細(xì)胞計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化

1、對(duì)自動(dòng)化血細(xì)胞計(jì)數(shù)和白細(xì)胞分類后手工檢查標(biāo)準(zhǔn)的建議hzdlj(譯)摘要：自第一臺(tái)自動(dòng)化血球儀問(wèn)世的半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，手工技術(shù)，尤其是顯微鏡下觀察染色血片的技術(shù)，補(bǔ)充了血球儀檢測(cè)結(jié)果，使病人的血液標(biāo)本結(jié)果全面。多年以來(lái)，隨著血球儀性能和技術(shù)的不斷改進(jìn)，自動(dòng)化血球儀和手工補(bǔ)充手段的角色正在改變，自動(dòng)化血球儀結(jié)果后的手工操作（重要是手工涂片分析），主要決定于其是否符合一系列復(fù)查標(biāo)準(zhǔn)中的一條來(lái)。在各個(gè)實(shí)驗(yàn)室之間還沒(méi)有統(tǒng)一的行為標(biāo)準(zhǔn)。從長(zhǎng)遠(yuǎn)出發(fā)，需要指定一定普遍能夠接受的規(guī)則，用于血球儀分析后復(fù)查細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類。Berend Houwen博士于2002年邀請(qǐng)了20名專家在spring開會(huì)，商討規(guī)則細(xì)節(jié)，決定

2、最恰當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)。在這次會(huì)議上，一致通過(guò)了83條規(guī)則。15個(gè)實(shí)驗(yàn)室以13298例血液標(biāo)本對(duì)這些規(guī)進(jìn)行了測(cè)試。并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行詳細(xì)的分析，這些規(guī)則被重新定義，合并成了本文的41條規(guī)則。包括適用于首次檢查的規(guī)則，同一個(gè)病人72小時(shí)內(nèi)重新檢查的差值規(guī)則。希望這些規(guī)則對(duì)于世界范圍的大多數(shù)血液學(xué)實(shí)驗(yàn)室有用。各個(gè)實(shí)驗(yàn)室在將本規(guī)則貫徹于病人標(biāo)本之前，應(yīng)證實(shí)這些規(guī)則的有效性，本文也包含了一些用于驗(yàn)證的建議條款。關(guān)鍵詞：血細(xì)胞，一致，差值，圖象介紹：人類血細(xì)胞的分析可以追溯到330年前，列文胡克第一個(gè)通過(guò)自制的由微小顯微鏡構(gòu)成的簡(jiǎn)單的顯微鏡描述了紅細(xì)胞，他甚至可以通過(guò)顯微鏡測(cè)量紅細(xì)胞的直徑。復(fù)合顯微鏡的發(fā)展使得人們可以

3、對(duì)白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板進(jìn)行更為全面的描述，同時(shí)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展使得可以在規(guī)定的體積內(nèi)對(duì)其進(jìn)行計(jì)數(shù)。直到Paul Ehrlich通過(guò)用苯胺染料(aniline dyes)對(duì)血細(xì)胞進(jìn)行染色，可以區(qū)分細(xì)胞核、細(xì)胞漿以及一些完好的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，細(xì)胞的世界才變得五顏六色。他把各種不同的白色的細(xì)胞（white cells）劃分為五種類型，也就是今天仍然沿用的分類標(biāo)準(zhǔn)。在20世紀(jì)前半葉，通過(guò)手工操作在固定體積的容器里對(duì)白細(xì)胞，紅細(xì)胞，血小板進(jìn)行計(jì)數(shù)；手工血紅蛋白檢測(cè)以及PCV檢測(cè)等，在臨床上廣泛應(yīng)用。這些幾乎都是一成不變地伴隨著顯微鏡對(duì)染色的血片進(jìn)行白細(xì)胞分類，以及評(píng)估紅細(xì)胞和血小板的大小和體積進(jìn)行評(píng)價(jià)。195

