第一章 蛋白質(zhì)

1、第一章 蛋白質(zhì)一、知識(shí)要點(diǎn)（一）氨基酸的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)是重要的生物大分子，其組成單位是氨基酸。組成蛋白質(zhì)的氨基酸有20種，均為-氨基酸。每個(gè)氨基酸的-碳上連接一個(gè)羧基，一個(gè)氨基，一個(gè)氫原子和一個(gè)側(cè)鏈R基團(tuán)。20種氨基酸結(jié)構(gòu)的差別就在于它們的R基團(tuán)結(jié)構(gòu)的不同。根據(jù)20種氨基酸側(cè)鏈R基團(tuán)的極性，可將其分為四大類：非極性R基氨基酸（8種）；不帶電荷的極性R基氨基酸（7種）；帶負(fù)電荷的R基氨基酸（2種）；帶正電荷的R基氨基酸（3種）。（二）氨基酸的性質(zhì)氨基酸是兩性電解質(zhì)。由于氨基酸含有酸性的羧基和堿性的氨基，所以既是酸又是堿，是兩性電解質(zhì)。有些氨基酸的側(cè)鏈還含有可解離的基團(tuán)，其帶電狀況取決于它們的pK值。

2、由于不同氨基酸所帶的可解離基團(tuán)不同，所以等電點(diǎn)不同。除甘氨酸外，其它都有不對(duì)稱碳原子，所以具有D-型和L-型2種構(gòu)型，具有旋光性，天然蛋白質(zhì)中存在的氨基酸都是L-型的。酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸具有紫外吸收特性，在280nm處有最大吸收值，大多數(shù)蛋白質(zhì)都具有這些氨基酸，所以蛋白質(zhì)在280nm處也有特征吸收，這是紫外吸收法定量測(cè)定蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)。氨基酸的-羧基和-氨基具有化學(xué)反應(yīng)性，另外，許多氨基酸的側(cè)鏈還含有羥基、氨基、羧基等可解離基團(tuán)，也具有化學(xué)反應(yīng)性。較重要的化學(xué)反應(yīng)有：（1）茚三酮反應(yīng)，除脯氨酸外，所有的-氨基酸都能與茚三酮發(fā)生顏色反應(yīng)，生成藍(lán)紫色化合物，脯氨酸與茚三酮生成黃色化合物。（2）

3、Sanger反應(yīng)，-NH2與2,4-二硝基氟苯作用產(chǎn)生相應(yīng)的DNB-氨基酸。（3）Edman反應(yīng)，-NH2與苯異硫氰酸酯作用產(chǎn)生相應(yīng)的氨基酸的苯氨基硫甲酰衍生物（PIT-氨基酸）。Sanger反應(yīng)和Edmen反應(yīng)均可用于蛋白質(zhì)多肽鏈N端氨基酸的測(cè)定。氨基酸通過肽鍵相互連接而成的化合物稱為肽，由2個(gè)氨基酸組成的肽稱為二肽，由3個(gè)氨基酸組成的肽稱為三肽，少于10個(gè)氨基酸肽稱為寡肽，由10個(gè)以上氨基酸組成的肽稱為多肽。（三）蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)是具有特定構(gòu)象的大分子，為研究方便，將蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分為四個(gè)結(jié)構(gòu)水平，包括一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)。一般將二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)稱為三維構(gòu)象或高

4、級(jí)結(jié)構(gòu)。一級(jí)結(jié)構(gòu)指蛋白質(zhì)多肽鏈中氨基酸的排列順序。肽鍵是蛋白質(zhì)中氨基酸之間的主要連接方式，即由一個(gè)氨基酸的-氨基和另一個(gè)氨基酸的-之間脫去一分子水相互連接。肽鍵具有部分雙鍵的性質(zhì)，所以整個(gè)肽單位是一個(gè)剛性的平面結(jié)構(gòu)。在多肽鏈的含有游離氨基的一端稱為肽鏈的氨基端或N端，而另一端含有一個(gè)游離羧基的一端稱為肽鏈的羧基端或C端。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是指多肽鏈骨架盤繞折疊所形成的有規(guī)律性的結(jié)構(gòu)。最基本的二級(jí)結(jié)構(gòu)類型有-螺旋結(jié)構(gòu)和-折疊結(jié)構(gòu)，此外還有-轉(zhuǎn)角和自由回轉(zhuǎn)。右手-螺旋結(jié)構(gòu)是在纖維蛋白和球蛋白中發(fā)現(xiàn)的最常見的二級(jí)結(jié)構(gòu),每圈螺旋含有3.6個(gè)氨基酸殘基，螺距為0.54nm,螺旋中的每個(gè)肽鍵均參與氫鍵的形成

