黃芪提取物對(duì)四氯化碳致大鼠肝纖維化保護(hù)作用的研究

1、黃芪提取物對(duì)四氯化碳致大鼠肝纖維化保護(hù)作用的研究許貞愛(ài) ，張紅英*，（1延邊大學(xué)附屬醫(yī)院門診辦公室，2延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心，吉林 延吉，133002） 摘要 目的：研究黃芪提取物對(duì)四氯化碳（CCL4）致大鼠肝纖維化的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法：設(shè)立正常對(duì)照組、模型組、黃芪提取物（4g/kg，2g/kg）組，以四氯化碳(CCL4)皮下注射復(fù)制大鼠肝纖維化模型，用賴氏法測(cè)定大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的活性，用放免法測(cè)定大鼠血清透明質(zhì)酸(HA)和腫瘤壞死因子(TNF-2)的含量，并觀察肝臟病理變化。結(jié)果：黃芪提取物可明顯降低CCL4致大鼠肝纖維化血

2、清ALT和AST活性，降低HA和TNF-2含量；病理結(jié)果顯示，黃芪提取物可明顯減輕大鼠肝纖維化的肝損傷程度。結(jié)論：黃芪提取物有明顯的保肝和抗肝纖維化作用，其作用機(jī)制可能與降低HA和TNF-2含量有關(guān)。關(guān)鍵詞 黃芪； 肝纖維化； 四氯化碳；透明質(zhì)酸；腫瘤壞死因子中圖分類號(hào)：R S646-19；文獻(xiàn)標(biāo)示碼：AProtective Effect of Extracts from Astragalus Root on Liver Fibrosis by CCL4 in Rats Xu zhen-aiZhang hong-ying*（1.Outpatient Office of Yanbian Univ

3、ersity Affiliated Hospital）（2 Test Center of Function，Yanbian University College of Basic Medicine，Yanji 133000, Jilin, China）Abstract Objective：To investigate protective effect of extracts from Astragalus Root and possible mechanisms its protection on liver fibrosis by CCL4 in rats. Methods: It is

4、set up(2g/kg, 4g/kg) groups. It is copyed the model of liver fibrosis by CCL4 subcutaneous injection in rats. It is determined the activity of ALT, AST in rats with Yoriuji method. It is determined the serum levels of HA and TNF-2 with radio-immunity method.The pathology changes of liver were observ

5、ed. Results：Extracts from Astragalus Root was decreased to can significantly the activity of ALT and AST by CCL4 induces in rats. Results of pathology showed that the extracts from Astragalus Root could significantly decrease liver injury of fibrosis in rats. Conclusion: The extracts from Astragalus

6、 Root have significant protective liver and antifibrosis in rats. The mechanisms its protective effect may be related to decrease level of HA、TNF-2.Key words Astragalus Root，liver fibrosis，CCL4，hyaluronic acid, TNF-2 1 21 2*肝纖維化是多種慢性肝病發(fā)展為肝硬化的前期階段。盡管肝硬化的病理改變具有不可逆性, 但是研究表明肝纖維是一個(gè)相對(duì)可逆的病理過(guò)程。在肝纖維化階段進(jìn)行干預(yù)可能

7、是防治肝硬化的有效途徑1。阻斷肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展，對(duì)防治肝硬化和慢性肝病具有重要意義。為此，尋找安全有效的抗肝纖維化藥物是治療慢性肝病的當(dāng)務(wù)之急。在抗肝纖維化的眾多藥物中，中藥黃芪及其復(fù)方制劑是一類有很大發(fā)展?jié)摿Φ乃幬?。以往的?dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芪具有抑制肝組織膠原沉積和防治肝纖維化的作用，還可改善肝臟微循環(huán)，增強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能，促進(jìn)肝再生。然而有關(guān)其抗肝纖維化的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究2。本研究用CCL4制備大鼠肝纖維化模型，觀察了黃芪提取物對(duì)ALT、 AST、HA、 TNF-2及肝臟病理變化，以探討抗肝纖維化治療的新途徑。1材料與方法1.1動(dòng)物藥品與試劑 Wistar大鼠 體重160