4、6年，Wallacc Coulter發(fā)明了第一臺(tái)自動(dòng)化血球儀，用于對(duì)血細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)以及體積描述。這是一個(gè)單通道的裝置，克服了手工細(xì)胞計(jì)數(shù)繁瑣且不精確的缺點(diǎn)。60年代，發(fā)展了多參數(shù)的血細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀；70年代，兩種技術(shù)在白細(xì)胞的分類計(jì)數(shù)中相互競(jìng)爭(zhēng)。其一是圖像分析技術(shù)（image analysis technology），試圖模仿人工顯微鏡檢檢查，由于存在很多局限性，因此并沒(méi)有發(fā)展下去；第二種技術(shù)就是應(yīng)用細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，在自動(dòng)血球儀上通過(guò)“流式（flow）”的方法在不同的計(jì)數(shù)池對(duì)細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別，WBC分類也是通過(guò)“流式”不同的方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行辨別，此項(xiàng)技術(shù)隨后發(fā)展了起來(lái)。80年代，血細(xì)胞計(jì)數(shù)和WBC分類

5、技術(shù)融合進(jìn)入同一平臺(tái)，產(chǎn)生了當(dāng)前廣泛使用的多參數(shù)“流式”血細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類的血球儀，許多制造商都可以提供。圖象工具也應(yīng)用運(yùn)用到這些血球儀以提醒操作者異常細(xì)胞形態(tài)的存在以及出現(xiàn)了血球儀不能計(jì)數(shù)的異常細(xì)胞等，同時(shí)還可以提示標(biāo)本的某些特征，比如血小板聚集，其可以導(dǎo)致不正確結(jié)果的產(chǎn)生。自第一臺(tái)自動(dòng)化血球儀問(wèn)世以來(lái)，手工技術(shù)，特別是顯微鏡對(duì)染色血片進(jìn)行觀察，補(bǔ)充上血球儀的結(jié)果，能為病人血液標(biāo)本提供了更為廣泛的報(bào)告。近年來(lái)，由于血球儀的性能和技術(shù)不斷改進(jìn)，血球儀的角色以及彌補(bǔ)的過(guò)程已經(jīng)發(fā)生了改變。我們認(rèn)識(shí)到自動(dòng)血球儀在WBC、RBC、PLT計(jì)數(shù)以及形態(tài)較好的成熟WBC分類中更勝一籌，而顯微鏡檢基于細(xì)胞學(xué)特征

6、的微小變化，在區(qū)分細(xì)胞，尤其是不成熟細(xì)胞中更具有優(yōu)勢(shì)。對(duì)于很多標(biāo)本，已經(jīng)沒(méi)有必要進(jìn)行顯微鏡檢或者手工分類計(jì)數(shù)了。最近，由于控制成本的壓力，以及缺乏訓(xùn)練有素的工作人員，都逐漸需要在不犧牲結(jié)果質(zhì)量的前提下，減少手工檢查的數(shù)量。因?yàn)橹饕难a(bǔ)充程序是顯微鏡涂片鏡檢，決定每個(gè)標(biāo)本是否有涂片鏡檢的必要性，對(duì)于血液學(xué)實(shí)驗(yàn)室成本中、工作量、以及出報(bào)告的速度都起著重要作用。人工涂片檢查為我們提供額外的或者血球儀漏掉的信息，或者用于驗(yàn)證血球儀結(jié)果。顯微鏡檢通常是根據(jù)適用于血球儀結(jié)果的涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)來(lái)執(zhí)行的。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都制定了自己的血球儀檢測(cè)后的工作標(biāo)準(zhǔn)。目的就是減少需要?jiǎng)邮郑ㄍǔＪ峭科R檢）的標(biāo)本的數(shù)量到最大程度，

