acylase)在DL-胺基酸之N-醯基(acyl-bond)衍生物中，僅加水分解L-型的性質(zhì)，經(jīng)結(jié)晶後可以純化L-胺基酸，留下的D-胺基酸與N-醯基消旋化後，形成DL-胺基酸，可再被ammino-acylase作用形成L-胺基酸。如此進行連續(xù)化反應(yīng)便可大量製造L-胺基酸。將Aspergillus oryzae所生產(chǎn)的胺基酸水解酵素以吸附法、離子結(jié)合法、共價鍵結(jié)法、包覆法等固定化之後，使離子結(jié)合於DEAE-sephadex擔體中即可進行連續(xù)性固定化反應(yīng)，用來生產(chǎn)L-胺基酸。離子結(jié)合的ammino-acylase很穩(wěn)定及

7、安定，經(jīng)過一個月仍有68%以上的活性，即便失活亦可用NaOH處理擔體除去酵素，再重新添加新的酵素就可再度使用。DEAE-sephadex可使用兩年。Ammino-acylase因具有基質(zhì)特異性非常廣泛，固定化之後幾乎不會改變，固定化技術(shù)非常簡單，擔體可以重複使用，活性高，安定性良好等優(yōu)點，故在工業(yè)上至今仍被採用。擔體的使用上，以海藻多醣的龍角菜與DEAE-sephadex混合後，滴入0.1M KCl，則可獲得半衰期120天的固定化胺基酸水解酵素。本法不僅使用在胺基酸水解酵素的固定，亦可應(yīng)用於種種酵素及微生物菌體而獲得良好結(jié)果。2. L-胺基酸之合成化學合成或發(fā)酵所得之廉價化合物，若再經(jīng)固定化酵

8、素或菌體來合成附加價值高的產(chǎn)物，是極為有意義的生物化學工業(yè)與化學工業(yè)流程。以天冬酸(asparate)為例，探討L-胺基酸之固定化生產(chǎn)：aspartaseHOOCCH=CHCOOH + NH3 HOOCCH2C(NH3)HCOOH如下圖：L-天冬酸鹽常用做治療心臟及其他各種疾病之醫(yī)藥品外，也用做果汁之食品添加物，具甘味之縮胺酸原料或醫(yī)藥製造原料等。目前用polyacrylamide固定化菌體(E. coli)，在37下半衰期為120日，mass transfer(質(zhì)轉(zhuǎn))的效果極佳。此乃世界上最早利用固定化微生物做連續(xù)酵素反應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的實例。以L-丙胺酸(alanine)為例：L-alanin

9、e可供醫(yī)療藥品外，在食品工業(yè)上用做鮮味劑亦被廣泛採用。原料：Pseudomonus dacunhae之L-aspartic acid-4-decarboxylase批式生產(chǎn)。千田認為分別將含aspartase之E. coli及L-aspartic acid-4-decarboxylase之Pseudomonus dacunhae 個別菌體固定化之後再混合使用，由丁烯二酸與氨直接製造L-alanine，則必可提高產(chǎn)量。如下圖：固定化菌體之調(diào)製方法與生物反應(yīng)器有三種選擇：1. 將固定化之E. coli與Pseudomonus dacunhae分別充填於兩個反應(yīng)器中(如No.1)2. 將分別固定化的

10、二菌體充分混合在一個充填反應(yīng)器內(nèi)反應(yīng)。3. 先將二種菌先行混合後，再施以固定化在一個充填反應(yīng)器內(nèi)。其中以方法三的阻礙最大，而方法一在調(diào)整適當?shù)膒H值後效率最佳。下圖係利用上述方法加以工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)L-aspartic acid及L-analine之流程圖。二、糖類利用固定化酵素進行多醣、少醣及雙糖類等之加水分解，或者單糖之異構(gòu)化及氧化等之食品工業(yè)應(yīng)用例子很多，例如乳糖之加水分解，葡萄糖異構(gòu)化為果糖等。另外，由多醣類生產(chǎn)葡萄糖等之目的的工業(yè)化應(yīng)用亦有諸多例子，如下表即為一些應(yīng)用實例：表一、採用固定化酵素或固定化菌體之糖類轉(zhuǎn)換實例酵素、微生物固定化方法(擔體or載體)基質(zhì)生產(chǎn)物-amylase共

11、價鍵結(jié)合法、吸附法、包覆法、超薄濾膜法澱粉糊精-amylase共價鍵結(jié)合法、吸附法可溶性澱粉麥芽糖Glucosidase共價鍵結(jié)合法、離子結(jié)合法、吸附法、超薄濾膜法糊精、麥芽糖葡萄糖Cellulase吸附法、包覆法、超薄濾膜法纖維素葡萄糖Glucose transferase或含此酵素菌體共價鍵結(jié)合法、吸附法、離子結(jié)合法、包覆法、中空纖維素法蔗糖轉(zhuǎn)化糖(葡萄糖+果糖)-1,4-glucanase共價鍵結(jié)合法-葡聚糖Glucose-1-phosphate-glucosidase共價鍵結(jié)合法麥芽糖葡萄糖-glucosidase包覆法半纖維素葡萄糖-galactosidase共價鍵結(jié)合法、包覆法、微

