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文檔簡(jiǎn)介

1、質(zhì)粒DNA的小量制備、電泳檢測(cè)及細(xì)菌轉(zhuǎn)化. 質(zhì)粒DNA的小量制備一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)并掌握質(zhì)粒的小量制備技術(shù)。二 實(shí)驗(yàn)材料和用具菌種:E.coli DH5a/pUC19培養(yǎng)基:LB:Tryptone 1%,Yeast Extract 0.5%,NaCl 1%,pH7.2(Agar 2%);120滅菌20min。D0001碧云天質(zhì)粒小量抽提試劑盒(或其它公司的產(chǎn)品)恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、超凈工作臺(tái)、臺(tái)式高速離心機(jī)、臺(tái)式小型振蕩儀、 EP管(Eppendorf管,1.5ml微量離心管)、加樣器、吸頭等。三 原理實(shí)驗(yàn)采用國(guó)產(chǎn)的質(zhì)粒小量抽提試劑盒。它是一種新型的離子交換柱,在特定的條件下,使質(zhì)粒能在離心過(guò)

2、柱的瞬間,結(jié)合到質(zhì)粒純化柱上,在一定條件下又能將質(zhì)粒充分洗脫,從而實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒的快速純化。而且在提取過(guò)程中,無(wú)需酚-氯仿抽提、無(wú)需酒精沉淀,可在較短時(shí)間內(nèi)完成質(zhì)粒的提取和純化。四 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1. 細(xì)菌培養(yǎng)及菌體的收獲。2. 用試劑盒進(jìn)行小量質(zhì)粒制備。五 實(shí)驗(yàn)步驟1. 將E.coli菌株接種到液體LB培養(yǎng)基中,加入氨芐青霉素至 100mg/ml,150rpm振蕩16h;3000rpm室溫下離心2min。倒掉上清,然后倒置于吸水紙上,使液體流盡;3. 加入150ml溶液,vortex或彈起沉淀,使完全散開(kāi),無(wú)絮塊。4. 加入200ml溶液,顛倒離心管68次,使細(xì)菌完全裂解,溶液透明,注意不能振蕩;5.

3、加入500ml溶液,顛倒68次,可見(jiàn)白色絮狀物產(chǎn)生;6. 13000rpm離心10min。離心時(shí)準(zhǔn)備好質(zhì)粒純化柱及最后的質(zhì)粒收集管;7. 直接將上清液倒入質(zhì)粒純化柱,13000rpm離心1min,使質(zhì)粒結(jié)合于純化柱上;8. 倒棄收集管內(nèi)的液體,在質(zhì)粒純化柱內(nèi)加入750ml溶液,13000rpm離心1min,洗去雜質(zhì);9. 倒棄收集管內(nèi)液體,13000rpm離心1min,除去殘留液體;10. 將質(zhì)粒純化柱放在質(zhì)粒收集管上,加50ul溶液至管內(nèi)柱面上,放置1min;11. 13000rpm離心1min,所得液體就是質(zhì)粒。質(zhì)粒于-20冰箱保藏備用。六 注意事項(xiàng)1. 在使用前,在溶液(洗滌液)加入40

4、ml無(wú)水乙醇或43ml95%乙醇,然后在瓶蓋上作好記號(hào)。2. 溶液在溫度較低時(shí),可能會(huì)產(chǎn)生沉淀,需先用水浴加熱溶解,混勻后再使用。溶液易被空氣中的CO2酸化,用完后應(yīng)立即蓋緊瓶蓋。七 思考題1. 加入溶液后,為什么不能劇烈振蕩?附錄一:pUC19圖譜. 質(zhì)粒DNA的電泳檢測(cè)一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)并掌握瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的技術(shù)。二 實(shí)驗(yàn)材料瓊脂糖,TAE緩沖液,加樣緩沖液,溴化乙錠(EB),標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker電泳儀、穩(wěn)壓電源、凝膠電泳成像儀等三 實(shí)驗(yàn)原理 瓊脂糖電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳是分離、鑒定和純化DNA片段的有效方法。瓊脂糖凝膠的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝膠低,但其分離范圍較廣。用各種濃

5、度的瓊脂糖凝膠可分離長(zhǎng)度200bp50kb的DNA.。瓊脂糖凝膠通常采用水平裝置在強(qiáng)度和方向恒定的電場(chǎng)下電泳。直接用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙錠進(jìn)行染色,可確定DNA在凝膠中的位置。四 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容對(duì)所提取的質(zhì)粒DNA樣品進(jìn)行電泳檢測(cè)。五 實(shí)驗(yàn)步驟1. 制膠(見(jiàn)圖3)(1) 膠模兩端用膠帶封嚴(yán),架好梳子備用;(2) 稱(chēng)取0.2g的瓊脂糖于100ml燒杯中,加入20mlTAE,加熱熔化至無(wú)顆粒狀瓊脂糖,冷卻到60左右加入EB(終濃度0.5mg/ml),搖勻,即倒入膠模中凝固30min以上;(3) 臨用前,撕去封口膠帶,放入電泳槽中,倒入適量的電泳緩沖液TAE(淹過(guò)膠面),拔取梳子備用。2. 樣品準(zhǔn)備

