MIP-1α和血小板第4因子對(duì)造血干細(xì)胞化療藥物損傷的保護(hù)作用

1、    MIP-1和血小板第4因子對(duì)造血干細(xì)胞 化療藥物損傷的保護(hù)作用        【摘要】目的研究巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP-1)、血小板第4因子(PF4)及二者聯(lián)合對(duì)造血干細(xì)胞化療藥物損傷的保護(hù)效應(yīng)及其分子機(jī)制。方法將骨髓、臍血單個(gè)核細(xì)胞及白血病細(xì)胞株HL-60分別予MIP-1、PF4、MIP-1+PF4、PBS預(yù)處理48h，再經(jīng)柔紅霉素（DNR）孵育24h后，用錐蟲藍(lán)(臺(tái)盼藍(lán))拒染法測(cè)細(xì)胞活性，用流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞周期及CD34+CD38-細(xì)胞含量，細(xì)胞集落培養(yǎng)

2、、免疫化學(xué)法測(cè)細(xì)胞P16、P27蛋白。結(jié)果經(jīng)MIP-1及PF4預(yù)處理的骨髓和臍血單個(gè)核細(xì)胞，細(xì)胞活性、CD34CD38-細(xì)胞、集落形成能力均比對(duì)照組顯著增加(P<0.05)。MIP-1、PF4組正常臍血及骨髓細(xì)胞S+G2期百分率低于對(duì)照組(P<0.05)。MIP-1可上調(diào)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白P16表達(dá)。PF4對(duì)P16、P27表達(dá)無(wú)影響。MIP-1的保護(hù)作用強(qiáng)于PF4，但兩者無(wú)協(xié)同效應(yīng)。HL-60細(xì)胞P16、P27蛋白表達(dá)、細(xì)胞周期、細(xì)胞活性均不受MIP-1、PF4的影響。結(jié)論造血負(fù)調(diào)控因子MIP-1、PF4能可逆性、選擇性地保護(hù)正常造血細(xì)胞免受化療藥損傷，MIP-1通過(guò)上調(diào)造血祖細(xì)胞G

3、1-S期調(diào)控基因p16表達(dá)，使細(xì)胞阻滯于G0期，提高細(xì)胞對(duì)周期特異性化療藥的耐受性?！娟P(guān)鍵詞】干細(xì)胞因子；造血干細(xì)胞；巨噬細(xì)胞炎性蛋白1；血小板因子4；蛋白質(zhì)p16；蛋白質(zhì)p27 Protection of hematopoietic stem cells by MIP-1 and PF4 against the cytotoxicity of chemotherapeutic agentsHUANG Ke?, HUANG Shaoliang, PAN Jingxuan, et al.（Pediatric Department, Sun Yat-sen Memorial Hospital of

4、 Zhongshan Medical University, Guangzhou510120，China）【Abstract】ObjectiveTo study the protective effects of macrophage inflammatory protein-1(MIP-1) and platelet factor 4(PF4), alone and in combination, on hematopoietic stem/progenitor cells against the cytotoxicity of chemotherapeutic drugs. Methods

5、Bone marrow and cord blood mononuclear cells(BMMNC and CBMNC) and HL-60 cells were pretreated with MIP-1, PF4, MIP-1+ PF4,and PBS respectively for 48 hours, and then incubated with DNR for an additional 24 hours. Cell viability, cell cycle, CD34+ CD38- cells, colony forming units(CFU) and protein ex

6、pression of p16， p27 gene were measured. ResultsCell viability, the number of CD34+ CD38- cells and CFU yields of BMMNC and CBMNC in MIP-1 and PF4 groups were significantly higher than that in control groups(P<0.05). Cells in S+G2 phase in MIP-1and PF4 groups were significantly fewer than that in

7、 control groups(P<0.05). MIP-1 upregulated the expression of p16 gene of stem/progenitor cells. PF4 showed no effects on expression of both p16 and p27 genes. Hematopoietic protection of MIP-1 was stronger than that of PF4. No cooperative effect could be seen in combination of the two agents.Cell

8、 viability, cell cycle and expression of p16 and p27 gene of HL-60 cells were not affected by either MIP-1 or PF4. ConclusionMIP-1 and PF4 can reversibly and selectively protect hematopoietic stem/progenitor cells against cytotoxicity of chemotherapeutic agents. MIP-1 can suppress cell proliferation