5、以維持螺旋的穩(wěn)定。-折疊結(jié)構(gòu)也是一種常見的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在此結(jié)構(gòu)中，多肽鏈以較伸展的曲折形式存在，肽鏈（或肽段）的排列可以有平行和反平行兩種方式。氨基酸之間的軸心距為0.35nm,相鄰肽鏈之間借助氫鍵彼此連成片層結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)域是介于二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)之間的一種結(jié)構(gòu)層次，是指蛋白質(zhì)亞基結(jié)構(gòu)中明顯分開的緊密球狀結(jié)構(gòu)區(qū)域。超二級(jí)結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)分子 中的多肽鏈在三維折疊中形成有規(guī)則的三級(jí)結(jié)構(gòu)聚集體。蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)是整個(gè)多肽鏈的三維構(gòu)象，它是在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，多肽鏈進(jìn)一步折疊卷曲形成復(fù)雜的球狀分子結(jié)構(gòu)。具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)一般都是球蛋白，這類蛋白質(zhì)的多肽鏈在三維空間中沿多個(gè)方向進(jìn)行盤繞折疊，形成十分緊密的

6、近似球形的結(jié)構(gòu)，分子內(nèi)部的空間只能容納少數(shù)水分子，幾乎所有的極性R基都分布在分子外表面，形成親水的分子外殼，而非極性的基團(tuán)則被埋在分子內(nèi)部，不與水接觸。蛋白質(zhì)分子中側(cè)鏈R基團(tuán)的相互作用對(duì)穩(wěn)定球狀蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)起著重要作用。蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)指數(shù)條具有獨(dú)立的三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈通過非共價(jià)鍵相互連接而成的聚合體結(jié)構(gòu)。在具有四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)中，每一條具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的皚鏈稱為亞基或亞單位，缺少一個(gè)亞基或亞基單獨(dú)存在都不具有活性。四級(jí)結(jié)構(gòu)涉及亞基在整個(gè)分子中的空間排布以及亞基之間的相互關(guān)系。維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的作用力主要是氫鍵、離子鍵、疏水作用力和范德華力等非共價(jià)鍵，又稱次級(jí)鍵。此外，在某些蛋白質(zhì)中還有二硫鍵

7、，二硫鍵在維持蛋白質(zhì)構(gòu)象方面也起著重要作用。蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)取決于它的一級(jí)結(jié)構(gòu)，多肽離岸主鏈上的氨基酸排列順序包含了形成復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)（即正確的空間結(jié)構(gòu)）所需要的全部信息。（四）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系不同的蛋白質(zhì)，由于結(jié)構(gòu)不同而具有不同的生物學(xué)功能。蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能是蛋白質(zhì)分子的天然構(gòu)象所具有的性質(zhì)，功能與結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。1一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)功能有相適應(yīng)性和統(tǒng)一性，可從以下幾個(gè)方面說明：（1）一級(jí)結(jié)構(gòu)的變異與分子病蛋白質(zhì)中的氨基酸序列與生物功能密切相關(guān)，一級(jí)結(jié)構(gòu)的變化往往導(dǎo)致蛋白質(zhì)生物功能的變化。如鐮刀型細(xì)胞貧血癥，其病因是血紅蛋白基因中的一個(gè)核苷酸的突變導(dǎo)致該蛋白分

8、子中-鏈第6位谷氨酸被纈氨酸取代。這個(gè)一級(jí)結(jié)構(gòu)上的細(xì)微差別使患者的血紅蛋白分子容易發(fā)生凝聚，導(dǎo)致紅細(xì)胞變成鐮刀狀，容易破裂引起貧血，即血紅蛋白的功能發(fā)生了變化。（2）一級(jí)結(jié)構(gòu)與生物進(jìn)化研究發(fā)現(xiàn)，同源蛋白質(zhì)中有許多位置的氨基酸是相同的，而其它氨基酸差異較大。如比較不同生物的細(xì)胞色素C的一級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)與人類親緣關(guān)系接近，其氨基酸組成的差異越小，親緣關(guān)系越遠(yuǎn)差異越大。（3）蛋白質(zhì)的激活作用 在生物體內(nèi)，有些蛋白質(zhì)常以前體的形式合成，只有按一 定方式裂解除去部分肽鏈之后才具有生物活性，如酶原的激活。2蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)與功能之間有密切相關(guān)性，其特定的空間結(jié)構(gòu)是行使生物功能的基礎(chǔ)

