喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞系常規(guī)及高分辨染色體分析

1、喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞系常規(guī)及高分辨染色體分析    喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞系常規(guī)及高分辨染色體分析    中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)2000年第29卷第3期    李福才富偉能康寧孫開(kāi)來(lái)    摘要目的：探討喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞系染色體畸變及其核型特征，認(rèn)識(shí)喉癌的細(xì)胞遺傳學(xué)改變與其發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性。方法：應(yīng)用常規(guī)和高分辨G顯帶方法進(jìn)行核型分析。結(jié)果：Hep-2細(xì)胞系的染色體數(shù)目變化于5484條之間，眾數(shù)為6974條?？勺R(shí)別其結(jié)構(gòu)的

2、穩(wěn)定的標(biāo)記染色體為13條，部分核型中存在雙微體，是基因擴(kuò)增的細(xì)胞遺傳學(xué)標(biāo)志。結(jié)論：喉癌Hep-2細(xì)胞系屬超三倍體細(xì)胞，存在染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)畸變并具有穩(wěn)定的標(biāo)記染色體及基因擴(kuò)增。結(jié)構(gòu)畸變涉及易位、缺失和等臂染色體。染色體斷裂重接導(dǎo)致染色體重排，3、5、6和8號(hào)染色體的缺失與重排是喉癌特征性改變。    關(guān)鍵詞：喉癌細(xì)胞系高分辨G顯帶染色體畸變易位缺失等臂染色體    腫瘤細(xì)胞遺傳學(xué)研究表明，幾乎所有的腫瘤細(xì)胞中都有一定染色體特征性異常，且被認(rèn)為是癌細(xì)胞的特征。研究不同腫瘤細(xì)胞的染色體畸變及核型特征對(duì)認(rèn)識(shí)腫瘤的細(xì)胞遺傳

3、學(xué)改變、探討其發(fā)病機(jī)制有重要意義。我們進(jìn)行了喉癌細(xì)胞系Hep-2的中期和早中期G顯帶染色體分析，以了解喉癌細(xì)胞的核型變化及染色體畸變，為進(jìn)一步探討喉癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、惡變提供細(xì)胞遺傳學(xué)基礎(chǔ)。    1材料與方法    1.1細(xì)胞培養(yǎng)及染色體標(biāo)本制備    人體喉癌細(xì)胞系Hep-2 源于美國(guó)組織采集中心（ATCC），于1996年12月從北京耳鼻喉研究所引入我室。細(xì)胞生長(zhǎng)于含15%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，應(yīng)用培養(yǎng)傳代10代、12代和14代細(xì)胞制備常規(guī)和高分辨染色體。常規(guī)染

4、色體制備：細(xì)胞培養(yǎng)68 h，加入秋水仙素（0.4 g/ml）后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，收集細(xì)胞，經(jīng)低滲(0.075 mol/L KCl)處理后，重復(fù)固定(甲醇冰醋酸=31)3次，制成細(xì)胞懸浮液，將細(xì)胞懸浮液滴于冰冷載玻片，空氣干燥后保存待用。高分辨染色體標(biāo)本制備1：當(dāng)培養(yǎng)18 h細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛時(shí)，加入胸腺嘧啶核苷（0.3 mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)17 h，然后用無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌3次，在繼續(xù)培養(yǎng)5 h之后加入放線菌素D（6g/ml）培養(yǎng)1 h，加入秋水酰胺（0.4 g/ml），15 min后收集細(xì)胞。為使染色體分散良好，采用0.4% kCl和0.4%檸檬酸鈉11混合液低滲處理細(xì)胞1520

5、min，然后用新配制的甲醇-冰醋酸(31)固定液重復(fù)固定3次，制成細(xì)胞懸浮液后滴于冰冷的載玻片上，空氣干燥后保存待用。    1.2染色體顯帶處理及核型分析    將常規(guī)及高分辨染色體標(biāo)本置7080烤箱中24 h，自然冷卻后采用稍加改進(jìn)的Seabright方法進(jìn)行G顯帶處理2。經(jīng)上述方法處理后可獲得圖象清晰，帶紋良好的中期和早中期染色體標(biāo)本。在顯微鏡下選擇分散良好，帶紋清晰的分裂相觀察分析，同時(shí)進(jìn)行顯微攝影，經(jīng)沖洗放大后用照片進(jìn)行核型分析。計(jì)數(shù)80個(gè)核型，分析30個(gè)常規(guī)G顯帶核型，20個(gè)高分辨G顯帶核型。 