9、 by upregulating the expression of p16 gene and block the cell cycle at G0 phase, resulting in the elevation of cell resistance to chemotherapeutic drugs.【Key word】Stem cell factor;Hematopoietic stem cell;Macrophage inflammatory protein-1；Platelet factor 4;Protein p16;Protein p27骨髓造血抑制是腫瘤患者化療過(guò)程中常見(jiàn)的并

10、發(fā)癥。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，血小板第4因子（PF4）、巨噬細(xì)胞炎性蛋白（MIP-1）等造血負(fù)調(diào)控因子對(duì)骨髓造血祖細(xì)胞化療藥物損傷具有保護(hù)作用，能選擇性、可逆性地阻止正常造血祖細(xì)胞于靜止期，提高細(xì)胞對(duì)周期特異性藥物的耐受性1，2。但是，造血負(fù)調(diào)控因子作用的分子機(jī)制目前不十分清楚。我們比較了 MIP-1、PF4單獨(dú)與聯(lián)合應(yīng)用對(duì)骨髓造血細(xì)胞柔紅霉素（DNR）損傷的保護(hù)效應(yīng)及其分子機(jī)制，為其進(jìn)入臨床應(yīng)用提供一定的理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。材料和方法1實(shí)驗(yàn)材料1.1骨髓及臍血單個(gè)核細(xì)胞（MNC）懸液的制備：骨髓標(biāo)本13份來(lái)自本院兒科住院患兒，其中白血病完全緩解期6例，地中海貧血1例，特發(fā)性血小板減少性紫癜2例，淋巴瘤未

11、侵犯骨髓4例。每例抽取骨髓3 ml。臍血標(biāo)本10份，來(lái)自本院產(chǎn)房足月順產(chǎn)新生兒，母嬰均無(wú)疾病。每份臍血以肝素抗凝，留取臍血15ml。于24h內(nèi)骨髓及臍血分別經(jīng)Ficoll分離液分離有核細(xì)胞，再經(jīng)RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌2次，將沉淀細(xì)胞加入含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清（FCS）的RPMI 1640培養(yǎng)液中，充分混勻，制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)有核細(xì)胞。細(xì)胞終濃度2×106/ml，細(xì)胞存活率95%以上，培養(yǎng)24h后備用。1.2HL-60細(xì)胞株：將復(fù)蘇后的HL-60細(xì)胞（中山醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所提供）懸浮于含體積分?jǐn)?shù)為10% FCS的RPMI 1640培養(yǎng)液并移至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，23d傳代1次，細(xì)胞

12、濃度2×106/ml。細(xì)胞存活率95%以上。2實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)分4組，分別為 MIP-1組加入MIP-1（美國(guó)Peprotech公司產(chǎn)品）100ng/ml。因其半衰期短，需每天加藥、PF4組加入PF4（法國(guó)貝特公司）5g/ml、PF4+ MIP-1聯(lián)合組（劑量同前）及空白對(duì)照組（僅加PBS）。HL-60細(xì)胞株作為對(duì)照組。以上各組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔含細(xì)胞數(shù)1×106ml，培養(yǎng)48h，每組取1孔細(xì)胞測(cè)細(xì)胞周期及P16、P27蛋白表達(dá)，剩下每孔細(xì)胞加DNR（1mg/ml）培養(yǎng)24h，取細(xì)胞洗滌后作活性檢測(cè)、造血祖細(xì)胞集落培養(yǎng)及CD34+CD38-細(xì)胞含量的測(cè)定。未經(jīng)因子或PBS預(yù)處理且

13、不接受DNR孵育的細(xì)胞定為預(yù)處理前細(xì)胞。2.1錐蟲藍(lán)(臺(tái)盼藍(lán))拒染法檢測(cè)細(xì)胞活性：以40g/L錐蟲藍(lán)染色細(xì)胞，30s1min后計(jì)算細(xì)胞拒染率，即為細(xì)胞存活率。2.2流式細(xì)胞儀(FACS)測(cè)CD34+CD38-細(xì)胞含量：每份樣品MNC5×104，標(biāo)記抗體（DaK0公司）為PE結(jié)合的CD34抗體和FITC標(biāo)記的CD38抗體，對(duì)照為IgG1-PE和IgG1-FITC。根據(jù)PE和FITC的熒光激發(fā)特性進(jìn)行雙標(biāo)記參數(shù)分析。所用FACS為美國(guó)COULTER公司ELITE型，波長(zhǎng)488nm。2.3體外造血祖細(xì)胞集落培養(yǎng)：按本室常規(guī)法3進(jìn)行粒-巨噬細(xì)胞系集落形成單位（CFU-GM）及混合集落形成單位

