青蒿葉片愈傷組織的誘導和植株再生

1、    青蒿葉片愈傷組織的誘導和植株再生作者：伍曉麗，劉飛， 李隆云， 鐘國躍【摘要】 目的探討以青蒿幼嫩葉片再生植株的 方法 。方法以青蒿幼嫩葉片為外植體，接種于附加不同激素組合的MS培養(yǎng)基，進行愈傷組織誘導和植株再生。結(jié)果以6BA0.1 mg/L+2，4-D0.3 mg/L誘導愈傷組織，在含6BA0.1 mg/L+IAA0.3 mg/L的培養(yǎng)基上分化，用含IAA0.1 mg/L+ NAA0.3 mg/L的培養(yǎng)基生根。結(jié)論 用以上方法可以在較短周期內(nèi)從幼嫩葉片得到再生青蒿植株。 【關(guān)鍵詞】 青蒿； 植物激素； 愈傷； 再生Abstract：Object

2、iveTo explore the way of regeneration of plants from leaves of Artemisia annua L.MethodsTo plant the leaves of Artemisia annua L. on mediums plus different plant hormones. Results The  suitable callus-inducing medium was MS+ 6BA10 mg/L+2,4D0.3 mg/L. The suitable regenerating medium was MS+

3、6BA0.1 mg/L+IAA0.3 mg/L. The suitable rootinducing medium was MS+IAA0.1 mg/L+ NAA0.3 mg/L.ConclusionYoung plants can regenerate from leaves in a short span by the method above.Key words：Artemisia annua L； Plant hormones； Callus； Regeneration青蒿(Artemisia annua) L，又名黃花蒿，是菊科一年生藥用草本植物。提取物青蒿素對腦瘧疾和氯喹瘧疾具有高

4、效低毒的抗瘧性能，WHO已經(jīng)認定復方青蒿素成藥為 目前 最安全有效的抗瘧藥?，F(xiàn)在世界上已經(jīng)有51個國家和地區(qū)在WHO推薦下將其列為抗瘧指定用藥。這使得全球?qū)η噍锼卦系男枨竺蜐q，從2004年開始已出現(xiàn)了從原料到成品藥各個環(huán)節(jié)的嚴重供貨短缺1。目前該藥物雖然能人工合成，但成本很高，未能實際生產(chǎn)2， 工業(yè) 上主要從青蒿植株中提取。目前青蒿因長期處于野生狀態(tài)，未能選育出高含量的品種，青蒿素含量極低，而且其含量還受土壤營養(yǎng)、地理環(huán)境、氣候等多種因素 影響 34，大大增加了該藥的生產(chǎn)成本。為此，高青蒿素含量的青蒿品種選育工作重要性日益凸顯，而組織培養(yǎng)正是 現(xiàn)代 育種技術(shù)的一個重要組成部分，本實驗初步探討

5、了青蒿葉片的愈傷組織誘導和植株再生技術(shù)，為進一步的育種 研究 打下基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 材料酉陽本地生產(chǎn)用種，由重慶市中藥研究院生藥栽培室提供。1.2 方法1.2.1 培養(yǎng)基配制基本培養(yǎng)基為培養(yǎng)基，附加蔗糖30 g/L,瓊脂15 g/L，pH調(diào)節(jié)至5.8。附加激素如下：（12）IAA0.1 mg/L+ NAA1.0mg/L1.2.2 外植體處理剪取20 cm高青蒿苗上的幼嫩葉片，剪成0.5 cm2的小塊，無菌水中浸泡3 h，75%乙醇漂洗1 min，于5%次氯酸鈉溶液中浸泡3 min，無菌水漂洗4次，接種。培養(yǎng)條件為25，2000 Lx光照、14 h/d。2 結(jié)果與 分析 觀察發(fā)現(xiàn)，不同