6、;   2結(jié)果    喉癌細(xì)胞系Hep-2在培養(yǎng)傳代過(guò)程中仍保持上皮細(xì)胞樣形態(tài)，在含15%小牛血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)分裂較快，細(xì)胞始終呈液胞狀，可能是細(xì)胞活躍的表現(xiàn)(圖1)。常規(guī)和高分辨染色體分析顯示，Hep-2細(xì)胞系的染色體數(shù)目變化于5484條之間，染色體眾數(shù)為6974條。部分核型中存在有雙微體（double minute chromosome，DM）（圖2）。各核型中可識(shí)別其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定標(biāo)記染色體為13條，分別命名為M1M13。有35條難以識(shí)別結(jié)構(gòu)的染色體（u.c）（圖3，圖4）。13條標(biāo)記染色體涉及易位、缺失和等臂染色體，如t

7、(3;5)、t(8;12)、del(6q)、del(8q)和i(5)等。斷裂重接位點(diǎn)詳細(xì)描述列于表1。染色體重排涉及斷裂位點(diǎn)19個(gè)，如3p14.2、8q22.1、8q24.1、10q23.3和10q25.3，分別涉及一種或多種腫瘤，列于表2。        圖1Hep-2細(xì)胞形態(tài)    fig.1The shape of Hep-2 cell        圖2Hep-2細(xì)胞雙微體 &#

8、160;  fig.2The DM of Hep-2 cell line        圖3Hep-2細(xì)胞系常規(guī)G顯帶標(biāo)記染色體, u.c為不能辨認(rèn)的異常染色體    fig.3The routine G-banding marker chromosome of Hep-2 cell line ,u.c. were    abnormal chromosomes which could not be recogniz

9、ed        圖4Hep-2細(xì)胞系高分辨G顯帶標(biāo)記染色體，u.c為不能辨認(rèn)的異常染色體    fig.4The high-resolution G-banding marker chromosomes of Hep-2 cell line,u.c.were    abnormal chromosomes which could not be recognized    表1Hep-2細(xì)胞系標(biāo)

10、記染色體(M1-M13)結(jié)構(gòu)描述    tab.1The structure describe of marker chromosomes(M1-M13) of Hep-2 cell line            標(biāo)記染色體    結(jié)構(gòu)描述            M1 

11、;   t(3;5)(3pter-3p14.2:5p15.1-5qter)            M2    t(3;?)(3pter-3q23:?)            M3    rob(14;15)(14qter-14p11.1:15q11.

12、1-15qter)            M4    del(1)(1pter-1q25.3:)            M5    del(6)(6pter-6q16.3:)         

13、;   M6    t(8;12)(8qter-8q22.1:12q24.3-12pter)            M7    t(6;12)(6pter-6p11.1:12p11.1-12qter)            M8  

14、;  t(10;12)(10pter-10q24.1:12q24.2-12qter)            M9    rob(21;22)(21qter-21p11.1:22p11.1-22qter)            M10    del(3)(3pt

15、er-3q13.1:)            M11    del(8)(8pter-8q24.1:)            M12    i(5)(5qter-cen-5qter)        &

16、#160;   M13    del(4)(4qter-4p11.1:)            表2Hep-2細(xì)胞系標(biāo)記染色體斷裂位點(diǎn)與相關(guān)的腫瘤    tab.2The marker chromosome breakpoints of Hep-2    cell line and relative neoplasms 

17、;           染色體    斷裂位點(diǎn)    所涉及腫瘤            1q25.3    Astcyt,Ca ad,MFH,NHL,Ca sq cell,ALL      

18、      3p14.2    Ca ad,NHL,ALL,AML,Ca sq cell,GCT,Lei,Ca sm cell,Mal mel,Mes            3q23    Ca ad,CLD,NHL          &#

19、160; 3q13.1    Ca ad,CLD            4p11.1    Ca ad,GCT            5q11.1    AML,Ca sq cell,MDS,Ca ad  &#