14、（CFU-MIX）培養(yǎng)。第714天在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)CFU-GM，第1428天計(jì)數(shù)CFU-MIX。40個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)為一個(gè)集落，CFU-MIX為集落內(nèi)含紅細(xì)胞及巨核樣細(xì)胞、粒系細(xì)胞、巨噬細(xì)胞成分。瑞氏-姬姆薩染色確定細(xì)胞類型并攝片。2.4FACS檢測(cè)細(xì)胞增殖周期（S+G2）：各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)48h，培養(yǎng)液洗滌后調(diào)整細(xì)胞濃度105/ml，以體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇固定過(guò)夜（4），F(xiàn)ACS測(cè)出細(xì)胞各周期的DNA相對(duì)含量和百分率。2.5免疫組織化學(xué)法檢測(cè)P16、P27蛋白的表達(dá)：骨髓及HL-60各組細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌，取細(xì)胞離心涂片待干燥，甲醛固定，采用ABC法（中山生物試劑公司ABC免疫試劑盒

15、，P16、P27鼠抗人單抗為美國(guó)Neomarker公司產(chǎn)品）進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。兩種蛋白均在細(xì)胞漿及細(xì)胞核中表達(dá)，胞漿、胞核見(jiàn)彌漫散在棕色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)顯色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。每片計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，根據(jù)染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)算染色系數(shù)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定量。染色系數(shù)=染色強(qiáng)度×染色細(xì)胞百分率。3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析本實(shí)驗(yàn)資料均以<"0102 (84 字節(jié))" src="/med/cano/201003/20100316190653634" 11 15>±s表示，多組間比較采用隨機(jī)區(qū)組方差分析

16、（Two-way ANOVA）及多個(gè)樣本均數(shù)兩兩比較q檢驗(yàn)（Newman-Keuls法）。結(jié)果1MIP-1及PF4對(duì)骨髓及臍血MNC存活率的影響新鮮骨髓及臍血MNC錐蟲藍(lán)拒染率>95%。MIP-1、PF4、MIP-1+PF4組及空白對(duì)照組的骨髓、臍血MNC孵育48h后，分別加入DNR再孵育24h，結(jié)果加因子組MNC存活率均明顯高于空白對(duì)照組（P值均<0.05），骨髓MNC分別為（79.0±6.0）%，（74.0±9.0)%，（79.0±6.0）%及（48.0±14.0）%，臍血MNC分別為（79.9±5.7）%，（78.2±

17、;4.7）%，（77.0±5.4）%，（59.6±8.3）%，加因子各組間差異均無(wú)顯著性，MIP-1與PF4相加并無(wú)協(xié)同作用。HL-60細(xì)胞各組存活率分別為（28.0±7.0）%，（30.0±5.0）%，（25.0±6.0）%，（35.0±9.0）%，組間差異無(wú)顯著性（P>0.05），均比骨髓及臍血MNC存活率低（P值均<0.05）。2MIP-1及PF4對(duì)骨髓及臍血造血細(xì)胞集落形成的影響由表1，2可見(jiàn)MIP-1及PF4負(fù)調(diào)控因子對(duì)造血祖細(xì)胞集落生長(zhǎng)有明顯影響，加負(fù)調(diào)控因子各組CFU-GM集落數(shù)差異無(wú)顯著性，均明顯少于預(yù)處理

18、前（P值均<0.05），但均明顯高于空白對(duì)照組（P值均<0.05），且集落大，大多數(shù)集落含細(xì)胞數(shù)大于300個(gè)，集落維持時(shí)間長(zhǎng)達(dá)21d以上；空白對(duì)照組大多數(shù)集落含細(xì)胞數(shù)少于100個(gè)，集落大多在第14天松散、溶解。加負(fù)調(diào)控因子各組CFU-MIX集落數(shù)同樣差異無(wú)顯著性，均明顯少于預(yù)處理前（P值均<0.05），但均多于空白對(duì)照組（P值均<0.05），集落大，含細(xì)胞多，集落可維持28d以上；空白對(duì)照組集落小，多在第21天見(jiàn)松散、溶解。MIP-1組骨髓及臍血MNC的CFU-GM、CFU-MIX產(chǎn)率均較PF4組稍有增高，但兩組比較，差異無(wú)顯著性(0.05<P<0.1)。表

19、1MIP-1及PF4對(duì)骨髓造血祖細(xì)胞集落的影響（/2×106，<"0102 (84 字節(jié))" src="/med/cano/201003/20100316190653634" 11 15>±s）組別樣本數(shù)CFU-GMCFU-MIX7d14d21d14d21d28d預(yù)處理前13146.23±67.79121.51±65.2882.70±49.9922.80±10.6430.54±18.6826.60±11.12MIP-11382.23±52.86*90.9

