酶切位點保護(hù)堿基表

1、酶切位點保護(hù)堿基-PCR引物設(shè)計用于限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)來源:easylabs 發(fā)布時間:2009-11-08 查看次數(shù):12704本文給出了分子克隆中常用限制性內(nèi)切酶的保護(hù)堿基序列,如AccI,A flIII,AscI,AvaI,BamHI,BglII,BssHII,BstEII,BstXI,ClaI,E coRI,HaeIII,HindIII,KpnI,MluI,NcoI,NdeI,NheI,NotI,N siI,PacI,PmeI,PstI,PvuI,SacI,SacII,SalI,ScaI,SmaI,S peI,SphI,StuI,XbaI,XhoI,XmaI,為什么要添加保護(hù)堿基?在

2、分子克隆實驗中,有時我們會在待擴(kuò)增的目的基因片段兩端加上特定的酶切位點,用于后續(xù)的酶切和連接反應(yīng)。由于直接暴露在末端的酶切位點不容易直接被限制性核酸內(nèi)切酶切開,因此在設(shè)計PCR引物時,人為的在酶切位點序列的5端外側(cè)添加額外的堿基序列,即保護(hù)堿基,用來提高將來酶切時的活性。其次,在分子克隆實驗中選擇載體的酶切位點時,相臨的兩個酶切位點往往不能同時使用,因為一個位點切割后留下的堿基過少以至于影響旁邊的酶切位點切割。該如何添加保護(hù)堿基?添加保護(hù)堿基時,最關(guān)心的應(yīng)該是保護(hù)堿基的數(shù)目,而不是種類。什么樣的酶切位點,添加幾個保護(hù)堿基,是有數(shù)據(jù)可以參考的。添加什么保護(hù)堿基,如果嚴(yán)格點,是根據(jù)兩條引物的Tm值

3、和各引物的堿基分布及GC含量。如果某條引物Tm值偏小,GC%較低,添加時多加G或C,反之亦反。為了解不同內(nèi)切酶對識別位點以外最少保護(hù)堿基數(shù)目的要求,NEB采用了一系列含識別序列的短雙鏈寡核苷酸作為酶切底物進(jìn)行實驗。實驗結(jié)果對于確定雙酶切順序?qū)袔椭?比如在多接頭上切割位點很接近時,或者當(dāng)切割位點靠近DNA末端時也很有用。在本表中沒有列出的酶,則通常需在識別位點兩端至少加上6個保護(hù)堿基,以確保酶切反應(yīng)的進(jìn)行。實驗方法:用-32PATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下標(biāo)記0.1A2 60單位的寡核苷酸。取1µg已標(biāo)記了的寡核苷酸與20單位的內(nèi)切酶,在2 0°C條件下分別反應(yīng)2小時和20小時。反應(yīng)緩沖液含70mM Tris-HCl (pH 7.6, 10 mM MgCl2, 5 mMDTT及適量的NaCl或KCl(視酶的具體要求而定。20%的PAGE(7M尿素凝膠電泳分析,經(jīng)放射自顯影確定酶切百分率。本實驗采用自連接的寡核苷酸作為對照。若底物有較長的回文結(jié)構(gòu),切割效率則可能因為出現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)而降低。 注釋:1.如果要加在序列的5端,就在酶切位點識別堿基序列(紅色的5端加上相應(yīng)的堿基(黑色,相同如果要在3端加保護(hù)堿基,就在酶切位點識別堿基