損毀帕金森病大鼠腹側(cè)蒼白球?qū)y狀體內(nèi)谷氨酸含量的影響

1、損毀帕金森病大鼠腹側(cè)蒼白球?qū)y狀體內(nèi)谷氨酸含量的影響    作者：曾水林，李濤，楊鵬，康學(xué)軍，蕭靜，黃曉，劉俊華    【關(guān)鍵詞】 帕金森病    Content changes of glutamic acid in striatum induced by lesion of ventral pallidum in rats with Parkinsons disease    【Abstract】 AIM: To observe t

2、he content changes of glutamic acid (Glu) in the striatum after lesion of ventral pallidum (VP) in Parkinsons disease (PD) rats. METHODS: The model of PD was made by injecting 6hydroxydopamine (6OHDA) into the left substantia nigra pars compacta (SNc) and ventral tegmental area (VTA) of the rats. Af

3、ter damaging VP of the PD rats, we observed the changes of rotation behavior and detected the content of Glu in striatum by high pressure liquid chromatography (HPLC) with fluorescence detection analysis. RESULTS: After lesion of VP, the rotating behavior decreased markedly, and the content of Glu i

4、n striatum (g/g) (3.0±0.4) was higher than that in normal (2.2±0.7), model (1.3±0.2) and sham groups (1.4±0.4)（P<0.05）. It reached the peak at 2nd week then subsided, but still higher than that in other groups. CONCLUSION: Lesion of VP can block the release of Glu or check its

5、 combination with its receptors, thus reducing the neural toxicity of Glu. These effects may be beneficial for the treatment of PD. 【Keywords】 Parkinsons disease; ventral pallidum; glutamic acid; rats 【摘要】 目的： 觀察腹側(cè)蒼白球(VP)損毀后帕金森病(PD)大鼠紋狀體內(nèi)谷氨酸(Glu)含量的變化. 方法： 應(yīng)用6羥基多巴胺(6OHDA)制備偏側(cè)PD大鼠模型，插入電極直流電毀損VP，觀察毀損后

6、PD大鼠的旋轉(zhuǎn)行為，應(yīng)用高效液相色譜檢測(cè)紋狀體內(nèi)Glu的含量. 結(jié)果： VP損毀術(shù)后PD大鼠偏側(cè)旋轉(zhuǎn)行為明顯改善,紋狀體內(nèi)Glu的含量(g/g) (3.0±0.4)比正常對(duì)照組(2.2±0.7) 、模型對(duì)照組(1.3±0.2)和假手術(shù)組(1.4±0.4)都要高（P<0.05），在術(shù)后第2周時(shí)達(dá)高峰，以后逐漸下降，但仍高于其他三組. 結(jié)論： VP毀損可能會(huì)減少Glu的釋放或與其受體的結(jié)合，從而對(duì)神經(jīng)元的毒性作用減弱，有助于PD癥狀的改善. 【關(guān)鍵詞】帕金森??；腹側(cè)蒼白球；谷氨酸；大鼠 0引言 帕金森病(Parkinsons disease, PD)是

7、中老年中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性變疾病. 用微電極導(dǎo)向核團(tuán)毀損術(shù)治療PD，具有顯著改善其癥狀、損傷小、副作用少等優(yōu)點(diǎn)，因而對(duì)于用藥物難以控制的中晚期PD患者，這種方法已成為首選的治療手段. 近年來的研究表明，興奮性通路對(duì)控制PD運(yùn)動(dòng)癥狀起關(guān)鍵性的作用. 本實(shí)驗(yàn)我們探討直流電毀損腹側(cè)蒼白球(ventral pallidum, VP) 治療PD的效果及作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用核團(tuán)毀損術(shù)治療PD提供理論依據(jù). 1材料和方法 1.1材料 健康SD大鼠60只，雌雄不拘，體質(zhì)量200300 g. 用4 g/L戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，固定于江灣型腦立體定位儀，根據(jù)Paxinos等1腦立體定向圖譜，按照

8、文獻(xiàn)2制備PD大鼠模型. 選取平均轉(zhuǎn)速在7圈/min以上者，為合格PD模型大鼠，共計(jì)46只，分為3組. VP毀損組(VP)28只，常規(guī)麻醉、消毒、固定于腦立體定位儀上，根據(jù)上述腦立體定向圖譜，確定VP的坐標(biāo)： 前囟后0.4 mm，中線旁開2.6 mm，硬膜下8.0 mm. 鉆開顱骨，暴露硬膜，以鎢微電極（FHC, USA；尖端直徑0.25 mm，外套一自制的玻璃微電極，僅尖端暴露0.5 mm，以保證毀損部位局限在靶區(qū)）插入左側(cè)VP，用直流電凝固法毀損VP. 毀損參數(shù)： 電極接陽性，陰極接大鼠左后肢，電流1 mA，通電時(shí)間15 s，為保證大鼠在術(shù)中不出現(xiàn)肌肉抽動(dòng)行為，可適當(dāng)調(diào)整電流的大小. 假手