20、0±61.96*69.23±53.78*14.36±5.45*20.31±9.18*19.69±9.38*PF41373.16±44.43*78.22±50.08*61.11±30.67*11.64±5.26*19.92±11.87*18.66±7.71*MIP-1+PF41369.12±24.66*79.27±30.79*62.33±20.12*15.18±4.94*19.12±7.78*19.30±7.99*空白對(duì)照133

21、3.25±14.43*22.60±7.53*8.10±7.13*4.64±1.63*3.50±3.12*0*     注：*與預(yù)處理前比較，P<0.05；#與空白對(duì)照組比較，P<0.05 表2MIP-1及PF4對(duì)臍血造血祖細(xì)胞集落的影響（/2×106，<"0102 (84 字節(jié))" src="/med/cano/201003/20100316190653634" 11 15>±s）組別樣本數(shù)CFU-GMCFU-MIX7d1

22、4d21d14d21d28d預(yù)處理前1075.30±13.88143.60±42.6081.40±21.5032.10±10.2645.40±11.3036.50±8.00MIP-11048.00±17.45*74.90±25.30*48.60±19.10*16.20±3.52*23.50±3.44*19.80±2.66*PF41042.70±17.45*60.70±18.48?47.20±14.51?17.30±3.27*22.90&

23、#177;5.74*19.40±4.60*MIP-1+PF41047.10±11.94*59.70±20.45*35.00±9.50*16.50±2.95*18.80±3.71*16.90±3.98*空白對(duì)照1024.90±9.40*38.90±10.20*#13.60±5.66?8.50±2.50*9.60±3.06*3.90±1.25*     注：*與預(yù)處理前比較，P<0.05；#與對(duì)照組比較，P<0.05

24、3MIP-1及PF4對(duì)骨髓及臍血CD34+CD38-細(xì)胞含量的影響CD34+CD38-細(xì)胞屬重建長(zhǎng)期造血的早期造血干/祖細(xì)胞，多處于靜止期。由表3可見(jiàn)，骨髓MIP-1、PF4及MIP-1+PF4組的CD34+CD38-細(xì)胞分別為預(yù)處理前的72.96%、70.38%、71.94%，均有顯著下降（P值均<0.05），但三組間差異無(wú)顯著性，且均顯著高于空白對(duì)照（P值均<0.05）。臍血CD34+CD38-細(xì)胞加因子組與處理前比較，差異無(wú)顯著性。表3MIP-1及PF4對(duì)CD34+CD38-細(xì)胞的影響（<"0102 (84 字節(jié))" src="/med/c

25、ano/201003/20100316190653634" 11 15>±s）組別樣本數(shù)骨髓臍血預(yù)處理前100.233±0.0790.550±0.270MIP-1100.177±0.078*0.426±0.210PF4100.164±0.076*0.377±0.123MIP-1+PF4100.169±0.066*0.397±0.127空白對(duì)照100.073±0.013*0.205±0.190*     注：*與預(yù)處理前比較，P&l

26、t;0.05；#與空白對(duì)照組比較，P<0.05 4MIP-1及PF4對(duì)細(xì)胞增殖周期的調(diào)控骨髓及臍血造血細(xì)胞MIP-1、PF4、MIP-1+PF4組的S+G2期細(xì)胞百分率均顯著低于空白對(duì)照組(P均<0.05)，但聯(lián)合組與單因子組比較，差異無(wú)顯著性（表4）。S+G2期細(xì)胞百分率與化療藥處理后細(xì)胞存活率呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（骨髓組r=-0.82，臍血組r=-0.63，P值均<0.01）。HL-60細(xì)胞各組S+G2期細(xì)胞百分率差異無(wú)顯著性，均較骨髓及臍血組高。表明MIP-1、PF4將造血細(xì)胞阻止于靜止期，但不影響HL-60細(xì)胞的增殖。表4MIP-1及PF4對(duì)細(xì)胞增殖周期的調(diào)控（<&

27、quot;0102 (84 字節(jié))" src="/med/cano/201003/20100316190653634" 11 15>±s）組別S+G2期細(xì)胞比率（%）骨髓MNC臍血MNCHL-60細(xì)胞空白對(duì)照24.80±8.1011.84±3.4652.80±26.80MIP-114.08±7.13*6.04±2.70*53.73±27.50PF418.68±8.06*7.88±2.87*55.46±21.10MIP-1+PF414.32±7.93*