8、g200g，雌雄各半，由長(zhǎng)春醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)101022）。黃芪購(gòu)置延邊大學(xué)附屬醫(yī)院中藥局。黃芪提取物的制備：取黃芪600g粉碎用蒸餾水3000ml,冷水浸泡24h后，加熱煮沸30 min，傾出上清液，以此方法煮沸共3次，合并3次上清液，小火濃縮至150 ml，制備成含生藥4gml 的藥液，待涼后用濾紙過(guò)濾，放人冰箱備用，臨用前配成所需濃度。TNF-2試劑盒由北京東雅生物技術(shù)研究所提供（批號(hào)20060512）；HA試劑盒由上海海軍醫(yī)學(xué)研究所提供（批號(hào)20060502）；ALT 、AST、試劑盒購(gòu)置南京建成生物工程研究所；CCL4分析純由天津市塘沽區(qū)新發(fā)化工有限公司生產(chǎn)（2

9、0060526）；花生油由山東魯花集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：3700/16036；乙醇由北京化工廠生產(chǎn)。1.2儀器：日立7150全自動(dòng)生化分析儀（日本產(chǎn)）；FJ-2008P全自動(dòng)放射免疫計(jì)數(shù)器（西安國(guó)營(yíng)262廠生產(chǎn)）；電子稱（YP600型）上海精密儀器有限公司生產(chǎn)。3-51.3 肝纖維化模型制備：除正常組外，其他各組大鼠均從第1天開始頸背部皮下注射CCL4分析純?cè)?.5ml/100g，正常組皮下注射等體積生理鹽水。以后每周2次皮下注射40CCL4色拉油溶液3ml/kg共7周，正常組皮下注射等體積的生理鹽水。1.4 隨機(jī)分組與給藥：把造模好肝纖維化大鼠，隨機(jī)分為黃芪提取物（4g/kg，2g/kg

10、）組，CCL4模型組，每組10只。正常組為空白組。造模結(jié)束第2天開始給藥。正常組和CCL4模型組灌胃給蒸餾水，藥物組灌胃給黃芪提取物（4g/kg，2g/kg），每天1次 ，連續(xù)灌胃給藥30天。各組均飲用自來(lái)水，食用普通塊狀飼料。為維持刺激除正常對(duì)照組外，每周按0.3ml/100g體重皮下注射1次40%CCL4色拉油溶液，第11周末次給藥1小時(shí)后用乙醚麻醉眼球采血取血清測(cè)ALT、AST、HA、TNF-2，取肝臟做病理學(xué)檢查。1.5 觀察指標(biāo)及測(cè)定方法：肝功能：取大鼠血清測(cè)定ALT、AST；肝纖維化：取大鼠血清用放免法測(cè)定HA 、TNF-2的含量。肝臟病理學(xué)檢查：取肝左葉以10甲醛固定，常規(guī)脫水，

11、石蠟包埋，切片、HE染色后，在光鏡下觀察肝纖維化，肝細(xì)胞變性及壞死等病變。6-81.6 肝臟病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：肝細(xì)胞變性、壞死。纖維組織增生程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參考有關(guān)文獻(xiàn)肝細(xì)胞脂肪變性：大量肝細(xì)胞（50）內(nèi)出現(xiàn)空泡（+），多數(shù)肝細(xì)胞（2550）內(nèi)出現(xiàn)空泡（+），部分肝細(xì)胞（25）內(nèi)出現(xiàn)大小不等的圓形空泡，散在分布（+），無(wú)變化者為（0）。肝細(xì)胞壞死：肝細(xì)胞呈點(diǎn)灶狀壞死，或見橋接壞死，彌散分布（+）；分布范圍較廣（+），散在分布（+），無(wú)變化者為（0）。肝纖維組織增生：膠原纖維呈較寬的條索狀分隔肝小葉，膠原纖維明顯增加，表現(xiàn)為完全分隔成假小葉（+），膠原纖維呈細(xì)條索狀分隔肝小葉，散在分布，表現(xiàn)為不完全假小

12、葉（+），膠原纖維含量增加，很少形成條索分隔肝小葉，可見匯管區(qū)擴(kuò)大，纖維化（+），無(wú)變化者為（0）。1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，采用SSPS11.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，等級(jí)資料進(jìn)行秩和檢驗(yàn)。 2 結(jié)果2.1 對(duì)CCL4致大鼠肝纖維化血清ALT、AST活性的影響 與正常組相比，模型組血清ALT、AST的活性明顯升高（p0.01），與模型組相比，黃芪提取物（4g/kg、2g/kg）組血清ALT、AST活性明顯降低（p0.01），結(jié)果見表1。表1 黃芪提取物對(duì)CCL4致大鼠肝纖維化血清ALT、AST活性的影響（s） 組別正常組