20、160;         5p15.1    AML,MDS,Ca ad            6p11.1    Ca ad            6q16.3  &#

21、160; ALL,AML,Ca ad,Mal mel,Mes,NHL,Sa ost,CLD            8q22.1    ALL,AML,Ca ad,CLD,MDS,NHL            8q24.l    NHL   

22、         10q24.1    ALL,AML,Astcyt,Ca ad,Ca tr cell,CLD,GCT,Mes,NHL,CLD,Lei            12p11.1    ALL,AML,Ca ad,CLD,CMD,MDS,NHL,Wilm    

23、;        12q24.3            12q24.2    Astcyt,NHL            14p11.1    CLD,GCT,Ca sq cell 

24、0;          15q11.1    AML            21p11.1    Ca sq cell            22p11.1  

25、  AML            3討論喉癌Hep-2細(xì)胞系于1996年12月引入我室，培養(yǎng)傳代過(guò)程中細(xì)胞保持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。染色體數(shù)目分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果與已有的報(bào)道基本一致2。DM是基因擴(kuò)增的細(xì)胞遺傳學(xué)標(biāo)志，如在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)DM是癌基因擴(kuò)增產(chǎn)物3。我們?cè)贖ep-2細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)雙微體的存在，可能是某一基因片段大量擴(kuò)增的結(jié)果。本研究表明，Hep-2細(xì)胞系存在1318個(gè)標(biāo)記染色體，每個(gè)核型中存在35個(gè)常規(guī)和高分辨G顯帶分析都難以辨認(rèn)其結(jié)構(gòu)的異常染色體。

26、可識(shí)別其結(jié)構(gòu)特征的標(biāo)記染色體13條，在各核型中穩(wěn)定存在，這些標(biāo)記染色體包括缺失、易位和等臂染色體等，如M5、M8、M1、M6和M5。13個(gè)標(biāo)記染色體涉及12條染色體參與結(jié)構(gòu)畸變，包括1、3、4、5、6、8、10、12、14、15、21和22號(hào)染色體。其中3和12號(hào)染色體在同一細(xì)胞中參與三次結(jié)構(gòu)重排，5、6和8號(hào)染色體參與兩次結(jié)構(gòu)重排，提示喉癌在發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中有不同染色體參與畸變。Jin4等在短期培養(yǎng)的原發(fā)性喉癌中分別發(fā)現(xiàn)3p缺失和斷裂點(diǎn)為3p25的染色體的易位。韓瑞珠等3研究發(fā)現(xiàn)i（8q）、3p-及6q-為喉癌特征性染色體異常。Allegra等5發(fā)現(xiàn)3p缺失（3p21-p23）。綜合我們對(duì)H

27、ep-2細(xì)胞系的分析，認(rèn)為3、5、6和8號(hào)染色體結(jié)構(gòu)重排是喉癌的特征性改變，與喉癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。13個(gè)標(biāo)記染色體涉及19個(gè)斷裂位點(diǎn)，每個(gè)斷裂位點(diǎn)都涉及一種或幾種其它腫瘤6。某些斷裂位點(diǎn)或附近涉及脆性位點(diǎn)、癌基因和抑癌基因。如10q24.1處斷裂缺失，而10q23.3和10q25.2處是脆性位點(diǎn)3。8q22.1和8q24.1分別為mos和myc癌基因所在部位。3p14.2為FHIT基因所在部位，且認(rèn)為是喉癌的一個(gè)候選抑癌基因7。脆性位點(diǎn)為多種染色體重排提供了條件。染色體易位、缺失涉及癌基因和抑癌基因，其結(jié)構(gòu)和功能的改變可能涉及癌基因激活和抑癌基因缺失或失活6。在Hep-2細(xì)胞系中同時(shí)存在脆性

28、位點(diǎn)、癌基因和抑癌基因，三者存在著密切相關(guān)性，對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和喉癌發(fā)生過(guò)程具有重要生物學(xué)意義。    遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目，972225國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目，39770794李福才（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，沈陽(yáng)110001)    富偉能（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，沈陽(yáng)110001)    康寧（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，沈陽(yáng)110001)    孫開(kāi)來(lái)（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，沈陽(yáng)110001）    參考文獻(xiàn)   &