28、7.45±3.67*51.03±20.00     注：骨髓、臍血、HL-60細(xì)胞的樣本數(shù)分別為13，10，3；*與空白對(duì)照組比較，P<0.05 5MIP-1及PF4對(duì)骨髓MNC及HL-60細(xì)胞P16、P27蛋白表達(dá)的影響由表5可見(jiàn)，P16、P27在骨髓MNC及HL-60細(xì)胞均有不同程度表達(dá)。骨髓MNC經(jīng)MIP-1處理后P16表達(dá)高于空白對(duì)照組（P<0.05），P27表達(dá)無(wú)顯著改變；經(jīng)PF4處理后，P16、P27表達(dá)均無(wú)顯著改變。HL-60細(xì)胞P16、P27表達(dá)不受表5MIP-1及PF4對(duì)細(xì)胞P16、P27蛋白表達(dá)的影響（

29、<"0102 (84 字節(jié))" src="/med/cano/201003/20100316190653634" 11 15>±s）組別骨髓MNCHL-60細(xì)胞P16P27P16P27空白對(duì)照0.73±0.210.70±0.080.46±0.110.52±0.31MIP-11.02±0.15*0.72±0.090.49±0.230.60±0.22PF40.76±0.120.84±0.160.42±0.170.59±

30、0.17MIP-1+PF41.05±0.16*0.82±0.110.51±0.260.54±0.27     注：骨髓MNC、HL-60細(xì)胞的樣本數(shù)分別為13，3；* 與空白對(duì)照組比較，P<0.05MIP-1、PF4的影響。 討論DNR是細(xì)胞周期特異化療藥，對(duì)增殖期細(xì)胞有較強(qiáng)殺傷力，在臨床化療中呈現(xiàn)嚴(yán)重的骨髓抑制不良反應(yīng)，我們選用DNR作為細(xì)胞毒試劑。結(jié)果顯示，MIP-1和PF4單用或聯(lián)用可明顯提高正常骨髓及臍血造血細(xì)胞對(duì)DNR的耐受性，表現(xiàn)在細(xì)胞存活率及CD34+CD38-細(xì)胞含量、CFU-GM及CFU-M

31、IX產(chǎn)率均較空白對(duì)照組顯著增高，且多數(shù)集落含細(xì)胞數(shù)大于300，維持時(shí)間長(zhǎng)，表明MIP-1和PF4作用于較早期的人造血祖細(xì)胞，使靜止期細(xì)胞增多，免受DNR損傷。這種保護(hù)作用是無(wú)細(xì)胞毒性的、可逆的，不損傷細(xì)胞形成集落的能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MIP-1的保護(hù)作用強(qiáng)于PF4，但統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后，差異無(wú)顯著性(0.05<P<0.1)。聯(lián)合使用MIP-1和PF4，未發(fā)現(xiàn)協(xié)同保護(hù)效應(yīng)。MIP-1和PF4對(duì)人骨髓造血細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)的分子機(jī)制仍未完全明確。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)兩因子阻止細(xì)胞進(jìn)入增殖周期，提高其對(duì)DNR的耐受性。我們分別選用作用點(diǎn)不同的CKI家族成員P16和P27蛋白來(lái)探討MIP-1和PF4保護(hù)效

32、應(yīng)的分子機(jī)制。16及P27主要通過(guò)阻斷細(xì)胞周期中G1/S期的轉(zhuǎn)換，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控4。實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)MIP-1及MIP-1+PF4組骨髓MNC的P16染色系數(shù)分別為1.02±0.15及1.05±0.16，均顯著高于空白對(duì)照組（0.73±0.21）及PF4組(0.76±0.12)；但P27表達(dá)無(wú)明顯變化。首次證實(shí)MIP-1的負(fù)調(diào)控效應(yīng)是通過(guò)上調(diào)P16蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。PF4對(duì)P16、P27的表達(dá)無(wú)明顯作用。Gentilini等5報(bào)告PF4對(duì)正常骨髓造血細(xì)胞的保護(hù)作用與p21基因表達(dá)有關(guān)。以上結(jié)果表明MIP-1和PF4是分別通過(guò)上調(diào)P16、P21表達(dá)，阻抑細(xì)胞進(jìn)入S+G2期，從而表現(xiàn)對(duì)DNR殺傷的保護(hù)作用。同步實(shí)驗(yàn)顯示，不論MIP-1和PF4處理與否，HL-60細(xì)胞S+G2期百分率、經(jīng)DNR處理后細(xì)胞存活率各組間差異均無(wú)