6、激素組合對青蒿的愈傷誘導、植株再生和生根均有顯著影響。2.1 愈傷組織誘導接種后的葉片呈灰綠色水浸狀，貌似死亡，培養(yǎng)基（2）和（5）上的葉片，在接種后第5天葉片邊緣開始出現(xiàn)鮮綠色的顆粒，直徑約0.51.0 mm左右，呈致密狀態(tài)，10 d后，愈傷生長達到高峰，在多處葉片邊緣出現(xiàn)。培養(yǎng)基（5）上的愈傷在接種后15 d開始分化出綠色叢生芽點，但只停留在這一階段，不能進一步分化成苗。培養(yǎng)基（2）上的愈傷一直保持致密顆粒狀。培養(yǎng)基（1）（3）（4）（6）上的葉片沒有愈傷出現(xiàn)，只是葉片邊緣有少部分返綠，返綠部分取下接種于分化培養(yǎng)基上漸漸褐化死亡。不同培養(yǎng)基愈傷組織誘導率見表1。表1 愈傷組織誘導率（略）2

7、.2 芽的分化將培養(yǎng)基（2）和（5）上的愈傷分別轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基（7）（8）（9），5 d后，（8）和（9）上的愈傷均分化出苗，10 d后達高峰時期。（8）上的苗生長較正常，（9）上的苗叢生密度過大，苗型細弱，生長緩慢，（7）上的愈傷只能保持在叢生芽點狀態(tài)，30 d后即漸漸褐化死亡。培養(yǎng)基（5）中產(chǎn)生的愈傷組織分化率明顯大于培養(yǎng)基（2）中產(chǎn)生的愈傷組織。3種分化培養(yǎng)基中幼苗分化率結(jié)果見表2。表2 培養(yǎng)基（2）和（5）上的愈傷組織幼苗分化率（略）2.3 根的分化小苗約12 cm高時轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，3 d后即可在小苗基部見到白色新根，不同培養(yǎng)基根分化率如表3。表3 幼苗根分化率（略）可見，隨著NAA

8、濃度增高，根分化率反而降低，以培養(yǎng)基（10）較合適。從葉片接種到小苗出瓶移栽，整個周期約1個月左右。此外，在實驗期間還用培養(yǎng)了約2個月的青蒿無菌苗葉片接種培養(yǎng)基（2）和（5），葉片在培養(yǎng)基上皺縮，邊緣褐化，最后死亡，始終無愈傷出現(xiàn)。2.4 試管苗移栽試管苗揭去瓶蓋，在室內(nèi)煉苗3 d，4 h/d；3 d后，置于室外弱光蔭蔽處煉苗2 d，4 h/d；2 d后，移栽已高壓滅菌的珍珠巖，澆透定根水，每天葉面噴水保濕12次，約15 d后，見苗基部長出乳白色新根，心葉開始生長，即表明成活，帶土移栽大田。移栽成活率93%以上。3 小結(jié)本實驗的 研究 表明，以青蒿幼嫩葉片為外植體，MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加

9、6BA 1.0 mg/L+2,4D 0.3 mg/L誘導愈傷組織，附加6BA 0.1 mg/L+IAA 0.3 mg/L的培養(yǎng)基上分化，附加IAA 0.1 mg/L+ NAA 0.3 mg/L的培養(yǎng)基生根，可以在較短周期內(nèi)從幼嫩葉片得到再生青蒿植株。該結(jié)果可 應(yīng)用 于青蒿的生物技術(shù)育種，尤其是倍性育種上，具體思路如下：用秋水仙素溶液浸泡剛發(fā)芽的幼苗，幼苗在小花缽中生長，得到嵌和體植株，取生長初期的數(shù)片真葉（該葉片可能是多倍體組織），通過組織培養(yǎng)再生植株，得到純合的多倍體植株。無菌苗葉片接種誘導培養(yǎng)基，無愈傷出現(xiàn)，初步推測，可能是缺乏消毒過程的刺激，不能產(chǎn)生具有補償外界傷害作用的愈傷組織，其具體原因有待進一步研究?！?參考  文獻 】1 中國 中醫(yī)藥信息雜志通訊員. 世界衛(wèi)生組織呼吁中國增加青蒿素產(chǎn)量J.中國中醫(yī)藥信息雜志, 2005, 12(8)：110.2許杏樣青蒿素及其一類物結(jié)構(gòu)和合成的研究J.有機化學，1982,6：44