9、。以下兩方面均可說明這種相關(guān)性。（1）.核糖核酸酶的變性與復(fù)性及其功能的喪失與恢復(fù)核糖核酸酶是由124個(gè)氨基酸組成的一條多肽鏈，含有四對(duì)二硫鍵，空間構(gòu)象為球狀分子。將天然核糖核酸酶在8mol/L脲中用-巰基乙醇處理，則分子內(nèi)的四對(duì)二硫鍵斷裂，分子變成一條松散的肽鏈，此時(shí)酶活性完全喪失。但用透析法除去-巰基乙醇和脲后，此酶經(jīng)氧化又自發(fā)地折疊成原有的天然構(gòu)象，同時(shí)酶活性又恢復(fù)。（2）血紅蛋白的變構(gòu)現(xiàn)象 血紅蛋白是一個(gè)四聚體蛋白質(zhì)，具有氧合功能，可在血液中運(yùn)輸氧。研究發(fā)現(xiàn)，脫氧血紅蛋白與氧的親和力很低，不易與氧結(jié)合。一旦血紅蛋白分子中的一個(gè)亞基與O2結(jié)合，就會(huì)引起該亞基構(gòu)象發(fā)生改變，并引起其它三個(gè)亞

10、基的構(gòu)象相繼發(fā)生變化，使它們易于和氧結(jié)合，說明變化后的構(gòu)象最適合與氧結(jié)合。從以上例子可以看出，只有當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)以特定的適當(dāng)空間構(gòu)象存在時(shí)才具有生物活性。（五）蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，它的酸堿性質(zhì)取決于肽鏈上的可解離的R基團(tuán)。不同蛋白質(zhì)所含有的氨基酸的種類、數(shù)目不同，所以具有不同的等電點(diǎn)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)所處環(huán)境的pH大于pI時(shí)，蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷，pH小于pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷，pH等于pI時(shí)，蛋白質(zhì)所帶凈電荷為零，此時(shí)溶解度最小。蛋白質(zhì)分子表面帶有許多親水基團(tuán)，使蛋白質(zhì)成為親水的膠體溶液。蛋白質(zhì)顆粒周圍的水化膜（水化層）以及非等電狀態(tài)時(shí)蛋白質(zhì)顆粒所帶的同性電荷的互相排斥是使蛋白質(zhì)膠體系統(tǒng)穩(wěn)定

11、的主要因素。當(dāng)這些穩(wěn)定因素被破壞時(shí)，蛋白質(zhì)會(huì)產(chǎn)生沉淀。高濃度中性鹽可使蛋白質(zhì)分子脫水并中和其所帶電荷，從而降低蛋白質(zhì)的溶解度并沉淀析出，即鹽析。但這種作用并不引起蛋白質(zhì)的變性。這個(gè)性質(zhì)可用于蛋白質(zhì)的分離。蛋白質(zhì)受到某些物理或化學(xué)因素作用時(shí)，引起生物活性的喪失，溶解度的降低以及其它性質(zhì)的改變，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性作用。變性作用的實(shí)質(zhì)是由于維持蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的次級(jí)鍵遭到破壞而造成天然構(gòu)象的解體，但未涉及共價(jià)鍵的斷裂。有些變性是可逆的，有些變性是不可逆的。當(dāng)變性條件不劇烈時(shí)，變性是可逆的，除去變性因素后，變性蛋白又可從新回復(fù)到原有的天然構(gòu)象，恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的生物活性，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的復(fù)

12、性。（六）測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的方法1凝膠過濾法 凝膠過濾法分離蛋白質(zhì)的原理是根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小。由于不同排阻范圍的葡聚糖凝膠有一特定的蛋白質(zhì)分子量范圍，在此范圍內(nèi)，分子量的對(duì)數(shù)和洗脫體積之間成線性關(guān)系。因此，用幾種已知分子量的蛋白質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行凝膠層析，以每種蛋白質(zhì)的洗脫體積對(duì)它們的分子量的對(duì)數(shù)作圖，繪制出標(biāo)準(zhǔn)洗脫曲線。未知蛋白質(zhì)在同樣的條件下進(jìn)行凝膠層析，根據(jù)其所用的洗脫體積，從標(biāo)準(zhǔn)洗脫曲線上可求出此未知蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的分子量。2SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法蛋白質(zhì)在普通聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度取決于蛋白質(zhì)分子的大小、分子形狀和所帶電荷的多少。SDS（十二烷基磺酸鈉）是一種去污劑，可使蛋白質(zhì)變性并解離成亞基。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣品中加入SDS后，SDS與蛋白質(zhì)分子結(jié)合，使蛋白質(zhì)分子帶上大量的強(qiáng)負(fù)電荷，并且使蛋白質(zhì)分子的形狀都變成短棒狀，從而消除了蛋白質(zhì)分子之間原有的帶電荷量和分子形狀的差異。這樣電泳的速度只取決于蛋白質(zhì)分子量的大小，蛋白質(zhì)分子在電泳中的相對(duì)遷移率和分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)成直線關(guān)系。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)和其相對(duì)遷移率作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)所測(cè)