7、同時(shí)不至于因?yàn)殄e(cuò)誤的或者易誤導(dǎo)的報(bào)告，尤其是假陰性的結(jié)果而損害病人。盡管如此，單個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀鯖](méi)有機(jī)會(huì)知道自己執(zhí)行的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于減少假陽(yáng)性，假陰性是否是最恰當(dāng)?shù)?。非正式的信息交換顯示，不同實(shí)驗(yàn)室之間的涂片鏡檢率從5%到95%不等。這是不能完全用病種的不同以及儀器的不同來(lái)解釋的。Berend Houwen博士認(rèn)識(shí)到，從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，需要制定一個(gè)普遍能接受的標(biāo)準(zhǔn)，用于血球分析儀分析后復(fù)查血細(xì)胞計(jì)數(shù)以及分類。他邀請(qǐng)了20名專家于2002年在spring商討這個(gè)話題，并且在大多數(shù)恰當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)上達(dá)成了共識(shí)。要邀請(qǐng)來(lái)的血液學(xué)學(xué)者代表了6個(gè)國(guó)家17個(gè)實(shí)驗(yàn)室，在復(fù)查標(biāo)準(zhǔn)上一流的專家。這些實(shí)驗(yàn)室包括三級(jí)醫(yī)院（servici

8、ng tertiary hospitals），腫瘤醫(yī)院，社區(qū)醫(yī)院，兒童醫(yī)院和私立醫(yī)院(doctors office)(見附錄1)。在近三天的時(shí)間里，血細(xì)胞計(jì)數(shù)的每一個(gè)參數(shù)都進(jìn)行了深入的討論，并達(dá)成了一致的意見，即在什么情況下復(fù)查啟動(dòng)對(duì)自動(dòng)分析儀分析結(jié)果的復(fù)查，大概包含進(jìn)一步的測(cè)試或者涂片復(fù)查。來(lái)自15個(gè)實(shí)驗(yàn)室的代表同意按照隨后會(huì)議制定的細(xì)則，在他們各自的實(shí)驗(yàn)室對(duì)這些規(guī)則進(jìn)行測(cè)試。對(duì)規(guī)則驗(yàn)證以及發(fā)展情況，包括各自對(duì)補(bǔ)充臨床血液學(xué)實(shí)驗(yàn)室的補(bǔ)充建議，都包含在本文中。材料合方法：為驗(yàn)證這些規(guī)則的合理性，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室被要求做1000個(gè)標(biāo)本。這些標(biāo)本是從一段時(shí)間的日常標(biāo)本里面隨機(jī)挑選出來(lái)的，代表了實(shí)驗(yàn)室的病

9、種分布。在這1000個(gè)標(biāo)本中，有800個(gè)是首檢標(biāo)本，用于測(cè)試關(guān)于首檢標(biāo)本的規(guī)則。剩下的200個(gè)標(biāo)本是二次檢測(cè)標(biāo)本，用于測(cè)試關(guān)于二次檢測(cè)標(biāo)本的規(guī)則。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都按照自己的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）在本室的血球儀上對(duì)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。此外，不管SOP文件要求是否對(duì)檢測(cè)標(biāo)本進(jìn)行涂片鏡檢，對(duì)所有的標(biāo)本都進(jìn)行涂片染色觀察。并在實(shí)驗(yàn)中對(duì)所有的病人的標(biāo)本進(jìn)行手工涂片分類。如果涂片分類是日常工作中要求的，其結(jié)果也被納入研究。所有的數(shù)據(jù)都上交給指導(dǎo)委員會(huì)（steering committee）進(jìn)行分析。每個(gè)成員所提交的數(shù)據(jù)是一張電子表格，包含了每個(gè)標(biāo)本的識(shí)別，執(zhí)行的每條規(guī)則情況，涂片鏡檢，儀器圖象（instrument