13、模型組藥物組 動(dòng)物數(shù) （只） 10 10 10 劑量 （g/kg） 4 AST （卡門氏單位） 50.8616.55 727.0064.08 79.4019.05* ALT （卡門氏單位） 162.29.34.07 617.25104.59 167.4032.21*藥物組 10 2 104.3046.42* 200.6071.70*與模型組相比*P0.01；與對(duì)照組相比P0.012.2 對(duì)CCL4致大鼠肝纖維化血清HA 、TFN-2含量的影響 與正常組相比，模型組血清HA含量明顯升高(P0.01)，與模型組相比，黃芪提取物（4g/kg）組血清HA含量明顯降低（p0.05）；與正常組相比，模型組

14、血清TNF-2含量明顯升高(P0.01)，與模型組相比，黃芪提取物（4g/kg，2g/kg）組血清TNF-2含量明顯降低 (P0.05，P0.01)，結(jié)果見表2。 表2 黃芪提取物對(duì)CCL4致大鼠肝纖維化血清HA 和TNF-2含量的影響（s） 組別正常組模型組藥物組藥物組 動(dòng)物數(shù) （只） 10 10 10 10 劑量 （g/kg） 4 2 HA （ug/L） TNF-2 （ug/L） 161.0272.38 328.2170.68 241.8877.77* 300.00166.83 0.880.28 1.220.24 0.950.20* 1.000.13*與模型組相比*P0.05，*P0.01

15、；與對(duì)照組相比P0.012.3 對(duì)CCL4致大鼠肝纖維化肝組織病理變化的影響 肉眼觀察結(jié)果：正常組的大鼠肝臟顏色暗紅，質(zhì)軟；模型組大鼠肝臟色暗黃、灰，質(zhì)韌，表面凹凸不平；有大小不等的顆粒狀，藥物組的大鼠肝臟色暗紅，表面尚光滑。 光鏡下：正常組的大鼠肝臟無(wú)明顯病理改變，其它各組大鼠均有不同程度的肝細(xì)胞脂肪變性，點(diǎn)灶狀及橋接壞死，肝間質(zhì)纖維組織增生等形態(tài)改變。黃芪提取物能明顯減輕CCL4致肝細(xì)胞脂肪變性(P0.01)；黃芪提取物能明顯減輕CCL4致肝細(xì)胞壞死(P0.05)；黃芪提取物能明顯減輕CCL4致纖維組織增生(P0.01)，結(jié)果見表3。表3 黃芪提取物對(duì)CCL4致大鼠肝纖維化肝組織病理變化的

16、影響組別動(dòng)物數(shù) (只) 劑量 （g/kg） 不同等級(jí)肝細(xì)胞病理改變的動(dòng)物數(shù) 肝細(xì)胞脂肪變性 肝細(xì)胞壞死 纖維組織增生0 + + + 0 + + + 0 + + +10 0 0 0 10 0 0 0 10 0 0 00 0 2 8 0 1 5 4 0 1 5 42 8 0 0 * 0 8 2 0 * 4 4 2 0*6 4 0 0 0 6 4 0* 1 5 4 0* 正常組 模型組 藥物組 藥物組 10 10 10 10 4 2與模型組相比*P0.05,*P0.01,與對(duì)照組相比P0.013 討論肝纖維化與肝細(xì)胞的損傷密切相關(guān)，各種肝細(xì)胞損傷都可導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞的激活，后者能夠分泌以膠原纖維為主的

17、細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)肝纖維化發(fā)生發(fā)展，所以肝細(xì)胞損傷是肝纖維化的啟動(dòng)因素9-11。治療肝纖維化是防治慢性肝病發(fā)展為肝硬化的重要手段。尋找有效抗肝纖維化的藥物是研究熱點(diǎn)在抗肝纖維化的眾多藥物中，中藥黃芪及其復(fù)方制劑是一類有很大發(fā)展?jié)摿Φ乃幬?。黃芪能夠減少免疫損傷所致肝內(nèi)膠原成分的異常沉積，對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化有明顯的治療作用。且隨著療程的延長(zhǎng)，其作用有所增強(qiáng)12-13 。本文采用CCL4制備肝纖維化模型，結(jié)果顯示模型組肝細(xì)胞廣泛變性壞死，纖維組織增生明顯，將肝小葉分隔成大小不等的肝細(xì)胞團(tuán)。CCL4誘導(dǎo)慢性肝損傷的機(jī)理是直接損害肝細(xì)胞，破壞細(xì)胞的各種成份，具有耗時(shí)短和病變典型的優(yōu)點(diǎn)，肝纖維化進(jìn)展穩(wěn)定。適合