9、術(shù)組(Sham)12只，只作麻醉、消毒、固定于立體定位儀，在以上坐標(biāo)位顱骨鉆孔，VP處插入相同電極，但不進(jìn)行直流電凝固法毀損. 模型對(duì)照組(Model)6只，不進(jìn)行任何處理. 另取6只正常大鼠設(shè)為正常對(duì)照組(Normal). VP毀損組和假手術(shù)組的大鼠均于術(shù)后2 mo內(nèi)進(jìn)行25次阿樸嗎啡(apomorphine, APO)誘導(dǎo)的行為測(cè)試2. VP毀損組中凡旋轉(zhuǎn)行為手術(shù)前后自身對(duì)照有明顯改善的大鼠記為成功毀損大鼠，而旋轉(zhuǎn)行為沒有明顯改善的棄用. 經(jīng)篩選符合要求的VP毀損大鼠共24只. 1.2方法 各組大鼠于行為測(cè)試完畢后，快速斷頭處死，冰皿上迅速分離紋狀體，稱質(zhì)量，置液氮保存. 檢測(cè)時(shí)加入40

10、g/L的高氯酸200 L制備勻漿，定容至1 mL后加入10 g/L苯胺100 L, 4低溫離心12 290 g, 30 min，取上清液加丹酰氯(Sigma)衍生后加潘生丁(Sigma)內(nèi)標(biāo)，離心(4低溫離心12 290 g, 10 min)，取上清液20 L用于高壓液相色譜熒光檢測(cè)谷氨酸（glutamic acid, Glu)含量. 色譜條件： 色譜儀(島津LC10AD)，熒光檢測(cè)器（島津RF530），色譜柱為C18柱(北京康林科技有限公司，Kromasil C18, 250.0 mm×4.6 mm, 5 m)，流動(dòng)相： 甲醇50 mmol/L,醋酸鈉50 mmol/L, （11，

11、其中含四氫呋喃）；激發(fā)波長為360 nm，發(fā)射波長為500 nm；流速1 mL/min. 檢測(cè)工作電壓為0.7 V，檢測(cè)靈敏度為20 pg. 經(jīng)HE染色后，在光鏡下對(duì)VP毀損組毀損區(qū)進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，同時(shí)判定毀損靶點(diǎn)是否準(zhǔn)確. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 數(shù)據(jù)用x±s表示，所獲數(shù)據(jù)采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 2結(jié)果 2.1VP毀損后對(duì)PD大鼠旋轉(zhuǎn)行為的影響各組大鼠均于術(shù)后2 mo內(nèi)進(jìn)行25次旋轉(zhuǎn)行為測(cè)試，結(jié)果顯示： 第8周時(shí)，Model組為10.3±2.9， Sham組為9.6±1.3， VP毀損組為4.4±2.0. Mo

12、del，Sham和VP毀損組在各自組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)比較差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Model組和Sham組間比較差別亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而VP毀損與Model和Sham組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05). 2.2HE染色毀損區(qū)中心有組織脫落，周圍呈現(xiàn)均質(zhì)狀紅色染色，無細(xì)胞結(jié)構(gòu)，外周有大量炎性細(xì)胞浸潤. 2.3紋狀體內(nèi)Glu含量(g/g)8 wk時(shí)Normal組為2.2±0.7, Model組為1.3±0.2, Sham組為1.4±0.4, VP毀損組為3.0±0.4. Normal組高于Model和Sham組（P<0.05）; Model和Sham之間差別

13、無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); VP毀損組比Normal, Model和Sham三組都要高（P<0.05），在術(shù)后2 wk時(shí)達(dá)高峰3.3±0.8，而后逐漸下降，但仍高于其他三組.    3討論 中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)有興奮性和抑制性兩種，興奮性遞質(zhì)以Glu為代表，抑制性遞質(zhì)以氨基丁酸（gamma aminobutyric acid,GABA）為代表. Glu是“皮質(zhì)紋狀體底丘腦”通路3,4中興奮性神經(jīng)元突觸的主要神經(jīng)遞質(zhì)，同時(shí)又是一種神經(jīng)毒素. 它通常以囊泡形式貯存于突觸前終末內(nèi)，依賴Ca2 調(diào)節(jié)而釋放入突觸間隙，作用于相

