降鈣素基因相關(guān)肽在局灶性腦缺血再灌注大鼠腦內(nèi)的表達(dá)

1、降鈣素基因相關(guān)肽在局灶性腦缺血再灌注大鼠腦內(nèi)的表達(dá)              降鈣素基因相關(guān)肽在局灶性腦缺血再灌注大鼠腦內(nèi)的表達(dá)    2008-6-28 18:44:28 我說(shuō)兩句                       &

2、#160;        【摘要】  目的：探討CGRP在大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷時(shí)表達(dá)狀況及其在損傷機(jī)制中的作用。方法：建立大鼠大腦中動(dòng)脈缺血2小時(shí)再灌注24小時(shí)模型，分別采用TTC染色及RT-PCR法觀察大鼠腦組織缺血狀況及CGRP的表達(dá)狀況。結(jié)果：假手術(shù)組大鼠腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常CGRP呈弱表達(dá)；模型組大鼠大腦缺血區(qū)組織明顯水腫，CGRP表達(dá)較假手術(shù)組對(duì)應(yīng)區(qū)顯著升高，P0.05。結(jié)論：CGRP參與了局灶性腦缺血再灌注損傷，且可能對(duì)缺血性腦損害起到一定的保護(hù)作用。 【關(guān)鍵詞】  局灶性腦缺血再灌注 大

3、腦中動(dòng)脈閉塞 血紅素加氧酶A study on expression and significance of STAT3 in cerebral tissues of Rat after focal cerebral ischemia and reperfusion【Abstract】Objective  To investigate the effects of the expression of CGRPin cerebral tissues of rat after focal cerebral ischemia and reperfusion.Methods  2

4、hours right intraluminal middle cerebral artery occlusion with reperfusion was induced in 20 rats,and the specimen of brain were performed at the point after 24 hours reperfusion;expressions of CGRP were detected by RT-PCR method. Results  Expressions of CGRP were seen sparsely in the control s

5、pecimens,and were markly increased afer transient focal cerebal ischemia and reperfusion(p<0.05) Conclusion  Expression of CGRP is a significant response to transient focal cerebral ischemia/reperfusion and contributes to the early formasion of vasogenic edema that can be observed all parst

6、of brains.【Key words】focal cerebral ischemia;reperfusion;heme oxygenase缺血性腦血管疾病是一種致死致殘的常見(jiàn)病、多發(fā)病。腦缺血再灌注損傷對(duì)腦損害的機(jī)制是非常復(fù)雜的。機(jī)制尚不十分清楚，更缺乏有效的治療方法。降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）是由37個(gè)氨基酸組成的活性多肽，與降鈣素為同種基因產(chǎn)物，是目前已知的體內(nèi)最強(qiáng)的擴(kuò)血管物質(zhì)，廣泛分布在腦組織中，在缺氧缺血的腦組織中具有有效的細(xì)胞保護(hù)作用。鑒于此，本研究旨在建立大鼠大腦中動(dòng)脈缺血2h再灌注24h模型后，通過(guò)RT-PCR法檢測(cè)大鼠腦組織CGRP mRNA表達(dá)的變化，探討CGRP在腦缺

7、血再灌注損傷機(jī)制中的可能作用。1  實(shí)驗(yàn)材料與方法1.1  動(dòng)物來(lái)源與分組 北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供的SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠20只，體重260280g。將符合模型成功標(biāo)準(zhǔn)的大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組5只；缺血組15只。假手術(shù)組按下術(shù)模型制備。1.2  實(shí)驗(yàn)方法參照Z(yǔ)ea-logue等復(fù)制局灶性腦缺血模型。將麻醉的大鼠仰臥位固定，頸正中切口，結(jié)扎并游離右側(cè)頸總、頸外動(dòng)脈，在游離段上接近頸內(nèi)、外動(dòng)脈分叉處剪開1小口，使4/0號(hào)外科尼龍線插入，經(jīng)過(guò)頸總動(dòng)脈分叉處進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，入顱至大腦中動(dòng)脈起始處，線插入深度約為（18.5

8、77;0.5）mm。手術(shù)過(guò)程中保持環(huán)境在2530，且用棉墊和電烤燈維持大鼠體溫于3737.5，并一直保持至動(dòng)物麻醉蘇醒。造模成功的標(biāo)準(zhǔn)：動(dòng)物手術(shù)后有明顯手術(shù)側(cè)（即右側(cè)）Horner征（右側(cè)眼瞼下垂，眼球凹陷）及對(duì)側(cè)偏癱體癥（不能完全伸展左前肢，行走時(shí)向左側(cè)傾倒或轉(zhuǎn)圈）。依上述標(biāo)準(zhǔn)將能夠存活24h的大鼠選定為最后的實(shí)驗(yàn)對(duì)象，并進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分。再灌24小時(shí)后，在大鼠深度麻醉狀態(tài)下取腦，距大腦前端4mm處及后端3mm處冠狀取2mm厚的腦片，再迅速分離左右腦。用消毒好的錫箔紙包好右側(cè)受損腦組織，立即放入液氮中冰凍，然后取出凍存于70的冰箱中。切下的腦片迅速置于TTC皿中進(jìn)行染色，來(lái)判斷腦損傷的程度。按