10、 flag），所有血細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果，按本實(shí)驗(yàn)室規(guī)則是否需要對(duì)標(biāo)本進(jìn)行涂片檢查，樣本差值（sample delta），以及每個(gè)重要發(fā)現(xiàn)的評(píng)價(jià)。數(shù)據(jù)由指導(dǎo)委員會(huì)成員進(jìn)行細(xì)致的分析和回顧。指導(dǎo)委員會(huì)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步評(píng)估后，很明顯：并不是所有的實(shí)驗(yàn)室都使用相同的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)定義什么是不正常的涂片結(jié)果（陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)）。指導(dǎo)委員會(huì)制定了一系列單獨(dú)的標(biāo)準(zhǔn)，并將其重新應(yīng)用于原始數(shù)據(jù)中。表1包含了協(xié)作組依據(jù)臨床相關(guān)性而用來(lái)定義涂片陽(yáng)性（異常發(fā)現(xiàn)）的標(biāo)準(zhǔn)。先對(duì)所有實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)進(jìn)行單獨(dú)分析，然后再將所有實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)匯總分析。指導(dǎo)委員會(huì)對(duì)所有的數(shù)據(jù)進(jìn)行回顧，比較使用各條規(guī)則對(duì)外周血進(jìn)行涂片鏡檢時(shí)的觀察結(jié)果。如果符合某條規(guī)則，并且鏡

11、檢也有陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)，那么這個(gè)標(biāo)本就本定義為真陽(yáng)性；如果符合某條規(guī)則，但是鏡檢并沒(méi)有陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)，那么這個(gè)標(biāo)本就本定義為假陽(yáng)性；如果不符合某條規(guī)則，但是涂片時(shí)有陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)，則該標(biāo)本被定義為假陰性；如果不符合某條規(guī)則，涂片也無(wú)陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)，則被定義為真陰性。將正確率表格(truth table)發(fā)放給各個(gè)實(shí)驗(yàn)室，然后將來(lái)自所有實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)匯總到表2。結(jié)果：因某些實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有能夠達(dá)到1000個(gè)標(biāo)本的要求，故協(xié)作組（consensus group）共提交了13298個(gè)病人的分析數(shù)據(jù)。參加協(xié)作的單位的血球儀包括：Abbott CellDyn 4000, Bayer ADVIA 120, Beckman Coulter

12、Gens及LH750, Sysmex se-9000及XE2100。雖然各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備和儀器不同，但是為各個(gè)實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備的準(zhǔn)確率表格都是相同的，所有樣本總的正確率結(jié)果見表2。最終的關(guān)于關(guān)于自動(dòng)化血球儀血細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類后復(fù)查的規(guī)則4共有1條，見表3。該表列舉了每個(gè)參數(shù)復(fù)查的標(biāo)準(zhǔn)以及進(jìn)一步的操作建議。列舉出來(lái)的規(guī)則有針對(duì)初次檢查的標(biāo)本，也有針對(duì)二次檢查的標(biāo)本。關(guān)于“差值規(guī)則（delta rules）”一詞的定義見表4。在41條規(guī)則中，15條規(guī)則和血細(xì)胞計(jì)數(shù)有關(guān)；7條規(guī)則是關(guān)于5種白細(xì)胞的分類參數(shù)的；7條是關(guān)于儀器可疑的圖象或者代碼的（包括紅細(xì)胞和血小板）；10條是關(guān)于白細(xì)胞可疑的圖象或者代碼的，2

13、條是和網(wǎng)織紅細(xì)胞有關(guān)的。討論數(shù)據(jù)分析表明：雖然本研究使用了來(lái)自不同實(shí)驗(yàn)室的品牌各不相同的血球儀，但是所有的實(shí)驗(yàn)室都有相似的正確率表格。這對(duì)于假陰性范圍的統(tǒng)計(jì)是十分重要的。指導(dǎo)委員會(huì)意識(shí)到制定一個(gè)良好的復(fù)查標(biāo)準(zhǔn)，以在涂片上找到陽(yáng)性結(jié)果，對(duì)于制定正確率表格來(lái)說(shuō)是十分重要的。為了讓這些標(biāo)準(zhǔn)更客觀，更有意義，我們將涂片鏡檢與其臨床意義聯(lián)系起來(lái)考慮。顯然，將所有的不異常發(fā)現(xiàn)都標(biāo)記上是不恰當(dāng)?shù)?，如大血小板，偶見?xì)胞破裂（occasional schistocyte），輕微的細(xì)胞分布不均或者細(xì)胞不規(guī)則(slight anisocytosis and poikilocytosis)等可能的異常發(fā)現(xiàn)。我們制定了

