糖胺聚糖對(duì)受刺激內(nèi)皮細(xì)胞組織因子和凝血酶調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)的影響_第1頁(yè)
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1、    糖胺聚糖對(duì)受刺激內(nèi)皮細(xì)胞組織因子 和凝血酶調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)的影響        【摘要】目的研究由玉足海參提取的糖胺聚糖(GAG)抗血栓形成作用的機(jī)制。方法分別用1mg/L、5mg/L、10mg/L的GAG和5mg/L 肝素與經(jīng)1mg/L細(xì)菌脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞孵育,6h后觀察內(nèi)皮細(xì)胞的促凝活性、組織因子(TF)和凝血酶調(diào)節(jié)蛋白(TM)抗原的表達(dá)及TF和TM mRNA轉(zhuǎn)錄的變化。結(jié)果GAG降低受刺激內(nèi)皮細(xì)胞的促凝活性、TF抗原的表達(dá)和TF mR

2、NA的轉(zhuǎn)錄,升高TM抗原的表達(dá)和TM mRNA的轉(zhuǎn)錄。結(jié)論下調(diào)受刺激內(nèi)皮細(xì)胞TF表達(dá)的同時(shí)上調(diào)TM表達(dá)可能是GAG發(fā)揮抗血栓形成作用的主要機(jī)制之一?!娟P(guān)鍵詞】糖胺聚糖;內(nèi)皮細(xì)胞;凝血酶致活酶;組織因子;凝血酶調(diào)節(jié)蛋白;肝素 Effects of holothuria glycosaminoglycan on the expression of tissue factor and thrombomodulin in stimulated endothelial cellsLI Zhiguang,WANG Xuefeng,WANG Hongli,et al.Shanghai Institute o

3、f Hematology,Ruijin Hospital,Shanghai Second Medical University,Shanghai200025,China【Abstract】ObjectiveTo study the mechanism of antithrombotic effects of holothuria glycosaminoglycan(GAG).MethodsEndothelial cells from human umbilical vein which were pre-induced with 1mg/L lipopolysaccharide,were tr

4、eated by GAG(1mg/L,5mg/L,and 10mg/L,respectively)and 5mg/L heparin as a control for 6 hours.Procoagulant activity(PCA),the expressions of tissue factor(TF) antigen and thrombomodulin(TM) antigen and their mRNA transcriptions were investigated.ResultsGAG could down-regulate the expression of TF antig

5、en and mRNA,up-regulate the expression of TM antigen and mRNA,down-regulate the PCA of stimulated endothelial cells.ConclusionDown-regulating TF expression and up-regulating TM expression of stimulated endothelial cells may be one of the mechanisms of GAG antithrombosis.【Key words】Glycosaminoglycan;

6、Endothelial cells;Thromboplastin;Tissue factor;Thrombomodulin;Heparin海參糖胺聚糖(holothuria glycosaminoglycan, GAG)是從玉足海參體壁中提取的一種含巖藻糖(L-fucose)的糖胺聚糖。經(jīng)臨床和實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),GAG具有抗凝、降低血粘度、降低血脂等作用1-3,但對(duì)其作用機(jī)制了解甚少。在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面存在兩類調(diào)節(jié)血液凝固的細(xì)胞成分,主要是抗凝成分凝血酶調(diào)節(jié)蛋白(thrombomodulin,TM)和促凝成分的組織因子(tissue factor,TF)。炎癥介質(zhì)如內(nèi)毒素、腫瘤壞死因子(TNF)、

7、白細(xì)胞介素1(IL-1)可抑制TM表達(dá),增高TF表達(dá)4,5。為了闡明GAG抗血栓形成的作用機(jī)制,我們研究了GAG對(duì)經(jīng)細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)TF和TM表達(dá)的影響。材料和方法1細(xì)胞培養(yǎng)按Jaffe等的方法6制備人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,用1g/L膠原酶(Sigma公司產(chǎn)品)消化臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,將3×105細(xì)胞濃度的細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板,經(jīng)34d的培養(yǎng),在倒置顯微鏡下觀察接種的內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)至完全融合后用于實(shí)驗(yàn)。將培養(yǎng)的HUVECs分為6個(gè)實(shí)驗(yàn)組

8、:對(duì)照組:對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞不經(jīng)任何處理;LPS誘導(dǎo)組:向細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)加入LPS至終濃度1mg/L;肝素組:向培養(yǎng)液內(nèi)同時(shí)加入LPS和肝素(上海生化制藥廠),使終濃度分別為1mg/L和5mg/L;LPS加1mg/L GAG組:向培養(yǎng)液內(nèi)同時(shí)加入LPS和GAG(江蘇省常州華利康海洋生物有限公司提供),使它們的終濃度均為1mg/L;LPS加5mg/L GAG組:向培養(yǎng)液內(nèi)同時(shí)加入LPS和GAG,使終濃度分別為1mg/L和5mg/L;LPS加10mg/L GAG組:向培養(yǎng)液內(nèi)同時(shí)加入LPS和GAG,使終濃度分別為1mg/L和10mg/L。培養(yǎng)6h后檢測(cè)。2HUVECs促凝活性(PCA)的檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后