9、Trizol液的說(shuō)明書提取總RNA。測(cè)定其濃度以及260nm和280nm處吸光度比值（A260/280）。引物由大連寶生物工程有限公司合成，引物序列為：上游引物：5ATT GAC CTG CCG ATG TCC CCC CGC ACT TTA CAT TCA3；下游引物：5TCA CAT CGG GGA GGT AGC3?？偡磻?yīng)體系12L，30反應(yīng)10min，42反應(yīng)30min，99反應(yīng)5min，5反應(yīng)5min，cDNA產(chǎn)物置于20保存。取5L逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94變性30s，55退火30s，72延伸1min，擴(kuò)增28個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物20保存。取PCR產(chǎn)物5L經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，

10、紫外燈下觀察結(jié)果，拍照并用光密度儀掃描分析。通過(guò)-actin光密度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)校正，計(jì)算CGRP mRNA的表達(dá)。                                   降鈣素基因相關(guān)肽在局灶性腦缺血再灌注大鼠腦內(nèi)的表達(dá)    2008-

11、6-28 18:44:28 我說(shuō)兩句                                 2  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理3  實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1  腦缺血模型判定 造模大鼠蘇醒后即呈現(xiàn)腦缺血表現(xiàn)，均出現(xiàn)不同程度Horner綜合征，左側(cè)前后肢癱，以前肢為重。3.2 

12、RT-PCR結(jié)果 RT-PCR結(jié)果顯示,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)CGRP和-actin分別為387bp和329bp兩條帶。缺血大鼠腦內(nèi)CGRPmRNA表達(dá)與假手術(shù)組有明顯差異(P0.05)(圖1)。假手術(shù)組與缺血24h組CGRPmRNA表達(dá)吸光度相對(duì)值(CGRP/-actin)分別為: 0.406、0.441、0.505、0.654、0.748、0.646。如圖1。降鈣素基因相關(guān)肽是由37個(gè)氨基酸組成的活性多肽，具有擴(kuò)張腦血管3、減少腦組織缺血性損傷4，對(duì)缺氧的神經(jīng)元有保護(hù)和功能恢復(fù)等作用5。本實(shí)驗(yàn)中,首先TT染色結(jié)果顯示假手術(shù)組腦組織結(jié)構(gòu)正常；缺血再灌模型組大鼠缺血區(qū)腦組織明顯變白,說(shuō)

13、明造模成功。其次, CGRP在假手術(shù)組僅少量表達(dá),而缺血組大鼠腦組織CGRP表達(dá)均較假手術(shù)組對(duì)應(yīng)區(qū)域顯著升高。有實(shí)驗(yàn)報(bào)道CGRP在腦組織中的表達(dá)對(duì)神經(jīng)元有一定的的保護(hù)作用,但在缺血性腦損害中, CGRP表達(dá)與其他應(yīng)激性蛋白質(zhì)在缺血性損害和修復(fù)過(guò)程中的機(jī)制及相互關(guān)系還不是很清楚，張?zhí)炝值?比較海馬缺血及再灌流后現(xiàn),CGRP含量與CA1、CA2、CA3和CA4區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)呈顯著性正相關(guān)。認(rèn)為腦缺血及再灌流后CGRP增加雖有可能增加腦供血,但也可能觸發(fā)再灌流損傷的發(fā)生,而導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。因此CGRP在腦缺血及再灌流中所起的作用較為復(fù)雜，有必要深入研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  Kress A,Tac

14、obowitz DM,Skofitsch G,Detailed mapping of CGRP Mrna expression in the ratcontral nervous system:Comparison with previous immuncyto-chemical findings.Brain Res Bull 1995,36(3):261. Matsuo Y,Izumiyama M,Onodera H,et al.Effect of a noval thromboxane A2 receptor antagnist,S-1452,on postischemic injury

15、in tats.Strode ,1993,24:2059.3 Johnston FG,Bell BA,Robertson IJ,Effect of calcitonin-gine-related peptide on postoperative neurological deficits after subarachnoid haemorrhageJ.Lancet,1990,335:869872.4 Holland JP,Sydserff SGC,Taylor WAS,et al.Calcitonin gene-related peptide reduces brain injury in a rat model