14、應(yīng)受體并發(fā)揮其功能. 一般認(rèn)為細(xì)胞外液中沒有使Glu失活的水解酶系統(tǒng)，因此從神經(jīng)末梢釋放的Glu的清除和失活，唯一途徑是通過位于突觸前膜和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞膜上的興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（excitatory amino acids transporters,EAAT）的攝取而實(shí)現(xiàn). PD時(shí)紋狀體內(nèi)Glu是升高還是降低，至今仍存在爭議. Espino等認(rèn)為PD時(shí)紋狀體內(nèi)Glu升高，當(dāng)Glu濃度增高時(shí)，形成對(duì)N甲基D天冬氨酸（NmethyDaspartate, NMDA）受體的爆發(fā)性占領(lǐng)，NMDA受體過度激活，導(dǎo)致大量Na , Ca2 持續(xù)內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)Ca2 超載，線粒體呼吸鏈功能受損，引起多巴胺能神經(jīng)元的

15、遲發(fā)性變性和壞死，進(jìn)而出現(xiàn)PD癥狀. 臨床上以NMDA受體拮抗劑用于局部或全身后能改善PD的癥狀，又進(jìn)一步支持了該推測(cè). 而Tohgi等和Mally等的研究顯示PD患者的腦脊液中Glu的含量下降(P<0.01)，而血清中含量卻沒有變化. 雖然腦脊液中Glu的含量與腦組織內(nèi)的含量可能不完全相同，但也從側(cè)面表明他們對(duì)PD時(shí)Glu含量是否增加持不同意見. 我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中觀察到PD大鼠紋狀體內(nèi)Glu的含量明顯低于正常大鼠. Glu是腦內(nèi)含量較高的神經(jīng)遞質(zhì)之一，它的釋放受多種因素調(diào)節(jié)，如離子通道等. Glu在體內(nèi)有代謝庫和遞質(zhì)庫之分，代謝庫的Glu可以作為中間代謝產(chǎn)物參與物質(zhì)能量代謝；遞質(zhì)庫是指貯存

16、于末梢突觸小泡內(nèi)的Glu. 造成細(xì)胞外液Glu濃度升高的原因可能與突觸后膜攝取功能下降有關(guān). 釋放到組織中的Glu，大部分聚積在突觸間隙或彌散到細(xì)胞外液，少數(shù)經(jīng)淋巴液丟失，所以在組織Glu代謝庫和遞質(zhì)庫不變的情況下，神經(jīng)元釋放的Glu越多，則組織內(nèi)的Glu下降越明顯，這也就解釋了PD患者血清中Glu升高而腦脊液中下降的原因. 在PD模型中，DA的大量減少，其抑制性作用大幅下降，造成了組織中Glu的釋放增加，同時(shí)Glu與其受體結(jié)合，造成神經(jīng)毒性作用，而紋狀體內(nèi)檢測(cè)到的Glu則減少，這與興奮性氨基酸的毒性作用機(jī)制相吻合. 并且有研究5顯示PD大鼠的Glu下降，除了發(fā)生在紋狀體以外，還出現(xiàn)在大腦皮質(zhì)

17、和海馬，并引發(fā)了相應(yīng)的癥候.    在基底核中，底丘腦核(Subthalamic nucleus, STN)發(fā)出Glu能神經(jīng)纖維至蒼白球，PD時(shí)這一通路的興奮性增加6，從而導(dǎo)致蒼白球的過度興奮，所以臨床上PD的外科治療主要針對(duì)STN的深部腦刺激或?qū)ιn白球進(jìn)行毀損以改善PD癥狀7. 我們觀察到VP毀損術(shù)后紋狀體內(nèi)Glu的含量比模型對(duì)照組高，甚至高于正常組，在第2周時(shí)達(dá)到最高峰，而后逐漸下降，直至第8周仍高于正常組，而假手術(shù)組則沒有變化. 結(jié)合PD大鼠的旋轉(zhuǎn)行為明顯改善，可以由此推測(cè)VP的毀損并沒有改變PD大鼠紋狀體內(nèi)Glu的總量，但是手術(shù)的刺激作用可能會(huì)減

18、少Glu釋放或阻礙其與受體的結(jié)合，從而對(duì)神經(jīng)元的毒性作用也減弱. 【參考文獻(xiàn)】 1Paxinos G,Waston C. The rat brain in stereotaxic coordinate M. 2nd, New York: Academic Press Inc, 1985: 2楊鵬,李濤,曾水林,等. 蒼白球腹側(cè)核毀損對(duì)帕金森大鼠旋轉(zhuǎn)行為及紋狀體一氧化氮合酶陽性神經(jīng)元表達(dá)的影響J. 東南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2004;23(2):228-231. Yang P, Li T, Zeng SL, et al. Effects of lesion of VP on the rotation behaviour and nitric oxidesynthase positive neurons in striatum in rats with Parkinsons disease J. J Southeast Univ (Med Sci Edi), 2004; 23(2):228-231. 3劉道寬. 錐體外系疾病M. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2000;1-16. 4Lozano AM. Deep br