9、,將培養(yǎng)板置于冰上,棄去培養(yǎng)液,然后用冰預(yù)冷的磷酸緩沖液(PBS,pH 7.4)洗細(xì)胞3次,利用細(xì)胞刮板將每孔的細(xì)胞收集于500l冰預(yù)冷的PBS中,以12000×g、4 離心20min,用50l冰預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞。以此細(xì)胞懸液加等體積正常人混合血漿于37孵育180s后,加50l 0.05mol/L CaCl2結(jié)果1GAG對(duì)HUVECs的PCA的影響經(jīng)1mg/L LPS刺激后,HUVECs的PCA增高近3倍。與LPS誘導(dǎo)組相比,用1mg/L和10mg/L的GAG與LPS同時(shí)處理內(nèi)皮細(xì)胞,其PCA有所下降,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。5mg/L GAG和5mg/L肝素與

10、LPS共同處理HUVECs,其PCA與LPS刺激組相比顯著下降(P<0.05)(見(jiàn)表1)。表1GAG對(duì)HUVECs PCA、TF:Ag和TM:Ag表達(dá)的影響組別nPCA (U/孔)TFAg(pg/mg細(xì)胞蛋白)TMAg(ng/mg細(xì)胞蛋白)對(duì)照組21.19±0.144033.31±157.981631.70±31.88LPS誘導(dǎo)組33.12±0.4114829.27±754.47669.41±51.25肝素組31.87±0.02*8899.43±233.72#1254.20±79.03#LPS加1m

11、g/L GAG組31.94±0.3312673.01±668.84*1161.74±15.49LPS加5mg/L GAG組31.68±0.05*7418.59±239.99#1787.84±82.62#LPS加10mg/L GAG組32.38±0.309021.37±716.57#1391.84±25.53#     注:與LPS誘導(dǎo)組相比,*P<0.05;P<0.005;#P<0.0012GAG對(duì)HUVECs的TFAg和TMAg表達(dá)的影響經(jīng)LPS

12、刺激后,HUVECs的TFAg表達(dá)顯著增高(P<0.001),TMAg表達(dá)顯著下降(P<0.001)。分別用5mg/L肝素,1mg/L 、5mg/L、10mg/L的GAG和LPS共同處理內(nèi)皮細(xì)胞時(shí),與LPS誘導(dǎo)組相比TFAg表達(dá)都明顯下降(P分別<0.001,<0.05,<0.001,<0.001),TMAg表達(dá)顯著升高(P分別<0.01,<0.005,<0.001,<0.001)。其中LPS加5mg/L GAG 組與肝素組和LPS加1mg/L GAG組相比TFAg水平亦有顯著下降(P<0.005)。LPS加5mg/L GAG組

13、與肝素組、LPS加1mg/L GAG組和LPS加10mg/LGAG組相比,TMAg水平亦有顯著升高(P分別<0.005,<0.001,<0.005)(見(jiàn)表1)。3GAG對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞TF和TM mRNA轉(zhuǎn)錄的影響未經(jīng)LPS處理的HUVECs TF mRNA轉(zhuǎn)錄水平很低,經(jīng)LPS誘導(dǎo)后TFmRNA轉(zhuǎn)錄有所增強(qiáng)。各GAG組和肝素組的TF mRNA轉(zhuǎn)錄下降。LPS處理后,內(nèi)皮細(xì)胞TM mRNA轉(zhuǎn)錄下降,用5mg/L肝素,1mg/L 、5mg/L和10mg/L的GAG與LPS共同作用于內(nèi)皮細(xì)胞,TM mRNA轉(zhuǎn)錄有所增強(qiáng)(見(jiàn)1)。     M為Ma

14、rker;16為GAG對(duì)TM mRNA表達(dá)的影響;af為GAG對(duì)TF mRNA表達(dá)的影響;1和a為對(duì)照組;2和b為L(zhǎng)PS刺激組;3和c為肝素組;4和d為L(zhǎng)PS加1mg/L GAG組;5和e為L(zhǎng)PS加5mg/L GAG組;6和f為L(zhǎng)PS加10mg/L GAG組1GAG對(duì)HUVECs的TF 和TM mRNA表達(dá)的影響討論TF是一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為47×103的膜結(jié)合糖蛋白,它是凝血因子/a的受體和輔助因子,TFa復(fù)合物具有水解活性,可以將因子和因子轉(zhuǎn)化為活化的因子a和a,從而生成凝血酶和纖維蛋白8。生理情況下,TF不與血液接觸,在血管損傷時(shí)入血,激活外源性凝血途徑,形成纖維蛋白凝塊,從而減