14、一系列在我們看來(lái)是臨床意義很大的鏡檢發(fā)現(xiàn)（見表一）。使用達(dá)成共識(shí)的規(guī)則（consensus rules），各個(gè)實(shí)驗(yàn)室總的假陰性率只有2.9%（386/13298）。而使用各個(gè)實(shí)驗(yàn)室自己的標(biāo)準(zhǔn)，假陰性率也只有3.8%（503/13298）。所以達(dá)成共識(shí)的規(guī)則的假陰性率和各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的規(guī)則比起來(lái)，似乎沒(méi)有多少改進(jìn)。重要的是我們認(rèn)識(shí)到各個(gè)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)在使用共識(shí)規(guī)則里的某些條款了。假陰性率的推導(dǎo)和計(jì)算見表5。18.6%的假陽(yáng)性率和各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的規(guī)則比起來(lái)也相似。假陽(yáng)性率主要是通過(guò)各個(gè)儀器的圖形判斷的。這可以通過(guò)本研究所采用的儀器得出來(lái)，這些儀器也代表了目前廣泛應(yīng)用于血液學(xué)實(shí)驗(yàn)室的多參數(shù)的血細(xì)胞分析儀。這些儀

15、器作為一個(gè)粗篩的設(shè)備，通過(guò)圖形對(duì)異常的標(biāo)本做進(jìn)一步的復(fù)查。為了避免漏掉一些潛在的重要的異常發(fā)現(xiàn)，減少假陰性率，這些儀器在設(shè)計(jì)可以圖象的符合標(biāo)準(zhǔn)時(shí)都有較高的假陽(yáng)性率。在數(shù)據(jù)分析完成之后，對(duì)這些規(guī)則進(jìn)行回顧，分析哪些規(guī)則較容易出現(xiàn)以及他們出現(xiàn)的頻率。我們發(fā)現(xiàn)有3條規(guī)則在13298例標(biāo)本中都沒(méi)有出現(xiàn)過(guò)。正因如此，很有可能他們?cè)谘騼x的日常工作中出現(xiàn)的幾率就不高。此外，聯(lián)系到臨床意義，我們認(rèn)為不管是在研究中還是在臨床實(shí)踐中，其意義不大，所以這些規(guī)則被去掉了。我們通過(guò)結(jié)合“相同參數(shù)（like parameter）”個(gè)人的理解可能是儀器提示PLT聚集），不論計(jì)數(shù)，首先應(yīng)該檢查標(biāo)本有無(wú)凝塊，其次應(yīng)該涂片鏡檢

16、估計(jì)PLT計(jì)數(shù)，如果繼續(xù)聚集，執(zhí)行實(shí)驗(yàn)室SOP。31，血小板直方圖異常（血小板聚集引起的除外），應(yīng)該涂片鏡檢。32，有不成熟粒細(xì)胞（儀器圖像判斷），且為首次檢查時(shí)，應(yīng)該涂片鏡檢。33，有不成熟粒細(xì)胞（儀器圖像判斷），34，有核左移的圖像（儀器圖像判斷或者提示），應(yīng)該執(zhí)行實(shí)驗(yàn)室SOP。35，有異型（變異）淋巴細(xì)胞圖像（儀器提示有異淋），且為首次檢查時(shí)，應(yīng)該涂片鏡檢。36，有異型（變異）淋巴細(xì)胞圖像（儀器提示有異淋），以前證實(shí)過(guò)結(jié)果，但是WBC陽(yáng)性差值失敗，應(yīng)該涂片鏡檢（希望專家能解釋一下本條規(guī)則-譯者）。37，有原始細(xì)胞圖像（儀器提示有原始細(xì)胞），且為首次檢查時(shí)，應(yīng)該涂片鏡檢。38，有原始細(xì)胞圖像（儀器提