18、于以引起肝細(xì)胞損傷為始動(dòng)機(jī)制的肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程的動(dòng)態(tài)研究。本實(shí)驗(yàn)CCL4造模成功，肝細(xì)胞膜改變明顯，從而使細(xì)胞內(nèi)酶谷丙轉(zhuǎn)氨酶與谷草轉(zhuǎn)氨酶外漏入血，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶與谷草轉(zhuǎn)氨酶活性升高，它們是反映肝細(xì)胞損傷的靈敏指標(biāo)。其升高在一定程度上說(shuō)明了肝臟受損的程度10。本實(shí)驗(yàn)探討了黃芪提取物對(duì)CCL4致肝纖維化大鼠血清ALT和AST活性的變化，結(jié)果表明，CCL4模型組小鼠血清中ALT、AST升高，給予黃芪提取物的大鼠AST、ALT與模型組相比有差異，可見黃芪提取物對(duì)CCL4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠有保護(hù)作用。14現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明, CCL4可以激活肝星狀細(xì)胞，使HA等細(xì)胞外基質(zhì)合成增多，促使肝纖維化的形成和

19、加重 ，HA是反映肝活動(dòng)性纖維化常用的定量指標(biāo)。肝纖維化程度與HA指標(biāo)升高程度成正比關(guān)系。HA可以反映肝纖維化的發(fā)展變化，在判斷肝纖維化活動(dòng)中有很高的意義。與模型組相比，黃芪提取物可明顯降低HA的含量。TNF-2主要來(lái)源于單核細(xì)胞,在166肝臟有炎性損傷時(shí)，也可來(lái)源于炎癥區(qū)的肝細(xì)胞,它能激活多種免疫細(xì)胞,增強(qiáng)炎癥活動(dòng)717度，并可直接損傷肝細(xì)胞，又可直接刺激貯脂細(xì)胞增生ECM的合成。與模型組相比，黃芪提取物可明顯降低TNF-2的含量。本實(shí)驗(yàn)對(duì)黃芪提取物抗肝纖維化的機(jī)制進(jìn)行了初步研究，通過(guò)觀察黃芪提取物對(duì)肝纖維化HA、TNF-2的含量，來(lái)探討黃芪提取物抗肝纖維化的作用機(jī)制。從肝組織病理學(xué)、HA、

20、TNF-2的含量等方面證實(shí)黃芪提取物可以抗CCL4致肝纖維化，黃芪提取物在抑制大鼠肝纖維化過(guò)程中，可降低血清ALT、AST活性，使肝細(xì)胞損傷減輕，肝功能明顯得到改善。黃芪提取物可以使HA、TNF-2的含量降低，肝纖維化程度明顯減輕，提示黃芪提取物具有抗肝纖維化作用。病理結(jié)果顯示，肝細(xì)胞脂肪變性；肝細(xì)胞壞死；纖維組織增生過(guò)程明顯好于模型組。 綜上所述，黃芪提取物可顯著減輕CCL4致大鼠肝纖維化程度，明顯降低血清ALT、AST活性和HA、TNF-2含量；改善肝功能，清除肝臟炎癥，抗肝纖維化，調(diào)節(jié)免疫功能，病理學(xué)檢查也顯示具有抗纖維化作用。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可推測(cè)黃芪提取物的抗肝纖維化可能機(jī)制與降低HA和T

21、NF-2含量有關(guān)。說(shuō)明了黃芪提取物參與了ECM的代謝過(guò)程，抑制肝細(xì)胞局部炎癥反映，減輕肝細(xì)胞變性、壞死、增生。參考文獻(xiàn)1 馮學(xué)欣，馮騰，王莉，等.黃茂對(duì)肝纖維化大鼠NF-kB的調(diào)節(jié)作用J.濰坊醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，30（6）：5282 王登妮，徐軍全，宋維芳，等.黃芪對(duì)肝纖維化的防治作用J.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)， 2010，7（9）：153 付沛藩，小兒乙肝顆粒對(duì)大鼠肝纖維化的防治作用【J】中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志19999(3)：254 王禎苓四種中藥預(yù)防肝硬變發(fā)生的實(shí)驗(yàn)研究【J】中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志、200212(6)：3575 楊彥芳王氏抗肝纖方治療肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究【J】中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志

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