腦缺血再灌注后大鼠血腦屏障通透性的免疫組織化學(xué)研究

1、    腦缺血再灌注后大鼠血腦屏障通透性 的免疫組織化學(xué)研究        摘要目的：研究腦缺血再灌注后大鼠血腦屏障（BBB）通透性改變。方法：采用線栓法大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞的局灶性腦缺血模型，缺血1 h后再灌注，分別于再灌注后0 h、3 h、5 h、12 h、及24 h，采用免疫組織化學(xué)SABC法，觀察內(nèi)源性免疫球蛋白G（IgG）在腦組織中的表達(dá)。結(jié)果：再灌注0 h、3 h時(shí)，腦組織中未見IgG的表達(dá)。再灌注5 h時(shí)，缺血側(cè)大腦半球紋狀體有局灶性的IgG表達(dá)。再灌注

2、12 h 時(shí)，缺血側(cè)紋狀體及新皮層可見有廣泛的IgG的表達(dá)。再灌注24 h時(shí)，表達(dá)更加明顯。結(jié)論：缺血1 h再灌注35 h時(shí)，BBB開始受損開放，通透性增加。紋狀體的BBB較新皮層更易受損。再灌注12 h、24 h，外滲的血清蛋白累積增加。主題詞血腦屏障；腦缺血；再灌注；免疫組織化學(xué)中分類號R392.32文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號1000-4718(2000)08-0755-02MeSH Blood-brain barrier; Cerebral ischemia; Reperfusion; Immunohistochemistry 腦水腫是腦缺血后主要的病理變化之一。腦缺血再灌注過程中亦可發(fā)生嚴(yán)重

3、的腦水腫。缺血引起的腦水腫包括細(xì)胞毒性水腫和血管源性水腫，后者是由于BBB受損，通透性增加，血清蛋白外滲所致?？梢姡芯緽BB通透性對血管源性腦水腫的防治具有重要意義。目前，對腦缺血超早期再灌注后BBB通透性的研究，國內(nèi)外的報(bào)道甚少。我們采用免疫組織化學(xué)的方法對大鼠局灶性腦缺血1h再灌注后不同時(shí)期的BBB通透性進(jìn)行研究。材料和方法一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組健康雄性Wistar 大鼠42只，體重為250350 g,由同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為腦缺血1 h再灌注0 h組、3 h組、5 h組、12 h組、24 h組及假手術(shù)組，每組7只大鼠。二、腦缺血再灌注動(dòng)物模型的復(fù)制：參照Nagasawa等1的

4、方法并進(jìn)行改動(dòng)。大鼠用10%水合氯醛麻醉（35 mg/100 g體重ip），頸正中切開，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）、頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎ECA近端，結(jié)扎CCA，在近CCA與ECA交叉處剪一小口，插入栓線（栓線是4-0尼龍線，其頭端5 mm涂有固體石蠟，直徑為0.26 mm），緩慢向ICA插入，插入深度為1721 mm，在ICA根部結(jié)扎。從ICA抽出栓線即可造成再灌注。假手術(shù)組只結(jié)扎左側(cè)的ICA、ECA，不插栓線。三、 組織切片的制備分別于再灌注后0 h、3 h、5 h、12 h、24 h，再次麻醉大鼠，經(jīng)升主動(dòng)脈灌注4多聚甲醛（用磷酸緩沖液，pH7.4配制），取腦，于上述固定液內(nèi)

5、后固定24 h 。常規(guī)酒精系列脫水、二甲苯透明、浸蠟和石蠟包埋。切成4 m厚的石蠟切片。四、 免疫組織化學(xué)染色以免疫組織化學(xué)SABC法對切片標(biāo)本進(jìn)行染色。生物素化羊抗大鼠IgG及SABC Kit 均購自武漢Boster生物工程有限公司。生物素化羊抗大鼠IgG使用效價(jià)為1100，染色步驟按說明書進(jìn)行，設(shè)立替代對照試驗(yàn)。五、 免疫組織化學(xué)染色分級標(biāo)準(zhǔn)參照Akiguchi等2的方法進(jìn)行分級。0級：未見染色；1 級：神經(jīng)纖維網(wǎng)可見染色；2級：神經(jīng)纖維網(wǎng)及120個(gè)神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞胞體有染色（×200）；3級：神經(jīng)纖維網(wǎng)及多于20個(gè)神經(jīng)細(xì)胞或膠質(zhì)細(xì)胞胞體有染色（×200）。對每組

6、大鼠腦片的缺血側(cè)均勻地觀察7個(gè)視野進(jìn)行分級評分，取其平均值。六、 數(shù)據(jù)分析方法數(shù)據(jù)以±s表示，組間均數(shù)差異顯著性采用t檢驗(yàn)判定。結(jié)果一、 免疫組織化學(xué)染色假手術(shù)組、再灌注0 h組及再灌注3 h組腦組織中未見有IgG的表達(dá)。再灌注5 h組缺血側(cè)紋狀體可見有局灶性的IgG表達(dá)，神經(jīng)纖維網(wǎng)呈棕褐色染色，神經(jīng)細(xì)胞的胞漿內(nèi)未見染色。再灌注12 h組和24 h組在缺血側(cè)紋狀體及新皮層有廣泛的IgG表達(dá)，神經(jīng)纖維網(wǎng)有更加明顯的染色，眾多的神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的胞漿內(nèi)可見顆粒狀棕褐色染色。再灌注24 h組比12 h組更加明顯。二、 IgG染色分級評分結(jié)果分析再灌注5 h組IgG染色分級評分與再灌注0