12、膠囊法牛奶乳漿低乳糖奶甜味劑-galactosidase中空纖維素法半纖維糖葡萄糖&分解乳糖Glucose isomerase或含此酵素菌體共價鍵結(jié)合法、吸附法、離子結(jié)合法、包覆法、微膠囊法葡萄糖果糖Gluconobacter melanogenes包覆法(polyacrylamide)L-清涼茶糖L-清涼茶酸Gluconobacter melanogenes + Pseudomonus syringe包覆法(polyacrylamide)L-清涼茶糖2-keto-L-葡萄糖酸Acetobacter suboxydans包覆法(polyacrylamide)糖醇酮糖1. 多醣類及少醣類

13、之分解將多醣類加水酵素分解，而利用所生成之葡萄糖等單糖類做為食用或發(fā)酵原料，是資源有效利用重要的課題。主要是由澱粉生產(chǎn)，以替代蔗糖的甜味劑，如高果糖漿(HFCS, High Fructose Corn Syrup)或纖維素(或木質(zhì)素)製造葡萄糖等。由澱粉生產(chǎn)高果糖漿包括下列重要參與者：a. 由糖化菌(細菌或黴菌)糖化酵素液化澱粉成糊精。b. 由黑黴菌(Aspergillus niger)等之a(chǎn)mylo-glucosidase將之糖化成葡萄糖。c. 由glucose isomerase將葡萄糖轉(zhuǎn)化為果糖之異構(gòu)化。上圖為利用微生物酵素由葡萄糖造製異構(gòu)化果糖的生產(chǎn)流程圖其特點是改用木質(zhì)(xylan)

14、為原料，以培養(yǎng)高溫放線菌Streptomyces albus來生產(chǎn)異構(gòu)化酵素(isomerase)，具有菌體直接催化之特性，此法可將50%高濃度之葡萄糖液裝入異構(gòu)化反應(yīng)槽內(nèi)，經(jīng)攪拌(pH6.87.2, 6570)反應(yīng)約70小時，即可完成含40%葡萄糖及35%果糖，固形物75%之糖液。不但甜份高，且由玉米澱粉製造時，成本較砂糖為低。由於此法成功製造出甜度高之糖液，創(chuàng)新了異構(gòu)化糖工業(yè)，逐漸替代傳統(tǒng)之製糖工業(yè)。這也是為什麼臺糖甘蔗製糖逐漸式微之原因。近年來，如澱粉等高分子基質(zhì)之分解，利用固定化酵素有效地加以分解，亦有工業(yè)化的趨勢，為此目的，利用超微細過濾膜反應(yīng)器，亦即裝填酵素(如-amylase)於

15、反應(yīng)器中，連續(xù)送入澱粉溶液，可連續(xù)取出葡萄糖。此時因為如酵素(蛋白質(zhì))或澱粉等高分子化合物無法透過超微細過濾膜，只有小分子如葡萄糖等可以過膜，所以不但製品的純度提高，且亦不會引起雜菌的污染。如此，所製得的葡萄糖可以直接用於製造葡萄糖液或再經(jīng)異構(gòu)化酵素製成果糖液，或作為發(fā)酵原料。採同樣的方法可以製成其他產(chǎn)品，如maltose, malto-triose等等。超微細過濾膜的操作比較簡單，故具有分解各種高分子物質(zhì)的優(yōu)點，此時選用膜孔直徑大小、溫度、基質(zhì)的滯留時間等條件，可改變生成物的種類。2. 雙糖之分解雙糖分解中，以將蔗糖分解為葡萄糖與果糖的轉(zhuǎn)化酵素(invertase)，以及將乳糖分解成葡萄糖及

16、半乳糖的乳糖分解酵素(lactase)研究最多。 固定化轉(zhuǎn)化酵素或含轉(zhuǎn)化酵素的菌體的固定方法很多，固定化酵素的方法有：共價鍵 結(jié)合法、吸附法、離子結(jié)合法、包覆法、微膠囊法、中空纖維法、超微細薄膜過濾法等；而固定化菌體則常用吸附法、離子結(jié)合法、包覆法等。(Sucrose = glucose + fructose)(Lactose=glucose + galactose)乳糖分解酵素應(yīng)用於工業(yè)上有兩個目的：一為提供不能消化乳糖(lactose)的人飲用牛奶(低乳糖奶)；二為製造乾酪(cheese)時，生成的乳清(whey)中萃取蛋白後，將殘留廢液(含乳糖)轉(zhuǎn)換為食品製造使用可能的甜味劑。3. 單糖