6、取已提取好的質(zhì)粒DNA 5ml于500ml指管中,加入1ml的加樣緩沖液,混勻;3. 電泳(1) 將樣品和5ml標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量分別點(diǎn)樣到梳孔中;(2) 恒壓50v,電泳60分鐘左右;(3) 電泳結(jié)束后關(guān)閉電源,取出凝膠,用凝膠成像儀進(jìn)行攝影和記錄。圖3 灌制水平瓊脂糖凝膠 六 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 將質(zhì)粒DNA條帶與DNA MW Marker進(jìn)行比對(duì),對(duì)質(zhì)粒提取結(jié)果進(jìn)行分析。七 注意事項(xiàng)溴化乙錠是強(qiáng)誘變劑,并有中度毒性,取用含有這一染料的溶液時(shí)務(wù)必戴上手套,這些溶液經(jīng)使用后應(yīng)按下面介紹的方法進(jìn)行凈化處理。附錄一溴化乙錠稀溶液的處理(適用于含有0.5mg/ml的溴化乙錠的電泳緩沖液)方法一1. 每100ml溶

7、液中加入2.9g Amberlite XAD-16,這是一種非離子型多聚吸附劑,可向Rohm & Haas公司購(gòu)置;2. 于室溫放置12小時(shí),不時(shí)搖動(dòng);3. 用Whatman 1濾紙過(guò)濾溶液,丟棄濾液;4. 用塑料袋封裝濾紙和Amberlite 樹(shù)脂,作為有害廢物予以丟棄。方法二1. 每100ml溶液中加入100mg粉狀活性炭;2. 于室溫放置1小時(shí),不時(shí)搖動(dòng);3. 用Whatman 1號(hào)濾紙過(guò)濾溶液,丟棄濾液;4. 用塑料袋封裝濾紙和活性炭,作為有害廢物予以丟棄。附錄二 1. 電泳緩沖液Tris-乙酸(TAE):0.04mol/L Tris-乙酸,0.001mol/L EDTA。濃儲(chǔ)

8、藏液液(50×TAE):每升含有242g Tris堿,57.1ml 冰乙酸,10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)2. 0.5mol/L EDTA(pH8.0)在80ml蒸餾水中加入18.61g EDTA-Na·2H2O,在磁力攪拌器上劇烈攪拌,用NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0,然后定容至1000ml,分裝后滅菌備用。 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)并掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及外源基因?qū)爰?xì)胞的技術(shù)。二 實(shí)驗(yàn)材料和用具菌種:E.coli DH5a;質(zhì)粒:pUC19;培養(yǎng)基:LB:1. LB液體試管:5ml/管;2. LB液體三角瓶:20ml/250ml

9、三角瓶;3. LB+Amp平板:Ampicillin 加量100mg/ml;器材:恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、離心機(jī)、超凈工作臺(tái)、高壓蒸汽滅菌鍋、涂布棒、EP管、可調(diào)移液器、吸頭等。三 實(shí)驗(yàn)原理轉(zhuǎn)化活性是檢測(cè)質(zhì)粒生物活性的重要指標(biāo)。用于轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞一般是限制-修飾系統(tǒng)缺陷的變異株,以防止對(duì)外源DNA的切割。質(zhì)粒能否進(jìn)入受體細(xì)胞取決于該細(xì)胞是否處于容易吸收外源DNA的感受態(tài)。細(xì)胞的感受態(tài)可以通過(guò)理化因素誘導(dǎo)產(chǎn)生。大腸桿菌是常用的受體菌,其感受態(tài)一般是通過(guò)用CaCl2在0條件下處理細(xì)胞而形成。細(xì)胞處于0的CaCl2低滲溶液中,會(huì)膨脹成球形,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變,轉(zhuǎn)化混合物中的質(zhì)粒DNA形成抗Dnas

10、e的羥基-鈣磷酸復(fù)合粘附于細(xì)胞表面,經(jīng)42短時(shí)間熱激處理,促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物,在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)數(shù)小時(shí)后,球形細(xì)胞復(fù)原并增殖,在選擇培養(yǎng)基上便可獲得所需的轉(zhuǎn)化子。四 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1. 制備E.coli DH5a的感受態(tài)細(xì)胞;2. 進(jìn)行質(zhì)粒pUC19的轉(zhuǎn)化五 操作步驟1. 菌種在LB液體培養(yǎng)基中活化,37,150rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜;2. 轉(zhuǎn)接到新鮮LB液體培養(yǎng)基中,接種量5%;3. 37,150rpm培養(yǎng)至OD600=0.20.25;4. 將培養(yǎng)液放入冰浴冷卻10min;5. 取1.5ml培養(yǎng)液于6500rpm離心5min,棄上清液;6. 加0.75ml冰冷CaCl2溶液(50mmol/LCaCl2,10mmol/L Tris,pH8.0),用混勻器混勻或用手指彈離心管混勻;7. 將離心管置于冰浴45min;8. 6500rpm 5min離心收集細(xì)胞;9. 將細(xì)胞小心懸浮于0.1ml冰冷CaCl2溶液中(用移液器小心混勻);10. 加1ml質(zhì)粒,小心混勻,置冰浴45min;11. 將離心管置于42恒溫水浴熱處理2min(準(zhǔn)確?。?2. 加1ml

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