7、h、3 h及假手術(shù)組相比具有顯著差異（P0.05）。再灌注12 h組、24 h組與再灌注0 h、3 h及假手術(shù)組相比有非常顯著差異（P0.01）。再灌注12 h組、24 h組與再灌注5 h組相比具有非常顯著差異（P0.01）。表1IgG染色分級評分Tab 1 Grading score for IgG (±s, n=42)GroupAfter the reperfusion0h3h 5h12h 24hReperfusion0 0 0.43±0.122.15±1.06* 2.62±1.13*Sham-operated 0 P0.05， P0.01，vs 0

8、 h group，3 h group and sham-operated group； * P0.01，vs 5 h group 討論腦缺血再灌注損傷是目前國內(nèi)外研究的重點(diǎn)課題之一。為此，建立了各種腦缺血再灌注模型。我們曾采用MRI及TTC染色的方法對改進(jìn)的腦缺血再灌注模型進(jìn)行了研究，證明了模型復(fù)制的可靠性3。腦缺血再灌注后BBB會(huì)受到損傷，導(dǎo)致通透性增加。血清蛋白不能通透完整的BBB，如果腦組織中有外滲的血清蛋白，即說明BBB受到破壞，通透性增加。IgG是一種內(nèi)源性的血清蛋白，通過IgG在腦組織中的免疫組織化學(xué)染色可反映BBB的通透性。目前常用來研究BBB通透性的方法有同位素標(biāo)記的方法、影像

9、學(xué)方法（如增強(qiáng)MRI）、酶組織化學(xué)的方法等。同位素標(biāo)記的方法可精確定量的反映BBB的通透性，但存在放射性及價(jià)格較貴。影像學(xué)方法可在活體進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察BBB的通透性，但較難發(fā)現(xiàn)輕微的BBB通透性改變。酶組織化學(xué)的方法反映BBB通透性的同時(shí)，還能進(jìn)行組織細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察，但靈敏度不及免疫組織化學(xué)的方法。用免疫組織化學(xué)的方法評價(jià)BBB通透性，不僅可以了解血清蛋白從微血管內(nèi)外滲的情況，而且能進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察?？梢院芎玫胤从持钡絼?dòng)物被處死之前外滲的血清蛋白的累積情況。本結(jié)果發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組、再灌注0 h組及3 h組均未見有IgG表達(dá)。而再灌注5 h組，在缺血側(cè)紋狀體可見有染色。說明在缺血1 h再灌注35 h時(shí)

10、，BBB受到破壞，通透性增加，血清蛋白開始從微血管滲出。同時(shí)也說明紋狀體是再灌注期間BBB首先遭受破壞的區(qū)域。Ohtomo等4的研究表明，丘腦的外側(cè)是缺血再灌注后BBB最先受到破壞的區(qū)域。Albayrak等5采用同位素標(biāo)記的方法對局灶性腦缺血后BBB通透性進(jìn)行了研究，其結(jié)果表明紋狀體區(qū)的BBB最先受到破壞。這與我們的研究結(jié)果是一致的。BBB在這個(gè)區(qū)域更容易受到破壞的原因還不太清楚?？赡苁怯捎诩y狀體側(cè)支循環(huán)比較少，因此抵抗缺血性損傷的能力就比較弱。我們研究還發(fā)現(xiàn)，在再灌注12 h時(shí)，整個(gè)缺血側(cè)大腦半球可見IgG表達(dá)，再灌注24 h時(shí)，表達(dá)更加明顯。這說明外滲的血清蛋白存在著累積增多。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)大

11、量的神經(jīng)細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞的胞漿中可見顆粒狀的棕褐色染色，這說明缺血性損傷比較嚴(yán)重。我們雖然只對IgG的漏出進(jìn)行了研究，但在缺血性腦水腫時(shí)，IgG漏出的分布與其它血清蛋白是一致的6。故通過IgG外滲的情況可以反映整個(gè)血清蛋白外滲的情況?？梢?，通過IgG在微血管外的表達(dá)，可以反映BBB的通透性。我們的研究結(jié)果表明，在腦缺血1 h再灌注后35 h，BBB通透性開始增加。紋狀體區(qū)的BBB較易受到破壞。王耀明（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西 南寧 530021）莫雪安（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西 南寧 530021）童萼塘（同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 湖北 武漢 430030）

12、方瑗（同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 湖北 武漢 430030）參考文獻(xiàn)1Nagasawa H,Kogura K.Correlation between cerebral blood flow and histologic changes in a new rat model of middle cerebral artery occlusionJ.Stroke,1989,20:10371043.2Akiguchi I,Tomimoto H,Suenaga T,et al.Blood-brain barrier dysfunction in Binswanger's disease

13、;an immunohistochemical studyJ. Acta Neuropathol,1998,95:7884.3王耀明，童萼塘，肖學(xué)宏.MRI評價(jià)改進(jìn)的大鼠可逆性局灶性腦缺血模型J. 卒中與神經(jīng)疾病，1999,6:171173. 4Ohtomo H,Hatakeyama T,Matsumoto M,et al.Postischemic damage in the gerbil brain after brief carotid occlusion:Correlation of cerebral blood flow and immunohistochemical findingsJ.J Cereb Blood Flow Metab,1987,7:S110S116.5Albayrak S,Zhao Q,Siesjo BK.Effect of transient focal ischemia blood-brain barrier permeability in the rat:correlation to cell injuryJ.Acta Neuropathol,1997,94:158163.6Scmidt K,Szymas