15、少和阻止出血或血栓形成。正常的內(nèi)皮細(xì)胞表面不表達(dá)TF,炎性物質(zhì)如LPS、IL-1、TNF以及凝血酶等可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞TF的表達(dá)。炎性物質(zhì)刺激的內(nèi)皮細(xì)胞可作為細(xì)胞損傷模型,以研究病理狀態(tài)下細(xì)胞生物學(xué)活性的改變9。TM是位于內(nèi)皮細(xì)胞表面的一種高親和性的凝血酶受體。輔助活化蛋白C(APC)通過(guò)與凝血酶結(jié)合來(lái)改變凝血酶的促凝活性。APC可以滅活a和a,發(fā)揮抗凝作用。所以,凝血酶-TM途徑是內(nèi)皮細(xì)胞生理抗凝機(jī)制之一。細(xì)胞因子和內(nèi)毒素在上調(diào)TF的同時(shí)可以下調(diào)TM10。肝素屬GAGs類, 它能在轉(zhuǎn)錄水平抑制內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞TF mRNA的表達(dá)11,并能抑制受損的內(nèi)皮細(xì)胞TM的釋放12。海參GAG是從玉足海參

16、體壁中提取出的一種含硫酸糖胺聚糖。我們的臨床研究證明GAG具有抗凝血作用、降低血粘度作用和降低血脂作用3。但對(duì)GAG的抗凝機(jī)制的研究報(bào)道甚少。我們從HUVECs的TF和TM蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平及總體PCA方面進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,GAG可以降低LPS誘導(dǎo)的HUVECs的TF抗原的表達(dá)和TF mRNA的轉(zhuǎn)錄,同時(shí)升高TM抗原的表達(dá)和TM mRNA的轉(zhuǎn)錄,降低內(nèi)皮細(xì)胞表面的PCA,從而發(fā)揮抗凝作用。這可能是GAG發(fā)揮抗凝作用的主要機(jī)制之一。我們研究了1mg/L 、5mg/L 和10mg/L的GAG三個(gè)劑量組的差異,發(fā)現(xiàn)5mg/L組的作用明顯優(yōu)于1mg/L 和10mg/L組,說(shuō)明高于一定濃度的GAG的

17、作用反而降低。最近,Imanari等13進(jìn)行了GAGs的藥物代謝動(dòng)力學(xué)方面的研究,發(fā)現(xiàn)GAGs的代謝動(dòng)力學(xué)非常復(fù)雜,并且是非劑量依賴的。臨床用藥劑量為60mg/d或120mg/d,此劑量的血藥濃度低于5mg/L,具有良好的抗凝作用。這提示臨床用藥的劑量不宜過(guò)大。至于高濃度GAG抗凝作用下降的機(jī)制以及GAG發(fā)揮抗凝作用的深層機(jī)制有待進(jìn)一步研究。 基金項(xiàng)目:衛(wèi)生部科學(xué)研究基金資助項(xiàng)目(98-1-310);胡應(yīng)洲基金部分資助項(xiàng)目作者單位:李志廣(200025上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院、上海血液學(xué)研究所)王學(xué)鋒(200025上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院、上海血液學(xué)研究所)王鴻利(20002

18、5上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院、上海血液學(xué)研究所)郭為民(200025上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院、上海血液學(xué)研究所)劉元?(200025上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院、上海血液學(xué)研究所)璩斌(200025上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院、上海血液學(xué)研究所)郭雪梅(200025上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院、上海血液學(xué)研究所)儲(chǔ)海燕(200025上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院、上海血液學(xué)研究所)參 考 文 獻(xiàn)3,王學(xué)鋒,王鴻利,胡大萌,等.玉足海參酸性粘多糖(抗栓膠囊)抗血栓形成作用的觀察.中華血液學(xué)雜志,1997,18:457-459.4,Ryan J,Geczy C.Coagulation and

19、the expression of cell-mediated immunity.Immunol Cell Biol,1987,65:127-139.6,Jaffe EA,Nachman RL,Becker CG,et al.Culture of human endothelial cells derived from umbilical cord veins.Identification and immunological criteria.J Clin Invest,1973,52:2745-2756.7,Koyama T,Hirosawa S,Kawamata N,et al.All-t

20、rans retionic acid upregulates thrombomodulin and downregulates tissue factor expression in acute promyelocytic leukemia cells: distinct expression of thrombomodulin and tissue factor in human leukemia cells.Blood,1994,84:3001-3009.8,Edgington TS,Mackman N,Brand K,et al.The structural biology of expression and function of tissue factor.Thromb Haemost,1991,66:67.9,Colrcci J,Balconi G,Lorenzet R,et al.Cultured human endothelial cells generate tissue factor in response to endotoxin.J Clin Invest,1983,71:1893-1896.10,Wharam BL,Fitting K,Kunkel SL,et al.Tissue factor expression in endothelial

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