17、類之異構(gòu)化單糖類的轉(zhuǎn)化最有名的例子為將葡萄糖轉(zhuǎn)化為果糖，其他則因特殊目的產(chǎn)物而使用不同固定化酵素種類而定，例如利用固定化菌體(Gluconobacter melanogenes與Pseudomonus sp.)L-清涼茶糖(L-sorbose)轉(zhuǎn)化為2-酮基葡萄糖酸(2-keto-glucuronic acid)(見表)。三、有機酸一些有機酸利用固定化酵素或固定化菌體生產(chǎn)，但其中由丁烯二酸(succinic acid)生合成L-蘋果酸已工業(yè)化。HOOC-CH2=CH2-COOH + H2O HOOC-CH2-C(OH)HCOOH(Brevibacterium ammoniagenes 生產(chǎn)fu

18、marase來反應(yīng))酵素菌體固定化法基質(zhì)生成物Fumarase包覆法(cellulose-ethylacyl-cellulose)丁烯二酸L-蘋果酸Brevibacterium ammoniagenes包覆法(龍角菜、polyacrylamide)丁烯二酸 L-蘋果酸L-amino-oxidase共價鍵結(jié)合法、吸附法L-amino acid-keto acidLactobacillus delbreuckii超微細過濾膜法葡萄糖乳酸四、抗生物質(zhì)(抗生素)抗生物質(zhì)(antibiotics)一文係由發(fā)現(xiàn)鏈黴素(streptomycin)的學者Walksman S. A. (1924)所提出的，其定

19、義是由生物，尤其是微生物所生產(chǎn)的物質(zhì)，阻止其他微生物以及其他活細胞(癌細胞等)機能之物質(zhì)。同時培養(yǎng)二種類的微生物時，任一方的生長受到阻止時叫拮抗現(xiàn)象(antigonism)。1877Pasteur發(fā)現(xiàn)一種好氣性菌能抑制炭疽菌(B. anthracis)的生長。1929Fleming(英)首先發(fā)現(xiàn)penicillin，他發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)在洋菜平板上葡萄球菌被青黴菌(Penicillium notatum)污染而受到抑制1940英國化學家Florey & Chain成功地使penicillin結(jié)晶化。1941美英共同開始研究大量生產(chǎn)的方法，次年採用表面培養(yǎng)法製造。1943開始使用tank培養(yǎng)法量產(chǎn)

20、，此乃抗生物質(zhì)工業(yè)化的開始。1944Walksman發(fā)現(xiàn)streptomycin對結(jié)核菌有抑制效果。至今約有2000種以上的抗生素被發(fā)現(xiàn)，但實際應(yīng)用的約100餘種而已?？股镔|(zhì)的用途在醫(yī)藥(anticancer, antivirus, antibacterium)、農(nóng)藥(fungiside, antibacterium, 如blastocidin S & Kasugamycin對稻熱病有效)、飼料中作為動物生長促進劑、生化方面如細菌細胞壁合成阻害物質(zhì)(如penicillin)、蛋白質(zhì)合成阻害物質(zhì)(如chloramphenicol)、核酸阻害劑(actinomycin D, mitomy

21、cin C)等?？股镔|(zhì)研究法菌種分離抗菌性試驗藥理試驗中間工業(yè)試驗1. 菌種之isolation & screening分離源一般為土壤，因其每克土壤至少含有109個細菌、108個放線菌及107個黴菌，但其他基質(zhì)亦有相當龐大的生物多樣性供分離。將分離出來的菌種以液體振盪培養(yǎng)，再以paper disc方法做double layers抗菌性test，所獲得之抑制圈大小即可知道其抗菌力強弱。2. 生成抗生物質(zhì)的分離篩選到具較強抗生活性之生產(chǎn)菌株時，其發(fā)酵液再以各種溶媒(通常八種以上)，跑PC (paper chromatography)或TLC (thin layer chromatography)使物質(zhì)充分展開後，烘乾，貼在含有供試菌的洋菜培養(yǎng)上，使分離的物質(zhì)擴散到培養(yǎng)基上，放置1020分鐘，再除去濾紙或TLC板，於供試菌適合生長的溫度下培養(yǎng)1224小時，若有抗生物質(zhì)存在時，則呈透明區(qū)，測定其Rf值，必要時做純化結(jié)晶。3. 藥理試驗萃取純化抗生物質(zhì)，進行口服、靜脈注射、皮下注射等動物的毒理試驗。培養(yǎng)液(或萃取後的廢料需要流放時，則再做魚類的毒性試驗。最後都無毒性時 ，則進入人體臨床試驗。4. 抗生物質(zhì)的鑑定做藥理試驗的同時，可一方面從事物質(zhì)純化與分子式結(jié)構(gòu)式的分析。HPLC: 分離物質(zhì)(fractions)。IR: 判別官能基。GC-